发酵菌种的制备详解演示文稿
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发酵学生产菌种的培养与保藏 PPT
特点:保藏期较长、效果较好,且微生物移接方便,经济简便。
它比石蜡油封藏法的保藏期长,约1～10年。
5、冷冻干燥法
用保护剂(脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等)制备拟保 藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中,再在低温下快速 将含菌样冻结,并减压抽真空,使水升华将样品脱水干燥,形成 完全干燥的固体菌块。并在真空条件下马上融封,造成无氧 真空环境,最后置于低温下,使微生物处于休眠状态,而得以长 期保藏。
注意事项:
原材料需经过化学分析及摇瓶发酵实验 严格控制灭菌后的培养基质量 使用前应在适当温度下放置一定时间 考虑不同代谢类型的菌落对多种氨基酸的选择
(二)培养温度与湿度
菌体的糖代谢与氮代谢的各种酶类,对温度的敏感性 是不同的,培养温度不同,菌体的生理状态也不同。因此,需 要用最适合孢子生长的温度进行培养。
第二节 种子质量控制
一、影响孢子质量的因素及其控制
培养基、培养温度与湿度、培养时间与接种量。
二、影响种子质量的因素及其控制
孢子质量、培养基、培养条件、种龄与接种量。
一、影响孢子质量的因素及其控制
培养基
影响孢子质量
的因素
及控制 培养条件
接种量
(一)培养基
影响因素:原材料;琼脂的牌号不同;水质的影响
(二) 培养条件
(1)温度 (2)通气量: 在种子罐中培养的种子除保证供给易
被利用的培养基外,有足够的通气量能够提高种子 质量。
➢ 例如,青霉素的生产菌种在制备过程中将通气充足与不足 两种情况下得到的种子分别接入发酵罐内,它们的发酵单 位可相差1倍。
➢ 但也有例外,例如土霉素生产菌,一级种子罐的通气量小对 发酵有利。
A ❖ 冷泉港研究室,美国。 ❖ (3) IAM (Institute of Applied
它比石蜡油封藏法的保藏期长,约1～10年。
5、冷冻干燥法
用保护剂(脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等)制备拟保 藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中,再在低温下快速 将含菌样冻结,并减压抽真空,使水升华将样品脱水干燥,形成 完全干燥的固体菌块。并在真空条件下马上融封,造成无氧 真空环境,最后置于低温下,使微生物处于休眠状态,而得以长 期保藏。
注意事项:
原材料需经过化学分析及摇瓶发酵实验 严格控制灭菌后的培养基质量 使用前应在适当温度下放置一定时间 考虑不同代谢类型的菌落对多种氨基酸的选择
(二)培养温度与湿度
菌体的糖代谢与氮代谢的各种酶类,对温度的敏感性 是不同的,培养温度不同,菌体的生理状态也不同。因此,需 要用最适合孢子生长的温度进行培养。
第二节 种子质量控制
一、影响孢子质量的因素及其控制
培养基、培养温度与湿度、培养时间与接种量。
二、影响种子质量的因素及其控制
孢子质量、培养基、培养条件、种龄与接种量。
一、影响孢子质量的因素及其控制
培养基
影响孢子质量
的因素
及控制 培养条件
接种量
(一)培养基
影响因素:原材料;琼脂的牌号不同;水质的影响
(二) 培养条件
(1)温度 (2)通气量: 在种子罐中培养的种子除保证供给易
被利用的培养基外,有足够的通气量能够提高种子 质量。
➢ 例如,青霉素的生产菌种在制备过程中将通气充足与不足 两种情况下得到的种子分别接入发酵罐内,它们的发酵单 位可相差1倍。
➢ 但也有例外,例如土霉素生产菌,一级种子罐的通气量小对 发酵有利。
A ❖ 冷泉港研究室,美国。 ❖ (3) IAM (Institute of Applied
青霉素发酵生产工艺演示文稿
菌种
青霉素最初生产菌为音符型青霉菌，生产 能力仅为几十个单位，不能满足工业生产 需要。后来发现适合深层培养的新菌种— —产黄青霉，生产能力100U/ml，经不断 诱变选育，目前平均生产能力6600070000U/ml，国际最高生产能力已超 100000U/ml。
青霉素产生菌的生长过程
分生孢子发芽期
6
5
HH
7
O
N1
4
S CH3 3 CH3
2
COOH H
2S， 5R， 6R
β-内酰胺环对水、光、热、酸、碱、酶、
醇、胺不稳定，β-环开裂、活性降低或消失
对碱或酶(β-内酰胺酶)不稳定，水解
对稀酸不稳定，发生重排；
PH=4
青霉二酸
-CO2
青霉醛 青霉胺
H+
NH S
pH=4.0
O
H
O
H
N
O H H+
OaH
OH
H+ or HgCl2
-CO2
NH O
Penilloaldehyde
CHO
NH S
O
H
N PenilloicAcid HH
a
Hale Waihona Puke +O OH
NH b
O CHO
HOOC
Penaldic Acd
β-环开裂,-CO2
