沈阳药科大学生物化学课件——第3章 酶

k1 k2 k3
E+S
ES
E+P
中间产物
目录
※1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底
物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方程 式，简称米氏方程式(Michaelis equation)。
Ｖ＝ ──[S] K +
m
Vmax[S]
[S]：底物浓度 V：不同[S]时的反应速度
Vmax：最大反应速度(maximum velocity)

1897年，Buchner兄弟用不含细胞的酵母提取液，实现 了发酵。
1926年，Sumner首次从刀豆中提纯出脲酶结晶。

1982年，Cech首次发现RNA也具有酶的催化活性，提 出核酶(ribozyme)的概念。
1995年，Jack W.Szostak研究室首先报道了具有DNA连 接酶活性DNA片段，称为脱氧核酶(deoxyribozyme)。
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第三节 酶促反应动力学
Kinetics of Enzyme-Catalyzed Reaction
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概念
研究各种因素对酶促反应速度的影响，并 加以定量的阐述。

影响因素包括有 酶浓度、底物浓度、pH、温度、
抑制剂、激活剂等。
※ 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。
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一、底物浓度对反应速度的影响
金属离子为酶的活性所必需，但与酶的结合
不甚紧密。
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金属离子的作用 稳定酶的构象； 参与催化反应，传递电子； 在酶与底物间起桥梁作用； 中和阴离子，降低反应中的静电斥力等。 小分子有机化合物的作用 在反应中起运载体的作用，传递电子、 质子或其它基团。
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小分子有机化合物在催化中的作用
转移的基团 小分子有机化合物(辅 酶 或 辅 基) 名 称 所含的维生素 尼克酰胺（维生素PP之一） 尼克酰胺（维生素PP之一） 维生素B2 （核黄素） 维生素B2 （核黄素） 维生素B1（硫胺素） 泛酸 硫辛酸 维生素B12 生物素 吡哆醛（维生素B6之一） 叶酸
E+P
*诱导契合假说(induced-fit hypothesis) 酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、 相互变形和相互适应，进而相互结合。这一过 程称为酶-底物结合的诱导契合假说 。
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目录
酶的诱导契合动画
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底物
羧 肽 酶 的 诱 导 契 合 模 式
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（二）酶促反应的机理
1. 邻近效应(proximity effect) 与定向排列(orientation arrange ) 2. 多元催化(multielement catalysis) 3. 表面效应(surface effect)
最适温度
酶 活 性
2.0
1.5
1.0
(optimum temperature)：
0.5
酶促反应速度最快时的 环境温度。
* 低温的应用
0
10 20 30 40 50 60
温度 º C
温度对淀粉酶活性的影响
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四、 pH对反应速度的影响
酶
活 性
胃蛋白酶
淀粉酶
胆碱酯酶
最适pH
(optimum pH)：
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二、酶浓度对反应速度的影响
当[S]＞＞[E]，酶可被
V
底物饱和的情况下，反
应速度与酶浓度成正比。
关系式为：V
= K3 [E]
0 [E]
当[S]>>[E]时，Vmax = k3 [E]
酶浓度对反应速度的影响
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三、温度对反应速度的影响
双重影响
温度升高，酶促反应速 度升高；由于酶的本质是蛋 白质，温度升高，可引起酶 的变性，从而反应速度降 低。
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酶的转换数
定义 — 当酶被底物充分饱和时，单位时间内 每个酶分子催化底物转变为产物的分 子数。 意义 — 可用来比较每单位酶的催化能力。
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（三）Ｋm值与Ｖmax值的测定 1. 双倒数作图法(double reciprocal plot)， 又称为 林-贝氏(Lineweaver- Burk)作图法
第 三 章
酶
Enzyme
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酶的概念

目前将生物催化剂分为两类
酶 、 核酶（脱氧核酶）
酶是一类由活细胞产生的，对其特异底物 具有高效催化作用的蛋白质。

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酶学研究简史

公元前两千多年，我国已有酿酒记载。
一百余年前，Pasteur认为发酵是酵母细胞生命活动的 结果。
1877年，Kuhne首次提出Enzyme一词。
蛋白质部分：酶蛋白 (apoenzyme) 全酶 (holoenzyme) 辅助因子 (cofactor)
小分子有机化合物
金属离子
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*各部分在催化反应中的作用
酶蛋白决定反应的特异性 辅助因子决定反应的种类与性质

金属酶(metalloenzyme) 金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢 失。 金属激活酶(metal-activated enzyme)


只能加速可逆反应的进程，而不改变
反应的平衡点。
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一、 酶促反应的特点
（一）酶促反应具有极高的效率

酶的催化效率通常比非催化反应高108～1020倍， 比一般催化剂高107～1013倍。

酶的催化不需要较高的反应温度。
酶和一般催化剂加速反应的机理都是降低反应的 活化能(activation energy)。酶比一般催化剂更有 效地降低反应的活化能。
基侧链的化学基团中，
一些与酶活性密切相关 的化学基团。
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酶的活性中心(active center) 或称活性部位(active site)，指必需基团 在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间 结构的区域，能与底物特异结合并将底物转 化为产物。
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活性中心内的必需基团
结合基团 (binding group) 与底物相结合
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第一节 酶的分子结构与功能
The Molecular Structure and Function of Enzyme
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酶的不同形式

单体酶(monomeric enzyme)：仅具有三级结 构的酶。 寡聚酶(oligomeric enzyme)：由多个相同或 不同亚基以非共价键连接组成的酶。 多酶体系(multienzyme system)：由几种不同 功能的酶彼此聚合形成的多酶复合物。
酶催化活性最大 时的环境pH。
0
2
4
6
8
10
pH
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pH对某些酶活性的影响



