酵母表达载体的构件

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毕赤酵母表达载体及宿主菌介绍

毕赤酵母表达载体及宿主菌介绍由于甲醇营养型酵母菌体内无天然质粒，所以携带外源基因的重组体必须整合于染色体中才能实现外源基因的表达。

整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。

典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5’AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3’AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。

如果是分泌型表达载体，在多克隆位点的前面，外源基因的5’端和启动子的3’端之间插人了分泌作用的信号肽序列。

在这个分泌信号的引导下，外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和加工后能够由胞内转移至胞外，将成熟的蛋白质分泌到细胞外。

为方便于操作，通常表达载体都是穿梭质粒。

表达载体与酵母染色体有单交换和双交换整合2种方式，单交换整合时，或插入A0X1位点，或插入his位点。

有文献报道，以his4作为整合位点时，染色体突变株与表达盒间存在基因转换，偶而可使Laz表达盒丢失，故AOX1位点更好。

一般认为，单交换转化效率比双交换效率高，且易得到多拷贝整合，其发生机制可能是重复单交换引起的。

携带外源基因的表达载体可通过电穿孔、原生质体生成法或全细胞法转化酵母细胞。

甲醇酵母转化和大肠埃希氏菌转化不同之处是前者较为复杂。

对于大肠埃希氏菌而言，只要把重组表达载体导入细胞体内即可。

因其载体上携带有自身复制原点，可随染色体复制而复制，重组表达载体能够稳定存在。

在甲醇酵母系统中，所有的表达载体均不含酵母复制原点。

这就是说，导入酵母体内的重组表达载体只有和酵母染色体上的同源区发生重组，整合到染色体上，外源基因才能够稳定存在，外源蛋白才能得到稳定表达，这种整合的转化子一旦形成就非常稳定。

如果转化后的重组表达载体未能整合到染色体上，而是以游离的附加体形式存在，这种转化子就不稳定，重组表达载体极易丢失。

酵母双杂交表达载体pGBKT7_NPR1与pGADT7_NPR1的构建及酵母菌的转化

酵母双杂交表达载体pGBKT7_NPR1与pGADT7_NPR1的构建及酵母菌的转化肖牧;徐健;何乐;刘春林;阮颖【摘要】NPR1是水杨酸介导的系统获得性抗性(SAR)途径中不可或缺的一个转录辅助因子.在SA诱导下,NPR1被转运至细胞核内并与一些转录因子结合,以启动下游基因的表达.本研究通过PCR扩增获得拟南芥中NPR1基因CDS序列,经过限制性内切酶酶切后在T4连接酶作用下分别克隆至pGBKT7与pGADT7酵母表达载体上,并成功将其转化至Gold酵母菌株中.为利用酵母双杂交筛选NPR1参与形成的转录复合体中其它可能存在的蛋白质并阐明其在植物防御信号传导途径中的互作模式奠定了基础.%NPR1 is an indispensable transcription co-factor in SAR induced by salicylic acid.Upon the SA stimuli,NPR1 is translocated into the nucleus and interacts with some transcription factors,and then starts the expression of downstream genes.In this study,CDS sequence of NPR1 was cloned into two yeast expression vectors pGBKT7 and pGADT7,and then was transformed into yeast Gold strain.This study laid a foundation for sifting other possible proteins in transcriptional complex with participation of NPR1 by Yeast Two-Hybrid and elucidating its interaction model in plant defense signal transduction pathways.【期刊名称】《作物研究》【年(卷),期】2013(027)003【总页数】4页(P213-216)【关键词】NPR1;基因克隆;酵母双杂交载体;酵母转化【作者】肖牧;徐健;何乐;刘春林;阮颖【作者单位】湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学作物种质创新和资源利用国家重点实验室培育基地,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学作物种质创新和资源利用国家重点实验室培育基地,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学作物种质创新和资源利用国家重点实验室培育基地,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学作物种质创新和资源利用国家重点实验室培育基地,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学作物种质创新和资源利用国家重点实验室培育基地,长沙410128【正文语种】中文【中图分类】Q78拟南芥NPR1是水杨酸(Salicylic acid)介导的系统获得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)途径中不可或缺的一个转录辅助因子，其包含的BTB/POZ结构域［1］以及锚蛋白重复序列是行使其生物学功能的基础［2］。

