分子生物学课件 第四章

Ti 质粒
---天然载体系统 ---天然载体系统
土壤脓杆菌—植物病原菌— 质粒感染 质粒感染— 土壤脓杆菌—植物病原菌—Ti质粒感染—冠瘿瘤
基因导入
天然载体系统：土壤脓杆菌（ 质粒 质粒） 天然载体系统：土壤脓杆菌（Ti质粒） 发根脓杆菌（ 质粒 质粒） 发根脓杆菌（Ri质粒） 人工导入技术：基因枪、高压、激光、 人工导入技术：基因枪、高压、激光、 人工介导等
克隆载体：以繁殖DNA为目的的载体， DNA为目的的载体 克隆载体：以繁殖DNA为目的的载体，通常
分类
分子较小，自我复制能力强，拷贝数高。 分子较小，自我复制能力强，拷贝数高。如 pBR322、pUC、M13等 pBR322、pUC、M13等。
表达载体： 表达载体：以获得基因表达产物为目的的载
体，通常要具有强启动子、结构稳定、拷贝数 通常要具有强启动子、结构稳定、 高和能在宿主细胞中高效表达等特点。 高和能在宿主细胞中高效表达等特点。
穿梭载体：带有两种复制原点，在原核细胞 穿梭载体：带有两种复制原点，
和真核细胞中都能繁殖的载体， 和真核细胞中都能繁殖的载体，通常用于真 核基因的克隆。 核基因的克隆。
克隆载体的特性
• • • • 复制起始： 复制起始：在受体细胞中独立复制 多克隆位点： 多克隆位点：含多个限制性核酸内切酶单一切点 多选择标记：抗药性， 多选择标记：抗药性，其他遗传标记 分子量小：能容纳的外源DNA DNA片段尽可能大 分子量小：能容纳的外源DNA片段尽可能大
CTGC↓AG GA↑CGTC
5’突 突 出
3’突 突 出
特殊的限制酶
同裂酶isoschizomer 同裂酶
指来源不同，但有相同识别序列的限制性内切酶。 指来源不同，但有相同识别序列的限制性内切酶。
同尾酶isocaudamer 同尾酶
指识别序列不同，但切割 指识别序列不同，但切割DNA后可以产生相同粘端 后可以产生相同粘端 的限制性内切酶。 的限制性内切酶。
拷贝/细胞，例如 载体可达700个/细胞 拷贝 细胞，例如pUC载体可达 细胞 载体可达 个 细胞
严紧型－受受体染色体 受受体染色体DNA复制控制，拷 复制控制， 复制控制
贝数低， 几个拷贝 细胞，例如pSC101 几个拷贝/细胞 贝数低，1-几个拷贝 细胞，例如
分类
可转移型 不可转移型* 不可转移型* 兼容型 非兼容型* 非兼容型* 天然型 人工型* 人工型*
利 用 磷 酸 酶 防 止 载 体 DNA 的 重 新 环 化
质粒载体的定向克隆
。
基因工程常用工具酶 限制性内切酶
作
用
识别DNA特定序列，切割DNA链 特定序列，切割 识别 特定序列 链
DNA聚合酶 或大片段 1、切口平移制作标记 聚合酶I或大片段 、切口平移制作标记DNA探针；2、合成 探针； 、合成cDNA第二 聚合酶 探针 第二 Klenow fragment 条链；3、填补双链 凹端； 、 条链； 、填补双链DNA3’凹端；4、DNA序列分析 凹端 序列分析 DNA连接酶 连接酶 Taq DNA聚合酶 聚合酶 逆转录酶 T4多核苷酸激酶 多核苷酸激酶 末端转移酶 S1核酸酶、绿豆核酸 核酸酶、 核酸酶 酶 DNA端酶 端酶I 端酶 RNA酶A 酶 磷酸酶 连接两个DNA分子或片断 分子或片断 连接两个 聚合酶链式反应（ 聚合酶链式反应（PCR） ） 合成cDNA第一条链 合成cDNA第一条链 催化多核苷酸5’羟基末端磷酸化， 催化多核苷酸 羟基末端磷酸化，制备末端标记探针 羟基末端磷酸化 在3’ 末端加入同质多聚物尾 降解单链DNA或RNA，使双链DNA突出段变为平端 降解单链 或 ，使双链 突出段变为平端 降解DNA，在双链DNA上产生随机缺口 ，在双链 降解 上产生随机缺口 降解除RNA 降解除 切除核酸末端磷酸基
Ti质粒的功能组件： 质粒的功能组件： 质粒的功能组件
T-DNA
T-DNA特点： DNA特点： 特点 • 可自发转移，并整合进植物基因组； 可自发转移，并整合进植物基因组； • 导致冠瘿瘤形成，控制冠瘿碱合成； 导致冠瘿瘤形成，控制冠瘿碱合成； • 长度 长度12-24Kb。 。
共整合载体系统
由Ti质粒衍生出的载体系统 质粒衍生出的载体系统
有
有
ATP
NAD+
粘性末端连接
载体和插入片段具有相同的粘性末端 载体和插入片段具有相同的粘性末端 容易连接成环状的重组DNA DNA分子 容易连接成环状的重组DNA分子 可在连接前， 可在连接前，用碱 可能出现问题： 可能出现问题： • 载体自身环化，造成假阳性背景克隆； 性 磷 酸 酶 将 载 体 载体自身环化，造成假阳性背景克隆； DNA 5’ 端 去 磷 酸 • 插入片段可双向插入； 插入片段可双向插入 双向插入； 化，这样只有载体 • 插入片段可多拷贝插入。 插入片段可多拷贝插入 多拷贝插入。 和插入片段之间才 能发生连接； 能发生连接； DNA片段两端为 片段两端为非同源的粘性末端 当DNA片段两端为非同源的粘性末端 可实现定向克隆，连接效率高， 可实现定向克隆，连接效率高，简捷
科斯质粒 ? Ti质粒 Ti质粒 用于植物宿主的载体 ?
