高分辨率熔解曲线分析法之Snakback基因分型法

高分辨率熔解曲线分析法之Snakback基因分型法背景：DNA的发夹结构作为自身探针扩增用于PCR产物的分子分析。

在这之前实体分离或共价修饰的寡核苷酸荧光是必须的。

方法：我们用饱和染料LC Green做不对称PCR，40-45个循环，其中1条引物的5’端包括了一条尾巴，这条尾巴和其延伸引物互补，但这尾巴没有任何特别的共价修饰。

样品可以在LightsCycler的转子中快速的扩增，可以在96/384 模块加热PCR仪中进行高通量的扩增。

除了扩增扩增子的双链，通过引物尾巴的“弹回”及其延伸引物的杂交形成单链发夹结构。

在HR-1（毛细管）或Lightscanner（96/384孔板）上运行高分辨率熔解曲线。

结果：用弹回引物扩增的PCR产物在低温处显示两个发夹结构熔解峰，在高温处显示全部扩增子的熔解峰。

发夹结构的熔解温度与其长度（6-28bp）是线性相关，与环的大小成负相关。

我们可以轻松的将杂合突变和纯合突变进行基因分型。

用弹回探针对100个未知基因型的临床样本的F5 1691G>A进行基因分型，与之前的分型结果一致。

我们用2条弹回引物做不对称PCR，分析CFTR基因外显子10的2个范围，通过稀释产物形成分子内部杂合子进行基因分型，分出7种不同的基因型。

结论：弹回引物结合饱和染料基因分型的方法在闭管体系中，只用2条引物便可以提供一条特异的探针，此探针没有特殊的共价修饰。

在分子诊断学中，DNA的发夹结构是非常有用的工具，包括stem-loop探针和self-probing扩增。

stem-loop探针通常叫做“分子信标”，是一段共价修饰的核苷酸，一端末尾是荧光基团，另一端末尾是淬火剂。

self-probing扩增用于弹回单链构想多态性（SSCP）和蝎子引物。

弹回单链构想多态性SSCP逐渐用于在PCR产物中人工引入二级结构进行SSCP分析。

依赖于扩增序列，与引物尾巴互补的8-11bp序列弹回至其延伸产物上，形成了单链发夹结构，虽然弹回SSCP的引物没有共价修饰，电泳已经足够分离发夹结构。

蝎子引物5’端复杂延伸，包括一个探针元素，一对自己互补的茎干序列，一个荧光基团，一个淬光剂，一个阻止5’端延伸复制的拦截单体。

在分子内，蝎子比分子信标有些优势，因为杂交是快速的，且没有限制比率，与最快的PCR protocols 相同。

通过分子内的反应，发夹结构比较稳定，增加了5-15℃的熔解温度，这样的话序列变化比较高的时候，也可以分析比较短的范围。

此外，只需要2个寡核苷酸链，其中一个即作为引物又作为探针。

分子信标和蝎子引物是有独创性的方法，可以用于基因分型和real-time PCR，但是设计时比较复杂，合成及纯化限制了他们的应用。

代替共价修饰探针，在与DNA双链结合的情况下发出荧光的DNA染料可以用于real-time PCR和闭管操作基因型。

SYBR Green Ⅰ是普遍使用的，通过熔解分析可以增加特异性。

现在引入的高分辨率熔解曲线技术使得染料分析法变得比较有吸引力。

发明的新的染料可以将PCR产物中的异源双链核酸分子可靠的检测出，而且高分辨率熔解曲线分析仪器也已经出现。

熔解曲线的特异性探针分型是可能的，此方法用的是LC Green Plus和非标记探针，非标记探针是3’端封闭，阻止延伸。

合并非标记探针为弹回引物，弹回探针的优点是self-probing扩增避免了特殊共价修饰的费用及其复杂性。

方法与材料DNA样品PCR模板包括M13序列的工程质粒和人类基因组DNA。

在同一位置分别为A、C、G或T的其他相同的质粒由Lonza Rockland公司提供。

我们通过A260处的吸光度确定质粒的浓度，假定1.0的A260是50mg/L。

我们把相同摩尔数的质粒混合形成单个碱基的杂合子。

我们从提交到相关区域和大学病理学家的在MagNA Pure LC (Roche)基因分型F5（凝固因子5）的100个人类血样中提取DNA。

DNA的浓度没有定量，但是范围是20-40ng/L。