酵母表达系统

信号肽：MFα 标记：Kan
4、甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策
载体稳定性基因剂量整合位点甲醇利用表型 mRNA5’端 AT含量分泌信号表达产物稳定性
1）载体稳定性
同拷贝数时，整合型的比自主复制型的表达水平高 YRp型载体的稳定化：
选择—非选择培养交替数十代可得稳定的整合子，但费时，整合位点不确定。采用YIp型载体: 更易实现整合、整合位点清楚
2）基因剂量
外源基因表达存在基因剂量效应筛选多拷贝整合子
载体引入G418/Zeocin抗性标记，整合子拷贝数与抗性成正相关，采用高G418/Zeocin抗性转化子。体外串联多个表达盒，直接获多拷贝整合子采用YRp型载体稳定化技术获高拷贝整合子构建高拷贝整合型表达载体
3）整合位点
外源基因表达盒整合于AOX/MOX或标记基因处，均可高效表达毕赤酵母中个别情况整合于His4位点的比AOX1位点的低
2）分泌表达产物过糖基化
（二）甲醇酵母表达系统
甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子甲醇酵母表达系统的优缺点甲醇酵母表达系统操作原理甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策甲醇酵母表达系统的应用
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
甲醇酵母（methylotrophic yeast) 指可利用甲醇作单一碳源的一类酵母。毕赤酵母（Pichia pastoris) 汉森酵母（Hansenula ploymorpha) 假丝酵母（Candia boidinii)
组成的、复杂分支结构的现象。增加了免疫原性、对活性与药代稳定性均有影响。 *糖链组成
O型糖链仅由甘露糖组成、而哺乳细胞的还含唾液酸基团
4、酿酒酵母表达系统的缺陷
1）表达水平普遍不高 A、表达载体传代不稳定（YEp、YRp） B、所采用的强启动子调控不严谨 C、不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵

酵母表达系统步骤

毕赤酵母表达系统步骤（参考Invitrogen公司说明书）：一、pPICZαA、B、C质粒以及DH5α菌株的保存1取0.5μl pPICZα A、B、C质粒，热击转化DH5α，在低盐LB（含有25μg/ml Zeocin）的平板上37℃培养过夜。

2挑取转化子，甘油保存。

二、载体构建1将目的基因构建到pPICZα载体上，转化DH5α，用Zeocin筛选转化子。

2提质粒酶切鉴定或PCR鉴定3载体测序测序可用α-Factor引物或5’AOX1引物，3’AOX1引物三、线性化DNA1提取足够量的质粒DNA（一次转化至少需要5-10μg质粒）2 酶切线性化10μg构建好的载体，同时酶切空载体做对照，根据载体选择线性化酶切位点（样品分管酶切），pPICZα载体在5’AOX1区域有三个酶切位点可选择：SacI、PmeI、BstXI3 取1-2μl酶切产物跑电泳，确定是否酶切完全；4 过柱纯化线性化质粒（用50μl EB洗脱）；四、线性化DNA的去磷酸化处理线性化质粒43μlCIAP Buffer 5μlCIAP酶2μl四、总体积为50μl的样品37℃ 1h，过柱纯化，用30μl ddH2O洗脱；五、感受态细胞的制备实验前准备：无抗性YPD平板一个、无抗生素液体YPD培养基，100μg/ml Zeocin YPD 平板和液体、50ml离心管两个、500ml预冷的无菌水、20ml 1M 山梨醇（灭菌预冷的），0.2cm预冷的电击杯；1YPD平板划线培养菌，30℃培养2-3d；250ml三角瓶中，加入5ml YPD，挑取酵母单菌落，30℃培养过夜；3吸取0.5ml菌液，加入至含有200ml新鲜YPD的1L三角瓶中，30℃，225rpm/min培养至OD值1.3-1.5；41500g，4℃离心5min收集菌体；540ml冰预冷的无菌水重悬沉淀；61500g，4℃,5min；730ml无菌水重悬；81500g，4℃,5min；910ml 1M 山梨醇重悬；101500g，4℃,5min；11加入1ml山梨醇，重悬冰上放置，直接做转化，或加入灭菌甘油每管80ul分装，冻存于-80℃(长时间保存会影响转化效率)；六、电击转化15-10μg线性化DNA（20μl<）与80ul上述感受态细胞混合，转移至预冷的0.2cm电击杯中（点击条件：电压1.5kV；电容25µF；电阻200Ω，电击时间为4～10msec）；2冰上放置5min3电击（按生产厂商提供的适合酵母用的参数）4迅速加入1ml预冷的1M 山梨醇，转移至1.5ml EP管中530℃静置培养1-2h（如果要增加存活率，获得更多的转化克隆，可在30℃静置培养1h后，加入1mlYPD培养基，30℃200rpm培养1h后取部分涂布与不同浓度抗生素的平板）6取50、100、200ul分别涂布于含有Zeocin的YPD平板，30℃培养2-10 d至有菌落出现；7如果要筛选多拷贝转化子，将转化克隆混合在一起，涂布在Zeocin 浓度为500、1000、2000μg/ml的YPD平板，培养2-3d。