青霉素的理化性质
➢ 青霉素本身为一元有机酸，可与钾、钠、镁、钙、铝和铵等化合成盐类。 ➢ 青霉素游离酸易溶于醇、酸、醚、酯等一般有机溶剂，但在碳氢化合物
• 溶血性链球菌感染。 • 肺炎链球菌感染。 • 不产青霉素酶葡萄球菌感染。 • 炭疽。 • 破伤风、气性球疽等梭状芽孢杆菌感 • 钩端螺旋体病。 • 流行性脑脊髓膜炎。 • 放线菌病。 • 淋病。 • 除脆弱拟杆菌以外的许多厌氧菌感染。 • 青霉素与氨基糖苷灯药物联合用于治疗草绿色链球菌心内
发酵流程PPT课件
第5页/共21页
⑴根据不同的菌种，应选择不同的材料配制 培养基。配制的培养基应满足微生物在碳源、 氮源、生长因子、水、无机盐等方面的营养 要求，并为微生物提供适宜的pH。
⑵培养基的营养要协调，以利于产物的合成。
⑶培养基在满足微生物的营养需求的基础上应 尽量降低生产成本，以得到更高的经济效益。
例如：发酵生产常采用天然成分的液体培养 基。而且，经常用野生的植物淀粉、甘蔗渣、 秸秆水解物以及乙醇、醋酸等石化产品代替 粮食来配制培养基。
影响发酵过程的因素
（1）温度 温度能影响酶的活性，也能影响生物合成的途径。温度 还会影响发酵液的物理性质，以及菌种对营养物质的分解吸收 等。
（2）pH pH能够影响酶的活性，以及细胞膜的带电荷状况。还会影 响培养基中营养物质的分解等
（3）溶解氧 在发酵过程中菌种只能利用溶解氧。因此，必须向发 酵液中连续补充大量的氧，并要不断地进行搅拌，以提高氧在 发酵液中的溶解度。
发酵过程
将菌体接种到装有培养液的发酵罐中，是 不是发酵生产就能顺利地进行呢？
还需要对发酵过程进行检测和对发酵条件进行
控制。这又是为什么呢？
发酵产物主要在菌体生长的稳定期产生。 因此，要在发酵过程中随时取样检测培养液 中细菌数目、产物浓度以了解发酵进程，及 时添加必需的培养基成分来延长菌体生长稳 定期的时间，以得到更多的发酵产物。同时， 还应对发酵条件进行严格控制。
人们怎样才能得到优良的菌种呢？
基因突变、基因工程、细胞工程
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如果生产的是微生物直接合成的产物，如青霉素、 谷氨酸等，则可以从自然界中先分离出相应的菌种， 再用物理或化学的方法使菌种产生突变，从突变个 体中筛选出符合生产要求的优良菌种。
如果生产的是一般微生物不能合成的产品，则可用
⑴根据不同的菌种，应选择不同的材料配制 培养基。配制的培养基应满足微生物在碳源、 氮源、生长因子、水、无机盐等方面的营养 要求，并为微生物提供适宜的pH。
⑵培养基的营养要协调，以利于产物的合成。
⑶培养基在满足微生物的营养需求的基础上应 尽量降低生产成本，以得到更高的经济效益。
例如：发酵生产常采用天然成分的液体培养 基。而且，经常用野生的植物淀粉、甘蔗渣、 秸秆水解物以及乙醇、醋酸等石化产品代替 粮食来配制培养基。
影响发酵过程的因素
（1）温度 温度能影响酶的活性，也能影响生物合成的途径。温度 还会影响发酵液的物理性质，以及菌种对营养物质的分解吸收 等。
（2）pH pH能够影响酶的活性，以及细胞膜的带电荷状况。还会影 响培养基中营养物质的分解等
（3）溶解氧 在发酵过程中菌种只能利用溶解氧。因此，必须向发 酵液中连续补充大量的氧，并要不断地进行搅拌，以提高氧在 发酵液中的溶解度。
发酵过程
将菌体接种到装有培养液的发酵罐中，是 不是发酵生产就能顺利地进行呢？
还需要对发酵过程进行检测和对发酵条件进行
控制。这又是为什么呢？
发酵产物主要在菌体生长的稳定期产生。 因此，要在发酵过程中随时取样检测培养液 中细菌数目、产物浓度以了解发酵进程，及 时添加必需的培养基成分来延长菌体生长稳 定期的时间，以得到更多的发酵产物。同时， 还应对发酵条件进行严格控制。
人们怎样才能得到优良的菌种呢？
基因突变、基因工程、细胞工程
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如果生产的是微生物直接合成的产物，如青霉素、 谷氨酸等，则可以从自然界中先分离出相应的菌种， 再用物理或化学的方法使菌种产生突变，从突变个 体中筛选出符合生产要求的优良菌种。
如果生产的是一般微生物不能合成的产品，则可用
发酵工程中的菌种ppt课件
（四）基因工程菌的稳定性
分裂不稳定：分裂时，出现一定比例不含质粒的子代菌； 结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失、碱基重排或缺失。 1.产生原因：（常见是分裂不稳定） ①产不含质粒的子代菌的频率； ②两种菌的比生长速率。
质粒拷贝数低时，可增加，但不宜太高（生长负势 ）。 条件有利，高比生长速率，拷贝数降低，但更稳定。 质粒拷贝数过高，增加转录、翻译负担，产物未必增加。
2019 15
３、霉菌的杂交育种
