脲酶的测定方法

一、脲酶测定(比色法)

脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。

1、试剂配制：

（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g 氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，

并用水稀释至2L。

（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL 丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。称取27g氢

氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。使用前，取A、B

两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。

（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，（1.9g次氯酸钠溶于1L水中）溶液稳定。

（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。

（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL 含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。

2、操作步骤

称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;

往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。在37℃恒温箱中培养24ｈ。然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立

即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态

氮量。

标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容。1h内再分光光度计上于578nm处比色。

3、结果计算

以24小时后1g土壤中NH3－N的质量（mg）表示脲酶活性（Ure）

Ure＝a·V·n/m

式中：a为由标准曲线求得的NH3－N浓度（mg/mL）；V为显色液体积（50mL）；n为分取倍数；m为烘干土重（g）。

补充：

1) 1h内在（（青定）酚的蓝色在1h内保持稳定）在分光光度计上用1cm液槽，于578nm处将显色液进行比色测定。

2) 无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。以检验试剂纯度，整个实验设置一个对照

3)无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。每个土样都设此对照。

过氧化氢酶测定(容量法)

过氧化氢酶也叫接触酶，能促进过氧化氢对各种化合物的氧化。几乎在所有的生物体内部有过氧化氢酶，在某些细菌里，其数量约为细胞干重的1％。土壤的过氧化氢酶活性，与土壤呼吸强度和土壤微生物活动相关，在一定程度上反映了土壤微生物学过程的强度。

原理

过氧化氢酶的测定有测压法和滴定法。测压法是测定过氧化氢分解时析出的氧量(反应过氧化氢酶

式为：H2O2+H2O O2+H2O，方法简单，但准确性较差。后者则是定量滴定酶促反应后剩余的过氧化氢量，反应式为

2KMnO4+5H2O2+3H2SO42MnSO4+K2SO4+8H2O+5O2，此法测定结果较好。试剂

(1) 0.3% H2O2：按1：100将30％的H2O2用水稀释。

(2) 3N H2SO4（也就是1.5mol/l H2SO4）：以配1000ml为例，需要的浓硫酸的体积为1.5*98.08/1.83=80.39ml，可以取80ml。

KMnO4的分子量=158.026,当量=31.605.高锰酸钾水溶液受到水中还原物和杂质以及受日光直射等影响能分解析出棕色的含水的二氧化锰沉淀，而有浓度的改变。因此在配制其标准溶液时必须使用棕色瓶盛装，以防日光直射作用.配制后并应放置一段时间，待与水中还原物完全作用后，滤去沉淀，然后进行标定，才能得到基本稳定不易变化的标准溶液。

(3) 0.1N KMnO4溶液：称取化学纯高锰酸钾3.161克，溶于l升无CO2蒸馏水（沸水）中，溶解后,在暗处放置一周, 然后用虹吸管将上部澄清溶液移于棕色瓶中(或用玻璃棉滤过)保存，以备标定.

注：C(1/5 KMnO4)=0.1mol/l表示的就是0.1N KMnO4溶液。

0.1N KMnO4溶液标定（GB/T601-2002）

称取0.2g（准至0.0001g）于105~110℃烘至恒重的基准草酸钠。溶于100mL（8+92）硫酸溶液中，用配制好的高锰酸钾溶液[c（1/5 KMnO4）=0.1mol/l]滴定，近终点时加热至65℃，继续滴定至溶液呈粉红色保持30s，同时作空白试验（不加草酸钠，其他一样）。

高锰酸钾溶液标准浓度按下式计算

c（1/5KMnO4）=m*1000/[（V1-V2）*M ]

式中c（1/5KMnO4）—高锰酸钾标准液之物质的量浓度，mol/L；

m——草酸钠之质量，g；

V1——滴定草酸钠消耗的高锰酸钾溶液之用量，mL；

V2——空白试验用高锰酸钾溶液之用量，mL；

M——草酸钠的摩尔质量的数值,单位为（g/mol），[ M(1/2Na2C2O4)=66.999 ]

或者c（1/5KMnO4）=m/（V1-V2）*0.06700

0.06700——与1.00mL高锰酸钾溶液c（1/5KMnO4）=0.1mol/l相当的以克表示的草酸

钠的质量。

操作步骤：

（1）取2.0 g土，置于100mL（或150ml）三角瓶中，并注入40mL蒸馏水和5mL 0.3％H2O2溶液。（B）

（2）同时设置对照，即三角瓶中注入40mL蒸馏水和5mL 0.3％过氧化氢溶液，而不加土样。（A）

（3）将三角瓶放在往返式振荡机上120r/min振荡20min后，加入5mL3N硫酸，以稳定未分解的过氧化氢。再将瓶中悬液用慢速滤纸过滤。吸取25mL滤液，用0.1N KMnO4滴定至淡粉红色终点。

结果计算

用于滴定土壤滤液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）为B，用于滴定25mL原始的过氧化氢混合液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）为A。以20min后1g土壤消耗的0.1N KMnO4溶液的毫升数表示（以20min后1g土壤中的过氧化氢的毫克数表示？）。

土壤过氧化氢酶活性=（A-B）×T/dwt

式中，T——为高锰酸钾滴定度的校正值。