酵母菌表面展示操作步骤的主要过程

酵母菌表面展示操作步骤的主要过程酵母菌表面展示是一种常用的实验技术，用于在酵母菌表面展示外源蛋白或多肽。

这种技术可以应用于生物研究、药物开发和基因工程等领域。

下面将详细介绍酵母菌表面展示的主要操作步骤。

1. 构建酵母菌表面展示载体首先，需要设计和构建酵母菌表面展示载体，该载体通常由酵母菌表面展示蛋白（例如Agα1蛋白）与目标蛋白/多肽之间的连接区域组成。

这个连接区域可以是多样化的，根据实验需求选择不同的区域进行连接。

2. 选择合适的宿主酵母菌株根据实验需要，选择合适的宿主酵母菌株进行表面展示。

Saccharomyces cerevisiae是常用的酵母菌株，其具有良好的遗传转化特性和对多肽展示的高效能力。

3. 将表面展示载体转化入酵母菌将设计好的表面展示载体通过遗传转化技术转化入酵母菌株中。

转化方法一般包括化学法、电穿孔法和冲击法等。

通过转化，可以将表面展示载体导入酵母菌细胞内，使其在细胞表面显示。

4. 确定表面展示蛋白的表达通过检测和筛选，确认表面展示载体已成功表达在酵母菌细胞表面的蛋白。

可以采用免疫荧光染色、酵母小片染色和Western blot等技术方法进行验证。

5. 进行表面展示蛋白的定性定量分析对表面展示的蛋白进行定性定量分析是评估酵母菌表面展示效果的关键步骤。

定性分析可以使用免疫荧光染色、流式细胞术等技术来确认目标蛋白在酵母菌表面的存在。

定量分析可以通过Western blot或ELISA等方法来测定目标蛋白的表达水平。

6. 进行蛋白/多肽的筛选与优化根据目标蛋白的特性，可以进行蛋白/多肽的筛选与优化。

通过调整不同参数，如显示载体的选择、培养条件的优化等，可以提高酵母菌表面展示系统的表达效果。

7. 应用实验将酵母菌表面展示系统应用到具体的实验中。

比如，可以利用该系统筛选潜在药物靶点，通过与外源蛋白/多肽的相互作用来分析蛋白结构与功能等。

8. 结果分析和展示对实验结果进行分析和展示。

可以使用统计学方法对数据进行分析，并将结果以图像、图表和文献形式展示出来。

人血管内皮抑素毕赤酵母真核表达载体的构建

人血管内皮抑素毕赤酵母真核表达载体的构建【摘要】目的构建人血管内皮抑素（ES）毕赤酵母真核表达载体。

方法利用RT PCR技术从人体肝脏组织扩增出ES基因，插入毕赤酵母表达载体pPIC9中，酶切鉴定并进行DNA测序鉴定。

结果成功克隆ES基因并筛选出pPIC9载体中的ES阳性克隆，测序证实其序列与已报道的ES基因序列一致。

结论用分子生物学方法构建ES毕赤酵母真核表达载体的成功，使高效表达ES蛋白成为可能。

【关键词】内皮抑素类人类克隆分子毕赤酵母［ABSTRACT］ObjectiveTo construct yeast eukaryotic expression vector carrying human endostatin cDNA. Methods The functional fragment of endostatin gene was amplified by RT PCR from human hepatic tissue, and cloned into yeast pPIC9 expression vector. The positive clone was sequenced by automatized sequencer.ResultsThe endostatin cDNA was successfully cloned. The positive ES gene clone in pPIC9 expression vector was sieved, and its coding sequence was the same as reported sequence. ConclusionThe successful construction of ES gene pPIC9 expression vector ensures the high expression of ES protein.［KEY WORDS］endostatins; human; clone, molecule; construction; pichia1997年，O REILLY等［1］从小鼠血管瘤细胞培养物中分离得到内皮抑素（ES），体内和体外实验证实，它能特异性地抑制新生血管内皮细胞生长,从而抑制多种实体肿瘤的生长和转移。

酵母整合型表达载体整合原理和整合原件

酵母整合型表达载体整合原理和整合原件一、概述酵母整合型表达载体是一种用于基因工程研究中的重要工具，它能够整合外源基因并稳定地在酵母细胞中表达。

这一载体在生物技术领域具有广泛的应用，能够帮助科研人员进行基因表达调控、蛋白质功能研究等方面的工作。

本文将针对酵母整合型表达载体的整合原理和整合原件进行深入探讨，并结合个人观点对其进行分析。

二、整合原理酵母整合型表达载体的整合原理是指外源基因在酵母细胞染色体中的整合方式和机制。

一般来说，酵母整合型表达载体通过与酵母染色体的同源配对，使外源基因在染色体特定位点发生整合。

整合的过程需要依赖一系列的整合原件来进行调控和介导。

其中，整合原件主要包括酵母选择标记基因和整合酶等。

1. 酵母选择标记基因酵母选择标记基因是酵母整合型表达载体中的重要组成部分，它能够在酵母细胞中产生特定的表型，并在培养基中通过筛选来实现对整合事件的筛选。

常见的酵母选择标记基因包括TRP1、LEU2、HIS3等，它们分别对应酵母细胞的色氨酸、亮氨酸和组氨酸代谢通路，能够使突变体在对应的缺陷培养基上无法生长。

通过选择适当的酵母选择标记基因，可以在整合过程中实现对突变体的筛选，从而保证整合事件的稳定性和准确性。

2. 整合酶整合酶是酵母整合型表达载体中的另一个重要组成部分，它能够介导整合事件的进行，并在酵母细胞中调控外源基因的整合。

常见的整合酶包括酵母整合酶(INC)和整合介导蛋白(INP)等，它们能够与酵母染色体上的同源序列进行特异性结合，并介导外源基因的整合过程。

通过对整合酶的调控和改变，能够实现对整合事件的精准和高效地控制，从而满足不同研究需求的整合要求。

三、个人观点酵母整合型表达载体的整合原理和整合原件在基因工程研究中发挥着重要的作用，它们为科研人员提供了强大的工具和评台，能够帮助他们实现对外源基因的整合和驱动。