多功能酶(multifunctional enzyme)或串联酶 (tandem enzyme)：一些多酶体系在进化过程 中由于基因的融合，多种不同催化功能存在 于一条多肽链中，这类酶称为多功能酶。
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一、 酶的分子组成
单纯酶
结合酶
(simple enzyme)
(conjugated enzyme)
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活化能：底物分子从初态转变到活化态所需的能量。
能 量 非催化反应活化能
一般催化剂催 化反应的活化能 酶促反应 活化能
底物 反应总能量改变 产物 反 应 过 程
酶促反应活化能的改变
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根据酶对其底物结构选择的严格程度不同， 酶的特异性可大致分为以下3种类型：

绝对特异性(absolute specificity)：只能作用于 特定结构的底物，进行一种专一的反应，生 成一种特定结构的产物 。 相对特异性(relative specificity)：作用于一类 化合物或一种化学键。 立体结构特异性(stereo specificity)：作用于立 体异构体中的一种。
② 意义： a) Km是酶的特征性常数之一； b) Km可近似表示酶对底物的亲和力；
c) 同一酶对于不同底物有不同的Km值。
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Vmax
定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度， 与酶浓度成正比。 意义：Vmax=K3 [E] 如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算 酶的
转换数(turnover number)，即动力学常数K3。
* A~F为底物多 糖链的糖基，位 于酶的活性中心 形成的裂隙中。
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第二节 酶促反应的特点与机理
The Characteristic and Mechanism of Enzyme-Catalyzed Reaction
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酶与一般催化剂的共同点

在反应前后没有质和量的变化； 只能催化热力学允许的化学反应；
活性中心外的必需基团
催化基团 (catalytic group) 催化底物转变成产物
位于活性中心以外，维持酶活性中心应有 的空间构象所必需。
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活性中心以外 的必需基团
底物
催化基团
结合基团
活性中心
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溶菌酶的活性 中心
* 谷氨酸35和天 冬氨酸52是催化 基团； * 色氨酸62和63、 天冬氨酸 101 和 色氨酸 108是结 合基团；
研究前提
I.
II.
III.
IV.
单底物、单产物反应 酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用 单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来 表示 反应速度取其初速度，即底物的消耗量很小 （一般在5﹪以内）时的反应速度 底物浓度远远大于酶浓度
在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应 速度的影响呈矩形双曲线关系。
氢原子（质子） NAD+（尼克酰胺腺嘌呤二核 苷酸，辅酶I） NADP+（尼克酰胺腺嘌呤二核 苷酸磷酸，辅酶II） FMN （黄素单核苷酸） FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸） 醛基 TPP（焦磷酸硫胺素） 酰基 辅酶A（CoA） 硫辛酸 烷基 钴胺素辅酶类 二氧化碳 生物素 氨基 磷酸吡哆醛 甲基、甲烯基、 四氢叶酸 甲炔基、甲酰基 等一碳单位
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辅助因子分类
（按其与酶蛋白结合的紧密程度）
辅酶 (coenzyme): 与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的 方法除去。 辅基 (prosthetic group): 与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超 滤的方法除去。
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二、酶的活性中心
必需基团(essential group) 酶分子中氨基酸残
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Km值的推导
当反应速度为最大反应速度一半时 V
Vmax
Vmax/2 Km [S]
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Vmax 2
Vmax[S] ＝ Km + [S] Km＝[S]
∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半 时的底物浓度，单位是mol/L。
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（二）Km与Vmax的意义
Km值
① Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时 的底物浓度。
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推导过程

稳态：是指ES的生成速度与分解速度相等，即 [ES]恒定。
K1 ([Et]－[ES]) [S]＝K2 [ES] + K3 [ES] 整理得： ([Et]－[ES])[S] [ES] K2+K3 K1 ＝ K2+K3 K1
(2)
令：
＝ Km （米氏常数）
则(2)变为: ([Et]－[ES]) [S] ＝Km [ES]
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（三）酶促反应的可调节性
酶促反应受多种因素的调控，以适应机体对 不断变化的内外环境和生命活动的需要。其中包 括三方面的调节。 对酶生成与降解量的调节
酶催化效力的调节
通过改变底物浓度对酶进行调节等
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二、酶促反应的机理
（一）酶-底物复合物的形成与诱导契合假说
酶底物复合物
E+S
ES
V= Vmax[S]
Km+[S]
两边同取倒数
Km 1/V= 1/[S] + 1/Vmax 1/V1/V Vmax max 1/[S] （林－贝氏方程）
1 / K
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2. Hanes作图法
在林－贝氏方程基础上，两边同乘[S]
[S]/V
[S]/V=Km/Vmax + [S]/Vmax
Km/Vm
-Km
[S]
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整理得:
[Et][S] [ES]＝─── Km + [S] K3[Et][S] V＝──── Km + [S]
(3)
将(3)代入(1) 得
(4)
当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时， 即[Et]＝[ES]，反应达最大速度 Vmax＝K3[ES]＝K3[Et] (5)
Vmax[S] 将(5)代入(4)得米氏方程式： V＝──── Km + [S]
Ｋm：米氏常数(Michaelis constant)
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米－曼氏方程式推导基于两个假设：
E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而ES
分解为E及P的反应为慢反应，反应速度取决于 慢反应即 V＝k3[ES]。 (1) S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始 阶段，S的浓度可认为不变即[S]＝[St]。
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V
Vmax
[S] 当底物浓度较低时 反应速度与底物浓度成正比；反 应为一级反应。
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V
Vmax
[S]
随着底物浓度的增高 反应速度不再成正比例加速；反应 为混合级反应。
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V
Vmax
[S]
当底物浓度高达一定程度 反应速度不再增加，达最大速度； 反应为零级反应
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（一）米－曼氏方程式
酶促反应模式——中间产物学说