准性生殖过程：不通过有性生殖的基因重组过程． 异核体的形成：两不同性状细胞（菌丝）连接，导致一 细胞存在两个不同遗传型核。 杂合二倍体形成；异核体偶尔发生不同核的融合，形成 杂合核，为双倍体。 菌丝成斑点、扇面——扇变。 体细胞重组：杂合二倍体只具有相对稳定性，繁殖过程 发生染色体交换，单倍化，形成各种分 离子。 准性生殖的单倍体化是一个渐变过程，需要多次分 裂，形成双倍体、非整倍体、单倍体等分离子。
第四章 微生物优良菌种的选育
2019
-
1
微生物发酵的一般流程
培养基配制 种子扩大培养 空气除菌 发酵设备
培养基灭菌
发酵生产
下游处理
2019 2
提纲
微生物优良生产菌种的特征 自然突变选育 诱变选育
原理 基本方法 放线菌 霉菌 酵母菌
杂交育种
细菌
原生质体融合 基因工程技术
基因表达系统 利用大肠杆菌的基因表达系统 利用酵母菌的基因表达系统 基因工程菌的稳定性
２.原生质体融合法：
原生质体制备 原生质体融合和再生 融合子的检出
３.原生质体融合技术在微生物育种中的应用：
选育高产优质菌株 产生新的产物
2019
-
19
五、基因工程育种
发酵菌种的制备
发酵工程
第一章
第二章 第三章
发酵工程总论
发酵设备 发酵工业原料及其处理
发 酵 工 程
第四章
第五章 第六章 第七章 第八章 第九章 第十章 第十一章
发酵工业灭菌
发酵菌种的制备 发酵工业放大 微生物发酵机制 发酵动力学 发酵过程工艺控制 发酵染菌及防治 发酵工业废物、废水处理和资源化技术
第十二章 展望
发酵工程
已工业化产品生产菌的介绍
三、常用的基因表达系统
(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌 沙门氏菌
生长迅速、蛋白产量高; 表达蛋白的纯化、分离及分析快速； 外源基因的导入相对容易； 已建立了整套表达理论及技术。
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
三、食品酶制剂生产有关的微生物
开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。 关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意 使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。 α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆 菌和地衣牙孢杆菌
1.3 工业生产常用的微生物菌种
1.4 工业微生物菌种的分离
一、菌种分离的一般过程 样品采集
→
预处理 → 增殖培养 → 纯培养
→ 菌种的鉴定 → 生产性能测定 目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物
复合酶系
问题：如何使样品中所含微生物的可能性大 如何在后续的操作中使这种可能性实现 复合菌系
1.4 工业微生物菌种的分离
二、采样时要注意的问题
1.6 菌种的退化与保藏
1 发酵工业微生物菌种的选育
1.1 工业微生物的特点
第一章
第二章 第三章
发酵工程总论
发酵设备 发酵工业原料及其处理
发 酵 工 程
第四章
第五章 第六章 第七章 第八章 第九章 第十章 第十一章
发酵工业灭菌
发酵菌种的制备 发酵工业放大 微生物发酵机制 发酵动力学 发酵过程工艺控制 发酵染菌及防治 发酵工业废物、废水处理和资源化技术
第十二章 展望
发酵工程
已工业化产品生产菌的介绍
三、常用的基因表达系统
(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌 沙门氏菌
生长迅速、蛋白产量高; 表达蛋白的纯化、分离及分析快速； 外源基因的导入相对容易； 已建立了整套表达理论及技术。
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
三、食品酶制剂生产有关的微生物
开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。 关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意 使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。 α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆 菌和地衣牙孢杆菌
1.3 工业生产常用的微生物菌种
1.4 工业微生物菌种的分离
一、菌种分离的一般过程 样品采集
→
预处理 → 增殖培养 → 纯培养
→ 菌种的鉴定 → 生产性能测定 目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物
复合酶系
问题：如何使样品中所含微生物的可能性大 如何在后续的操作中使这种可能性实现 复合菌系
1.4 工业微生物菌种的分离
二、采样时要注意的问题
1.6 菌种的退化与保藏
1 发酵工业微生物菌种的选育
1.1 工业微生物的特点
工业发酵菌种选育PPT课件
.