在未来的研究中，我认为可以进一步优化和改进整合原件的设计和构建，以提高整合事件的稳定性和效率，从而更好地满足不同研究领域对整合事件的需求。

酵母菌表面展示操作步骤之表面蛋白表达与分析

酵母菌表面展示操作步骤之表面蛋白表达与分析表面蛋白是酵母菌细胞外表面上的蛋白质，它们在细菌的抗原识别、信号转导、细菌附着等过程中发挥着重要的作用。

通过表达和分析酵母菌的表面蛋白，我们可以更深入地了解其功能和机制。

本文将介绍酵母菌表面蛋白表达与分析的操作步骤。

步骤一：构建表达载体1. 根据需要表达的表面蛋白，选择合适的表达载体。

常用的表达载体包括质粒和病毒载体。

2. 将目标表面蛋白基因克隆到表达载体中，通常使用限制酶切和连接酶切的方法将目标基因插入载体中。

3. 验证目标基因的插入是否正确，并经过测序确认。

步骤二：转染酵母菌1. 准备酵母菌细胞，常用的酵母菌品系包括Saccharomyces cerevisiae和Pichia pastoris等。

2. 制备合适的转化体系，包括转化缓冲液和载体DNA。

3. 将载体DNA转化到酵母菌细胞中，可以通过化学法、电转化法或冷冻疑似法等方法实现。

步骤三：筛选表达阳性克隆1. 在含有适量的选择性培养基的培养皿中孵育转化后的酵母菌细胞。

2. 进行抗生素筛选，将培养基中添加适量的抗生素，使只有表达载体的酵母菌菌株存活下来。

3. 进行表达阳性菌落筛选，通过酵母菌表面蛋白的可视化或功能性分析方法来筛选表达阳性的克隆。

步骤四：表面蛋白分析1. 提取酵母菌细胞表面蛋白，可以使用化学方法或生物物理方法进行。

2. 利用蛋白质检测技术，如SDS-PAGE、Western blot等，对提取的表面蛋白进行分析。

这些技术可以确定表面蛋白的表达水平和分子量。

3. 进一步对表达的表面蛋白进行功能性分析，例如通过免疫沉淀、活性检测等方法来研究其与其他分子的相互作用。

步骤五：结果分析与验证1. 对表面蛋白的结果进行统计和分析，比较不同菌株或处理条件的差异。

2. 可以利用其他分析方法，如质谱分析、细胞免疫化学等，对酵母菌表面蛋白进行进一步的验证和鉴定。

需要注意的是，在进行酵母菌表面蛋白表达与分析的过程中，需要严格遵守实验室的安全操作规程，如佩戴手套、实验台下方放置密闭的垃圾袋、正确处理和消毒实验废液等，以确保实验的顺利进行和操作者的安全。

巴斯德毕赤酵母新型分泌表达载体构建

α文章编号:10083464(2003)01003704巴斯德毕赤酵母新型分泌表达载体构建韦宇拓,甘凤琼,苏华波,赵颖怡,汪嵘,黄日波(广西大学生物技术实验中心,广西南宁530005)摘要:巴斯德毕赤酵母分泌表达载体pP I C I NU 是利用来源于克鲁维酵母(K luy vero m y ces m arx ianus )的菊粉酶基因信号肽DNA 序列(ISP )构建的。

表达实验结果表明,带有分泌表达载体pP I C I NU 的Β-1,3-1,4葡聚糖酶基因重组菌,具有与带有表达载体pP I C 9K (带有Α因子信号肽)的Β-1,3-1,4葡聚糖酶基因重组菌相同的分泌效率。

关键词:巴斯德毕赤酵母;克鲁维酵母菊粉酶基因信号肽;分泌表达;Α因子信号肽中图分类号:Q 782 文献标识码:ACon struction of a novel secreti ng expression vectors for P ich ia p astorisW E I Yu tuo ,GAN Feng qi ong ,SU H ua bo ,ZHAO Y ing yi ,W AN G Rong ,HUAN G R i bo(B i o techno logy R esearch Cen ter ,Guangx i U n iversity ,N ann ing 530005,Ch ina )Abstract :T he secreting exp ressi on vecto r ,pP I C I NU con tain ing inu linase signal pep tide (ISP )from K luy vero m y ces s m a rx ianu ,of P ich ia p astoris w as con structed .T he exp ressi on resu lts show ed that the secreti on efficiency of the beta1,31,4glucanase of recom b inan t P .p astoris con tain ing p P I C I NU w as as h igh as that of recom b inan t P .p astoris harbo ring pP I C I 9K carrying Αfacto r p rep ro p ep tide .Key wards :P ich ia p astori ;signal pep tides of K luy vero m y ces s m a rx ianu inu linase ;secreting ex 2p ressi on ;Α-facto r p rep ro pep tide Bong 等研究中发现在克鲁维酵母(K luy vero m y ces m a rx ianus )中,大部分菊粉酶能被分泌到胞外,将其先导肽用在酿酒酵母中能促进多种外源蛋白分泌到胞外,分泌效率高于常用的Α因子信号肽[1]。