植物DNA病毒 植物DNA病毒 植物转座子 猿猴空泡病毒40（ 猿猴空泡病毒 （SV40） ）
用于动物宿主的载体
动物病毒
昆虫杆状病毒 逆转录病毒 其他动物病毒
λ噬菌体
双链DNA 双链 50kb
线性λ 噬菌体DNA 分子的两端各有12 个碱基的互 线性 λ 噬菌体 DNA分子的两端各有 12个碱基的互 DNA 分子的两端各有 12 补单链序列，是天然的粘性末端， COS位点 补单链序列，是天然的粘性末端，称为COS位点。 λ 噬菌体作为基因工程载 体的最主要原因是什么? 体的最主要原因是什么?
+ 检
工具酶
修饰酶 连接酶 限制性内切酶
DNA聚合酶 聚合酶 DNA Polymerase 逆转录酶 Reverse Transcriptase 碱性磷酸酶 Alkalinephosphatase T4多核苷酸酶 多核苷酸酶 T4 Polymerase Kinase
限制性内切酶 活性定义Biblioteka Baidu
限制酶的一个活性单位（ ） 限制酶的一个活性单位（1U），原则 上是在50µl的反应液中，37℃的温 的反应液中， ℃ 上是在 的反应液中 度条件下，经过1小时反应，将 1µgDNA完全分解所需要的酶量。 完全分解所需要的酶量。 完全分解所需要的酶量
常用克隆载体
质粒 λ噬菌体 Cosmid 真核病毒 YAC, BAC
1、什么是质粒? 什么是质粒? 2、质粒作为基因工程载体的原因? 质粒作为基因工程载体的原因? 3、质粒的分类?基因工程使用的质粒的特点? 质粒的分类?基因工程使用的质粒的特点?
松弛型* 独立复制，拷贝数高, 松弛型*－独立复制，拷贝数高 10-200个 个
特点
① 识别 部 位序 列 一 般为4、 或 个核苷 般为 、 5或 6个核苷 酸序列； 酸序列； ② 呈双重轴对称。 呈双重轴对称。 EcoR I
性质
切断识别部位或其附近特定部 生两种末 端 位后 ， 产 生两种末端 ， 即 平齐末端和粘性末端（ 突 平齐末端和粘性末端（5’突 出端和3’突出端）。 出端和 突出端） 突出端 Pst I
双元载体系统
λ噬菌体经过改造去除中间 噬菌体经过改造去除中间 非必需部分可以插入大片 分子（ 段DNA分子（约20Kb）是 分子 ） 构建基因文库主要载体之 一。
其它原因呢？ 其它原因呢？
切除非必需的中央区 λ噬菌体 噬菌体 增减某些限制性酶切位点 插入适当的筛选标记基因 λ噬菌体载体 噬菌体载体
• 置换型载体：适于克隆5-20kb的外 置换型载体：适于克隆 的外 源基因片段， 源基因片段，常用于构建基因组 DNA文库。 文库。 文库
修饰酶
Reverse Transcriptase 细菌碱性磷酸酶BAP 细菌碱性磷酸酶 牛小肠碱性磷酸酶CIP 牛小肠碱性磷酸酶
Alkalinephosphatase
T4 Polymerase Kinase
载 体
载体(vector)是能够携带外源DNA进入宿主细胞进行扩 载体(vector)是能够携带外源 进入宿主细胞进行扩
必要条件
工具酶 基因 载体 受体细胞
操作过程 分、 切、 接、 转、 筛
获得外源基因（目的基因/目的片段） 获得外源基因（目的基因/目的片段） 外源基因 与载体进行体外重组形成重组体（重组子） 重组形成重组体 与载体进行体外重组形成重组体（重组子） 将重组体导入 转化/转导/转染） 导入（ 将重组体导入（转化/转导/转染）受体细胞 筛选含有重组体的受体细胞 细胞扩增和筛选含有重组体的受体细胞（ 细胞扩增和筛选含有重组体的受体细胞（宿主细胞 寄主细胞） /寄主细胞） 培养含有重组体的细胞（阳性克隆）检测表达产物 培养含有重组体的细胞（阳性克隆）检测表达产物