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实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）
文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌
采样（造纸厂） →80℃处理30分钟 ↓
0.0075%曲利本蓝＋1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5 培养3～4天，选择有凹陷圈的菌落
从285个土样中获得62株
26株为组成型 36株为诱导型
微生物次级代谢，其目的产物的生物合成途径取决于 微生物的培养条件和菌种的特异性。
什么叫分叉中间体？
问题
次生代谢产物主要在哪个时期合成？次生代
谢产物生成与初生代谢产物有关吗？
.
4
三、工业上常用的微生物
微生物在工业上的用途很广，包括化工、医药、 食品、水产、国防、纺织、石油勘探及石油化工 等方面。
应用：各类抗生素。土霉素、四环素、链霉素、 红霉素
菌气 丝生
孢
子
丝
孢子
培养基
基内菌丝
.
15
第二节、生产菌种的选育
一、选育的目的 改善菌种的特性，使产量提高，改进质量、降低
成本、改革工艺、方便管理及综合利用等。
二、菌种选 育方法
自然选育
诱变育种 代谢调控育种
基因定向育种：基因工程，杂 交，细胞工程(原生质体融合）
.
10
米曲霉
应用：产糖化酶和蛋白酶、 主要用于酿酒制曲和酱油制 曲
应用：生产甲义丁二酸
.
11
毛霉
应用：可以产生蛋白酶，我国多 用于豆腐乳、豆豉等的制作
.
12
根霉
种类：米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根霉 应用：酿酒
.
13
青霉菌
应用：生产青霉素、葡萄糖氧
微生物工程(发酵)第二章-菌种制备原理与技术 ppt课件
ppt课件
/jpkc 17
2.1.5 适应性进化（菌株驯化）
• Adaptive evolution 通过人工措施使微生物逐 步适应某一条件，而定向选育微生物的方 法； • （柠檬酸）
ppt课件
18
2.1.6 菌种的保藏
• 保藏、退化、复壮
ppt课件
ppt课件 10
微生物的分离
• 稀释涂布法 • 划线法；
ppt课件
11
生化反应法；
高温下培养： 分离嗜热细菌； 培养基中不含N： 分离固氮菌； 培养基加抗生素： 分离抗性菌；
ppt课件
12
组织分离法
ppt课件
13
• 合理的筛选策略是关键！
ppt课件
14
氨基酸产生菌的筛选
样品
分离
ppt课件
35
• 原生质体再生（细胞壁） • 双层平板上，半固体培养基中；
ppt课件
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2.3.3 微生物原生质体诱变育种
原生质体技术＋诱变育种技术 • 出发菌株的选择 • 菌体的活化 • 原生质体的制备 • 诱变育种 • 原生质体再生 • 菌株的分离 • 筛选
ppt课件 37
2.3.4 微生物原生质体转化技术
ppt课件
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2.3.6 基因组该组育种
• 在微生物全基因组改造中快速进行特定群 体的基因交换重组，从而增加群体遗传多 样性，改良群体中个体性能等的连续遗传 改变及表型选择过程； • 人工诱变+原生质体融合
ppt课件
42
2.4 微生物的基因工程育种
• 2.4.1 基因工程育种是指重组对象的目的基 因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞， 构建成工程菌（细胞），实现遗传物质的 重新组合，并使得目的基因在工程菌内进 行复制和表达的技术；
发酵工业微生物菌种制备原理和技术PPT课件
菌株分离、筛选虽为两个环节，但却不能绝然分开，因为分离中的一些措施 本身就具有筛选作用。工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一是从 自然界分离所需要的菌株，二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代 谢产物鉴别。
第5页，共150页。
3、分离思路
新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、 菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要 的菌种挑选出来。
为提高分离筛选效率，多采用固体平板的变色圈法，以吐温为底 物，尼罗蓝（Nile blue）作为指示剂，根据变色圈大小来判断脂
肪酶活性的高低；也可用甘油三丁酸酯为底物，罗丹明B为指示剂， 以荧光圈的大小来测定。
第26页，共150页。
（3）生长圈法产生 菌。
（2）变色圈法
对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中 加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。 如：
果胶酶产生菌的分离
筛选果胶酶产生菌时，用含0.2%果胶为惟一碳源的培养基 平板，对含微生物样品进行分离，待菌落长成后，加入 0.2%刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围
第11页，共150页。
（2） 根据微生物生理特点采样
A、根据微生物营养类型（局部环境） 每种微生物对碳\氮源的需求不一样，分布也有差异。研 究表明，微生物的营养需求和代谢类型与其生长环境有 着很大的相关性。如：
纤维素酶产生菌：森林土；
蛋白酶和脂肪酶的产生菌：肉类加工厂附近和饭店排 水沟的污水、污泥中；
100ml 1/100
9ml 9ml 9ml 1/1000 10-4 10-5
第19页，共150页。
9ml 10-6
9ml 10-7
9ml 10-8
稀释平皿分离法
第5页，共150页。
3、分离思路
新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、 菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要 的菌种挑选出来。