酵母表达系统

甲醇酵母系统的整合事件
YRp型载体：汉森系统传代不稳定，传代过程同源或非同源重组，高选择
压力迫使高拷贝数整合，可达100拷贝。 YIp型载体： A、在靶序列处线性化载体DNA，诱导同源重组 B、有“插入”和“取代”二类整合模式 C、主要为单拷贝整合，1-10%为多拷贝整合
毕赤酵母系统模式表达载体
4）甲醇利用表型
在分泌表达情况下，甲醇慢生长型更利于表达
5）mRNA5’端
mRNA5’端非翻译区（UTR）的组成与长度应尽量与AOX1/MOX的一致应尽量避免在UTR区出现AUG和次级结构
6）基因序列的AT含量
AT含量越高、越容易出现类似于终止子的结构
7）分泌信号
分泌表达效率与所用分泌信号高度相关
酿酒酵母信号肽特点
*保守性低，大多异源宿主系统的信号肽不能互用
*信号肽结构：
Met
信号肽剪切位点
正电荷区疏水区极性区目的蛋白
MF-α信号肽
*分泌效率高
*在酵母系统具有通用性
*88个残基组成
Met
KEX2 DAP DAP
-Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala-
DAP：STE13编码的二肽酶
真菌基因工程
一、真菌表达系统的优缺点二、酵母转化系统三、酵母表达系统四、丝状真菌表达系统
三酵母表达系统
酿酒酵母表达系统甲醇酵母表达系统其它酵母表达系统
（一）酿酒酵母表达系统
酿酒酵母系统启动子酿酒酵母分泌系统酿酒酵母糖基化系统酿酒酵母表达系统存在的问题
1、酿酒酵母启动子
UAS URS
组成的、复杂分支结构的现象。增加了免疫原性、对活性与药代稳定性均有影响。 *糖链组成