具备条件
必 要 条 件
具有筛选标记,以区别阳性与阴性重组 具有筛选标记 以区别阳性与阴性重组 分子; 分子; 分子较小，便于体外基因操作， 分子较小， 便于体外基因操作，同时 载体DNA与宿主 与宿主DNA便于分离； 便于分离； 载体 与宿主 便于分离
表达载体: 表达载体: 具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、 具有与宿主细胞相适应的启动子、 增强子、 加尾信号等基因表达元件。 加尾信号等基因表达元件。
λ噬菌体载体 噬菌体载体
• 插入型载体：允许插入5-7kb的外 插入型载体：允许插入 的外 适于构建cDNA文库。如 文库。 源DNA,适于构建 适于构建 文库 λgt 噬菌体载体。 噬菌体载体。
科斯质粒 (Cosmid)
粘粒、 粘粒、柯斯质粒 是指含有λ噬菌体粘性末端的杂种质粒，由 λDNA的COS区(约20-数百 数百bp)与质粒重组而 的 区 约 数百 与质粒重组而 成，在宿主细胞中可作为正常噬菌体进行复 但不表达任何噬菌体的功能。 制，但不表达任何噬菌体的功能。可以克隆 40-50Kb的外源 的外源DNA片段。 片段。 的外源 片段
增和表达的DNA,它们一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒 它们一般是通过改造质粒、 增和表达的 它们一般是通过改造质粒 等构建而成的。 等构建而成的。
质粒
噬菌体
种 类
病毒 组 合 载 体
能在宿主细胞中独立复制; 能在宿主细胞中独立复制 具有多种限制酶的单一切点（ 具有多种限制酶的单一切点（ 多克隆 位点）以便外源DNA插入； 插入； 位点）以便外源 插入
连接酶
DNA连接酶可以催化单链 连接酶可以催化单链DNA的连接吗？ 的连接吗？ 连接酶可以催化单链 的连接吗 DNA连接酶可以催化缺少核苷酸的切口的连接吗？ 连接酶可以催化缺少核苷酸的切口的连接吗？ 连接酶可以催化缺少核苷酸的切口的连接吗
主要连接酶的功能特点
最常用连接酶 平齐末端双链 DNA分子的连接 分子的连接 功能 匹配粘性末端双 链DNA分子的连 分子的连 接功能 辅助因子 T4DNA lingase 有 E.coli.DNA lingase 无
第四章 分子生物学的研究方法
一、重组DNA技术 重组DNA DNA技术
1973年 以DNA重组实验成功为标志 年 重组实验成功为标志 遗传物质是DNA 遗传物质是 DNA双螺旋结构 双螺旋结构 遗传信息传递方式 工具酶 载体 转录酶
理论上三大发现 现代分子生物学 技术上三大发明
跨越天然物种屏障 定向创造新物种
氯霉素扩增－氯霉素可抑制染
色体DNA复制 色体DNA复制，但质粒复制不受影 DNA复制， 可增加拷贝数。 响，可增加拷贝数。
克隆载体pUC19质粒图谱 克隆载体pUC19质粒图谱 pUC19
克隆载体pBR322质粒图谱 克隆载体pBR322质粒图谱 pBR322
质粒 用于原核宿主的载体 噬菌体 ?
DNA Polymerase
E.coli. DNA聚合酶 聚合酶I 聚合酶 E.coli. DNA聚合酶 大片段 聚合酶I大片段 聚合酶 （Klenow fragment） ） T4噬菌体 噬菌体DNA聚合酶 噬菌体 聚合酶 T7噬菌体 噬菌体DNA聚合酶 噬菌体 聚合酶 耐高温DNA聚合酶： 聚合酶： 耐高温 聚合酶 Taq DNA聚合酶 聚合酶