为提高分离筛选效率，多采用固体平板的变色圈法，以吐温为底 物，尼罗蓝（Nile blue）作为指示剂，根据变色圈大小来判断脂
肪酶活性的高低；也可用甘油三丁酸酯为底物，罗丹明B为指示剂， 以荧光圈的大小来测定。
第26页，共150页。
（3）生长圈法产生 菌。
（2）变色圈法
对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中 加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。 如：
果胶酶产生菌的分离
筛选果胶酶产生菌时，用含0.2%果胶为惟一碳源的培养基 平板，对含微生物样品进行分离，待菌落长成后，加入 0.2%刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围
第11页，共150页。
（2） 根据微生物生理特点采样
A、根据微生物营养类型（局部环境） 每种微生物对碳\氮源的需求不一样，分布也有差异。研 究表明，微生物的营养需求和代谢类型与其生长环境有 着很大的相关性。如：
纤维素酶产生菌：森林土；
蛋白酶和脂肪酶的产生菌：肉类加工厂附近和饭店排 水沟的污水、污泥中；
100ml 1/100
9ml 9ml 9ml 1/1000 10-4 10-5
第19页，共150页。
9ml 10-6
9ml 10-7
9ml 10-8
稀释平皿分离法
发酵工业菌种PPT课件
随机分离方法
(用筛选方案- 检测系统进行间接分离）
富集液体培养 固体培养基条件培养 (初筛)
菌种纯化
复筛
菌种纯化
初步工艺条件摸索
再复筛 生产性能测试
较优菌株1-3株
保藏及进一步做生产试验 或作为育种的出发菌株
某些必要试验和 毒性试验等
含微生物样品的采集
采样时应注意的问题: 土壤微生物的分布 采土深度 土壤植被情况 采样季节 土壤的酸碱度
.
1
本章内容
一、发酵工业菌种筛选的原则与基本技术 二、发酵工业菌种改良
.
2
一、发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术
（一）发酵工业菌种筛选的总趋势与要求 （二）分离筛选原理与技术 （三）应用举例
.
3
1. 菌种选择的总趋势
野生菌→变异菌 自然选育→代谢控制育种 诱发基因突变→基因重组的定向育种
金黄色葡萄球菌209p 枯草杆菌6633 大肠杆菌 耻垢分枝杆菌607 白色念珠菌 青霉菌
代表微生物类型
革兰氏阳性球菌 革兰氏阳性杆菌 革兰氏阴性肠道细菌
结核杆菌 酵母状真菌 丝状真菌
药理活性化合物产生菌的筛选
药理活性化合物是指能抑制人类代谢中某一 个关键酶的微生物产物即酶抑制剂，从而达到 治疗的目的。
筛选模型：目标酶
.
26
生长因子产生菌的筛选
筛选模型：营养缺陷型试验菌 筛选方法：利用被分离的微生物产物能否促进
营养缺陷型试验菌生长
.
27
氨基酸产生菌的筛选
样品
预处理
初筛（除真菌）
在分离平板上生长获得多个单菌落 复印平板（copy 法）
平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸 u.v线杀死长好的菌落
5第五章生产菌种的制备与保藏
第六章 发酵工业生产菌种的制备
1
本章内容 第一节 孢子制备过程与质量控制 第二节 种子制备过程与质量控制 第三节 菌种保藏与复壮
2
发酵工程最重要的就是菌种，发酵水平的高低与菌 种的性能、质量、数量有直接关系。
目前工业规模的发酵罐容积已达到几百立方米甚至 上千立方米，如按5~10%接种量计算，就要投入几 十立方米或几百立方米的种子，种子液还要有一定 的菌浓和其它质量要求。
如土霉素生产菌种龟裂链霉菌在高于37˚C培养时，孢子 接入发酵罐后出现糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝 过早自溶，效价降低等现象。因此，龟菌斜面先在 36.5℃培养3天，再在28.5℃培养1天，所得的孢子数量比 在36.5℃培养4天所得的孢子数量增加3～7倍。
对菌种生产能力的影响：菌体的糖代谢和氮代谢的各 种酶类，对温度的敏感性是不同的。因此，培养温度 不同，菌的生理状态也不同，如果不是用最适温度培 养的孢子，其生产能力就会下降。
培养温度一般为25~28˚C，培养时间一般为4~14天。
产黄青霉菌的种子制备
斜面母瓶
丝状菌
冻干管 菌 砂土管 种
制成菌悬液 亲米
生产米
种子罐 球状菌
米孢子：将霉菌或放线菌接种到灭菌后的大米或小 米颗粒上，恒温培养一段时间后产生的分生孢子。 12
斜面孢子 培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等；
14
对于不产孢子霉菌 赤霉素生产菌（Gibberelline fujikuroi），也可用大 米固体培养基在茄子瓶中培养菌丝体，用作种子罐 种子。
15
3、细菌繁殖体的制备
产芽孢的细菌用斜面或砂土管保存其芽孢，对于 不产芽孢的细菌，一般采用斜面保藏营养细胞， 在斜面培养基或者摇瓶液体培养基上活化，然后 作种子罐种子。
1
本章内容 第一节 孢子制备过程与质量控制 第二节 种子制备过程与质量控制 第三节 菌种保藏与复壮
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发酵工程最重要的就是菌种，发酵水平的高低与菌 种的性能、质量、数量有直接关系。
目前工业规模的发酵罐容积已达到几百立方米甚至 上千立方米，如按5~10%接种量计算，就要投入几 十立方米或几百立方米的种子，种子液还要有一定 的菌浓和其它质量要求。
如土霉素生产菌种龟裂链霉菌在高于37˚C培养时，孢子 接入发酵罐后出现糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝 过早自溶，效价降低等现象。因此，龟菌斜面先在 36.5℃培养3天，再在28.5℃培养1天，所得的孢子数量比 在36.5℃培养4天所得的孢子数量增加3～7倍。
对菌种生产能力的影响：菌体的糖代谢和氮代谢的各 种酶类，对温度的敏感性是不同的。因此，培养温度 不同，菌的生理状态也不同，如果不是用最适温度培 养的孢子，其生产能力就会下降。
培养温度一般为25~28˚C，培养时间一般为4~14天。
产黄青霉菌的种子制备