酵母菌表面展示操作步骤之筛选与鉴定效果

酵母菌表面展示操作步骤之筛选与鉴定效果酵母菌表面展示（Yeast Surface Display）是一种把外源蛋白质或肽链表达在酵母菌表面的技术。

该技术可实现酵母菌作为细胞工厂来展示多种不同的蛋白质，从而用于各种领域的研究和应用，如蛋白质工程、药物筛选、抗体发现等。

本文将介绍酵母菌表面展示的筛选与鉴定效果的操作步骤。

一、构建表达载体1. 选择合适的酵母菌表达系统，如常用的Saccharomyces cerevisiae（酿酒酵母）。

2. 获取目标蛋白质的基因序列，并设计适当的引物进行PCR扩增。

3. 将扩增得到的基因片段与酿酒酵母表达载体连接，产生酵母表达构建。

二、转化酵母菌1. 将表达构建转化到酿酒酵母细胞中。

2. 选择适当的培养基供酵母菌生长，如YPDA培养基。

3. 使用电穿孔或锂醋酸法将表达构建导入酵母细胞。

三、表达目标蛋白质1. 在含有糖、氮源以及其他必需物质的培养基中培养酵母细胞。

2. 优化培养条件，如温度、培养时间和含量参数，以提高目标蛋白质的表达量。

四、筛选与鉴定1. 根据目标蛋白质的性质，选择适当的方法进行筛选。

常用的方法包括：- 流式细胞术（FACS）：通过流式细胞仪筛选具有目标蛋白质表面展示的酵母细胞。

- 免疫沉淀：利用特异性抗体或亲和标签对表面展示的蛋白质进行沉淀，然后进行分析。

- 细胞接合：将表面展示目标蛋白质的酵母细胞与靶细胞进行接合，观察相应的识别与结合情况。

2. 筛选后，对得到的阳性克隆进行鉴定。

可通过PCR、Western blot或其他适当的方法分析目标蛋白质的表达与功能。

五、进一步改良与评估1. 对筛选到的阳性克隆进行进一步改良与优化，以提高目标蛋白质的展示效果。

2. 可进行亲和性和特异性的评估，如对目标蛋白质的亲和性进行测定，或测试其与特异配体的结合强度。

六、应用领域酵母菌表面展示技术广泛应用于以下领域：1. 蛋白质工程：通过酵母菌表面展示技术，可筛选出具有特定功能的蛋白质，如酶、抗体和受体分子。

酵母菌表面展示操作步骤之载体选择与处理

酵母菌表面展示操作步骤之载体选择与处理酵母菌表面展示技术是一种重要的蛋白质工程技术，通过将目标蛋白质表面展示在酵母菌表面，实现对蛋白质结构与功能的研究。

在进行酵母菌表面展示实验前，首先需要选择适合的载体并进行相应的处理，以确保实验的有效性和可靠性。

一、载体选择1. 载体特点选择合适的载体是酵母菌表面展示实验的基础。

常用的载体有具有酵母菌表面显示蛋白（Agα1、Agα2等）的质粒载体，这些载体能够在转染酵母菌中正确表达目标蛋白。

在选择载体时，要注意其拷贝数、选择标记和基因克隆位点等特点。

2. 载体构建根据实验需求，选择合适的方法构建载体。

可以选择克隆目标蛋白编码序列至载体中的表达元件，使用基因重组技术构建表达目标蛋白的载体。

二、载体处理1. DNA提取从载体中提取目标蛋白编码序列的DNA是进行酵母菌表面展示实验的前提。

可以使用商业化的DNA提取试剂盒进行操作，根据试剂盒使用指导书提供的步骤进行操作。

确保提取的DNA质量和纯度。

2. 酵母菌细胞处理将合适的酵母菌菌株培养至对数生长期，可以选择经过预处理的酵母菌菌株，如yS150或GS115菌株。

将酵母菌细胞取出，进行洗涤和离心以去除培养基和其他杂质。

3. 酵母菌细胞转染将处理好的酵母菌细胞与目标载体进行转染，以使目标载体能够进入酵母菌细胞内。

可以采用电穿孔法或化学转染法将目标载体导入酵母菌细胞中，使其自主复制并表达目标蛋白。