斜面母瓶
丝状菌
冻干管 菌 砂土管 种
制成菌悬液 亲米
生产米
种子罐 球状菌
米孢子：将霉菌或放线菌接种到灭菌后的大米或小 米颗粒上，恒温培养一段时间后产生的分生孢子。 12
斜面孢子 培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等；
14
对于不产孢子霉菌 赤霉素生产菌（Gibberelline fujikuroi），也可用大 米固体培养基在茄子瓶中培养菌丝体，用作种子罐 种子。
15
3、细菌繁殖体的制备
产芽孢的细菌用斜面或砂土管保存其芽孢，对于 不产芽孢的细菌，一般采用斜面保藏营养细胞， 在斜面培养基或者摇瓶液体培养基上活化，然后 作种子罐种子。
菌种制备工艺流程图
菌种制备工艺菌种的分离纯化1、初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。
将原菌种制备成菌悬液或单孢子悬液，梯度稀释，涂布分离平板，28±0.5℃培养6-8天，成熟后挑单菌落传F1斜面，F1斜面成熟后传F2斜面，同时转接种子瓶、发酵瓶进行初筛。
F2斜面成熟后转接种子瓶、发酵瓶进行复筛。
具体的工艺过程如下：⑴、菌悬液或单孢子悬液制备——将菌种震荡均匀或使用玻璃珠打散，梯度稀释至合适的浓度，该浓度要保证涂布平板后能够分离出单菌落，通常稀释至10-7。
菌种的来源通常有：高单位罐批的发酵液、保存的用于生产的冻存管菌种等。
⑵、分离平板的涂布与培养——将梯度稀释的菌悬涂布到分离平板上培养，培养温度：28±0.5℃，相对湿度40%—45%，通常培养6～8天即可生长出合适的单菌落，培养时第一天正置平板，第二天起倒置培养。
⑶、F1斜面的培养——在分离平板上选取合格的单菌落接种到F1斜面上，合格单菌落的特点为：菌落直径4～6mm、圆形、边缘不光滑、中间有白色小突起，不规则皱褶、扁平、产生孢子。
F1斜面的培养温度：28±0.5℃，湿度40%—60%，通常培养6—8天即成熟。
成熟的斜面特征为菌苔微厚而丰满，分布有白色孢子，表面呈鼠灰色，背面呈黑色。
⑷、F2斜面的培养——选取生长良好、无杂菌的成熟F1斜面，使用接种针转接到F2斜面，F2斜面的培养温度：28±0.5℃，湿度40%—60%，通常培养6—8天即成熟。
⑸、初筛—— F2斜面接种的同时，使用接种铲刮取约0.5—1cm2的菌苔至种子瓶，种子瓶在28℃的摇床上培养22—24h，然后按照8%—10%的接种量移种至发酵瓶中，发酵瓶在28℃的摇床上培养（240rpm）至200h放瓶，依据发酵瓶的放瓶效价初选出合适的F1斜面，通常选取发酵单位高于3500u/ml的F1斜面。
2、复筛复筛是精选，以质为主，也就是以精确度为主。
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具有准确的转录后修饰功能； 具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化； 具有重组基因的高效扩增和表达能力； 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长； CHO很少分泌自身的内源蛋白。
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
问题： 生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。
1.2 发酵工业对菌种的要求
1) 能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，并生成所需要的代谢产物，且 产量高； 2）培养条件易于控制； 3）生长速度快，发酵周期短； 4）满足代谢控制的要求； 5）抗噬菌体和杂菌的能力强； 6）遗传性状稳定，菌种不易变异退化； 7）在发酵过程中产生的气泡要少，这对提高装料系数、提高单罐产量、 降低成本有重要意义； 8）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体作为一般碳 源利用； 9）不是病原菌，同时在系统发育上与病原菌无关，不产生任何有害的生 物活性物质和毒素，以保证安全。
1 发酵工业微生物菌种的选育
1.1 工业微生物的特点
一个现代化的发酵工业必须具有优良的菌种、 合适的工艺和先进的设备、严格的检测与控制，其 中菌种是主体,其他则是为了充分发挥菌种的优良 性能而考虑和设计的。
能用于发酵生产的微生物即为工业微生物，它 们具有个体小、种类多、繁殖快、分布广、代谢能 力强、易变异改造等特点。
等一切能提高目的微生物相对生长速度 的手段，培养（固体、液体；分批、连 续）后使目的微生物在种群中占优势。
1.3 工业生产常用的微生物菌种
地球上的微生物资源非常丰富， 目前已发现的仅占其总数的1%~5%， 而在工业生产中被利用的仅有数百种， 分属于细菌、酵母菌、霉菌、放线菌、 担子菌、藻类。
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
一、抗生素生产有关的微生物
抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢， 目前发现的生物来源如下：
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
(二) 真核细胞表达系统
➢ 酵母(既是微生物又是真核细胞)
生长迅速，营养要求不高，易培养； 安全性好； 比哺乳动物细胞操作简单； 具有一定的修饰蛋白的能力。
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
➢ 中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统
α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆 菌和地衣牙孢杆菌
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
三、常用的基因表达系统
(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌 沙门氏菌
生长迅速、蛋白产量高; 表达蛋白的纯化、分离及分析快速； 外源基因的导入相对容易； 已建立了整套表达理论及技术。