4. 转染后培养将转染后的酵母菌细胞进行培养，通常需要选择适当的菌落筛选培养基，如含有适当抗生素的培养基，以筛选出携带目标载体的转染细胞。

5. 载体鉴定对培养出的含有目标载体的菌落进行鉴定，可以通过PCR扩增和限制性内切酶切割等方法对菌落的DNA进行分析，以确认目标载体的存在和目标蛋白编码序列的正确性。

6. 蛋白表达条件优化对含有目标载体的酵母菌进行蛋白表达条件的优化，选择适当的培养基、培养条件和表达时间，以获得高产量的目标蛋白。

毕赤酵母常用培养基与载体

毕赤酵母常用培养基与载体一、毕赤酵母表达常用载体：典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。

此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。

当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。

毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。

而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。

分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。

胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。

工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。

毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。

其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。

多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。

含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。

体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。

多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE 电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。

酵母表达载体是什么？

酵母表达载体是什么？
结构组成及表达元件
来⾃pBR322基本⾻架含有该质粒复制起始位点(ori)，lacZ基因、bla或ampr、tetr等基因。

含有URA3、HIS3、LEU2、TRPl、LYS2与特定的宿主营养缺陷突变体互补筛选或利⽤zeocin、basticidin（杀稻瘟菌素）的抗性基因筛选。

启动⼦有GAP、AOXl、AUGl和GAL1等。

特点或优点
GAP是组成型启动⼦。

其余是诱导型启动⼦。

酵母表达载体多为穿梭载体：既可以在⼤肠杆菌中繁殖，获得⾜够的载体DNA进⾏体外操作，⼜可以在酵母中复制、表达和选择。

融合蛋⽩表达载体：于外源基因插⼊位点的C端或N端插⼊了1个6×His标签，或在5’端插⼊了α-因⼦作为分泌信号
备注
由于原核⽣物和真核⽣物存在糖基化、酰基化等翻译后修饰反应机制的差异，真核基因的原核表达难以获得有活性的蛋⽩。

酵母成为真核表达的⾸选系统。