发酵菌种的制备详解演示文稿
优选发酵菌种的制备
第五章 发酵菌种的制备
1 发酵工业微生物菌种的选育 2 工业微生物种子的扩大培养 3 种子培养基及其制备
http://211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm
第五章 发酵菌种的制备
1 发酵工业微生物菌种的选育
1.1 工业微生物的特点 1.2 发酵工业对菌种的要求 1.3 工业生产常用的微生物菌种 1.4 工业微生物菌种的分离 1.5 发酵高产菌种的选育 1.6 菌种的退化与保藏
放线菌（链霉素 四环素；红霉素 等）
真菌（青霉素、头孢等） 一些产芽孢的细菌
植物或动物来源
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
二、氨基酸生产有关的微生物
20世纪50-60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发 酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：
代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生 物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地 称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。
其他氨基酸生产菌： 常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌 选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯 草芽孢杆菌
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
三、食品酶制剂生产有关的微生物
开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。 关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意 使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。
如何在后续的复操合作中菌使系这种可能性实现
1.4 工业微生物菌种的分离
二、采样时要注意的问题
气候、水分、空气 来源要广 结合产品的特点 标签：地点、时间、气候等
1.4 工业微生物菌种的分离
三、目的微生物富集的一些基本方法
➢富集的目的： 让目的微生物在种群中占优势，使筛选变 得可能。
➢富集的三种方案： 定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的 条件，进行培养。 当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑， 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法
例：
礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微 生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。
1.4 工业微生物菌种的分离
一、菌种分离的一般过程
样品采集 → 预处理 → 增殖培养 → 纯培养 → 菌种的鉴定 → 生产性能测定
目的：高效地获取株高产目的产物的微生物
复合酶系
问题：如何使样品中所含微生物的可能性大
1.4 工业微生物菌种的分离
三、目的微生物富集的一些基本方法
定向培养的方法
物理方法：加热、膜过滤等， 但主要是通过培养的方法
http://211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm
三、目的微生物富集的一些基本方法 定向培养的富集方法
1、底物 3、培养时间
2、pH条件 4、培养温度
1.3 工业生产常用的微生物菌种
二、氨基酸生产有关的微生物
AK:天冬氨酸激酶 HD:高丝氨酸脱氢酶 HT:高丝氨酸转乙酰酶
黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸 的合成调节机制
1.3 工业生产常用的微生物菌种
二、氨基酸生产有关的微生物
氨基酸生产菌的要求： 代谢途径比较清楚，简单
谷氨酸发酵的菌种： 棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小 杆菌属的棒型细菌
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
问题： 生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。
1.2 发酵工业对菌种的要求
1) 能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，并生成所需要的代谢产物，且 产量高； 2）培养条件易于控制； 3）生长速度快，发酵周期短； 4）满足代谢控制的要求； 5）抗噬菌体和杂菌的能力强； 6）遗传性状稳定，菌种不易变异退化； 7）在发酵过程中产生的气泡要少，这对提高装料系数、提高单罐产量、 降低成本有重要意义； 8）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体作为一般碳 源利用； 9）不是病原菌，同时在系统发育上与病原菌无关，不产生任何有害的生 物活性物质和毒素，以保证安全。
1 发酵工业微生物菌种的选育
1.1 工业微生物的特点
一个现代化的发酵工业必须具有优良的菌种、 合适的工艺和先进的设备、严格的检测与控制，其 中菌种是主体,其他则是为了充分发挥菌种的优良 性能而考虑和设计的。
能用于发酵生产的微生物即为工业微生物，它 们具有个体小、种类多、繁殖快、分布广、代谢能 力强、易变异改造等特点。
等一切能提高目的微生物相对生长速度 的手段，培养（固体、液体；分批、连 续）后使目的微生物在种群中占优势。
1.3 工业生产常用的微生物菌种
地球上的微生物资源非常丰富， 目前已发现的仅占其总数的1%~5%， 而在工业生产中被利用的仅有数百种， 分属于细菌、酵母菌、霉菌、放线菌、 担子菌、藻类。
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
一、抗生素生产有关的微生物
抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢， 目前发现的生物来源如下：
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
(二) 真核细胞表达系统
➢ 酵母(既是微生物又是真核细胞)
生长迅速，营养要求不高，易培养； 安全性好； 比哺乳动物细胞操作简单； 具有一定的修饰蛋白的能力。
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
➢ 中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统
α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆 菌和地衣牙孢杆菌
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
三、常用的基因表达系统
(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌 沙门氏菌
生长迅速、蛋白产量高; 表达蛋白的纯化、分离及分析快速； 外源基因的导入相对容易； 已建立了整套表达理论及技术。
发酵菌种的制备详解演示文稿
优选发酵菌种的制备
第五章 发酵菌种的制备
1 发酵工业微生物菌种的选育 2 工业微生物种子的扩大培养 3 种子培养基及其制备
http://211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm
第五章 发酵菌种的制备
1 发酵工业微生物菌种的选育
1.1 工业微生物的特点 1.2 发酵工业对菌种的要求 1.3 工业生产常用的微生物菌种 1.4 工业微生物菌种的分离 1.5 发酵高产菌种的选育 1.6 菌种的退化与保藏
放线菌（链霉素 四环素；红霉素 等）
真菌（青霉素、头孢等） 一些产芽孢的细菌
植物或动物来源
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
二、氨基酸生产有关的微生物
20世纪50-60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发 酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：
代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生 物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地 称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。
其他氨基酸生产菌： 常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌 选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯 草芽孢杆菌
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
三、食品酶制剂生产有关的微生物
开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。 关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意 使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。
如何在后续的复操合作中菌使系这种可能性实现
1.4 工业微生物菌种的分离
二、采样时要注意的问题
气候、水分、空气 来源要广 结合产品的特点 标签：地点、时间、气候等
1.4 工业微生物菌种的分离
三、目的微生物富集的一些基本方法
➢富集的目的： 让目的微生物在种群中占优势，使筛选变 得可能。
➢富集的三种方案： 定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的 条件，进行培养。 当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑， 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法
例：
礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微 生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。
1.4 工业微生物菌种的分离
一、菌种分离的一般过程
样品采集 → 预处理 → 增殖培养 → 纯培养 → 菌种的鉴定 → 生产性能测定
目的：高效地获取株高产目的产物的微生物
复合酶系
问题：如何使样品中所含微生物的可能性大
1.4 工业微生物菌种的分离
三、目的微生物富集的一些基本方法
定向培养的方法
物理方法：加热、膜过滤等， 但主要是通过培养的方法
http://211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm
三、目的微生物富集的一些基本方法 定向培养的富集方法
1、底物 3、培养时间
2、pH条件 4、培养温度
1.3 工业生产常用的微生物菌种
二、氨基酸生产有关的微生物
AK:天冬氨酸激酶 HD:高丝氨酸脱氢酶 HT:高丝氨酸转乙酰酶
黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸 的合成调节机制
1.3 工业生产常用的微生物菌种
二、氨基酸生产有关的微生物
氨基酸生产菌的要求： 代谢途径比较清楚，简单
谷氨酸发酵的菌种： 棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小 杆菌属的棒型细菌