这些样品通过全球ARUP protocol（IRB 7275）分离确定F5 1691G>A 位点的基因型。

我们从Coriell医学研究所获得已知CFTR（囊性纤维化跨膜传导调节因子）突变的样品。

引物由犹他大学核心合成设施合成，用Trityl-ON 圆柱净化弹回引物。

PCR引物的序列，PCR产物和环的长度及双重的发夹结构见补充表1，伴随着这篇文章的在线版本：/content/vol54/issue10。

PCR和溶解曲线的采集PCR体系为10ul，模板为质粒，包含50mmol/L Tris、500mg/L牛血清蛋白，3 mmol/LMgCl2，200 umol/L脱氧三磷酸核苷，0.4单位的Klen Taq酶（AB Peptides），88ng的TaqStart 抗体（Clontech），0.5x LC Green Plus（Idaho Technology），0.5umol/L弹回引物，0.05umol/L的限制引物，106拷贝的质粒。

在LightCycler （Roche）做PCR，45个循环，95℃变性（0s），退火50℃（0s），之后以2℃/s的速率至延伸温度72℃，在72℃的时候停留8s钟。

PCR反应之后，毛细管样品变性94℃（0s），之后冷却到40℃。

温度转化速率为20℃/s，除非另作说明。

将样品从LightCycler移至高分辨率熔解仪器HR-1（Idaho Technology）,以0.3℃/s熔解。

我们按照上述的PCR条件扩增人类基因组DNA，下述除外。

微量滴定板用于PCR，模板浓度（F5）是2-4mg/ml，5mg/ml（CFTR）。

CFTR扩增是对称的，引物的加入量是0.5umol/L，反应体系为10ul（F5，384板）或者2ul（CFTR，96孔板），覆盖矿物油（Sigma）10-15ul，1500g离心3-5min，在PTC-200 PCR仪（Bio-Rad）上做PCR。

最初的变性温度是95℃3min，之后是95℃20s，58℃15s，72℃20s，40个循环（F5）；95℃15s，55℃10s，72℃15s（CFTR）。

PCR之后，用水稀释PCR产物（18ul每孔，10倍稀释），离心，在Lightscanner中加热至95℃，之后将样品拿出仪器，室温冷却至<40℃。

在熔解之前，离心所有的板子，之后在96或384的Lightscanner仪器上采集荧光信号，加热速率是0.15℃/s。

熔解曲线分析用定制软件或商业的LightScanner软件分析方法分析熔解曲线结果。

简略的说，在0%-100%标准化熔解曲线，减去指数背景，熔解曲线以与温度相对应的荧光信号的一阶导数点的形式显示。

结果图1显示的是弹回引物基因分型的原理图。

弹回引物包括5’端的尾巴，与其延伸的产物互补。

不对称PCR之后，形成分子内的发夹结构和分子间的扩增子的双链。

在饱和荧光染料存在的条件下，可以在与温度相对应的荧光信号的一阶导数熔解图上观察到弹回产物和扩增子产物的熔解峰。

发夹结构茎部的序列变化改变弹回图1：弹回引物和饱和DNA染料进行基因分型。

弹回引物是标准的寡核苷酸，在5’端包括一个探针元素与引物的延伸产物互补。

加入过量的弹回引物，做不对称PCR。

冷却过程，形成全长的扩增子以及过量的弹回链形成分子内的发夹结构。

熔解显示低温（弹回发夹）和高温（全长扩增子）过渡，指数背景减去了没有合并的引物的非特异性荧光。

探针元素的熔解提供了目的基因分型，然而扩增子的高分辨率熔解曲线分析随机的检测扩增子之内的变化。

双链的Tm值，允许通过熔解分析进行基因分型，与非标记探针法基因分型相似。

因物件的变化也会改变扩增子的熔解，可以用于突变扫描。

发夹结构和扩增子双链的相关数量可以通过限制引物的浓度及循环数调整。

弹回引物5’末端包括2bp的错配，阻止限制引物扩增的全长单链发夹结构3’端的延伸。

这增加了不对称PCR扩增的效率，增加了相对于扩增子的发夹结构的信号。

通过确定的质粒做PCR研究发夹结构环的大小，茎的长度及茎中单个碱基的错配。

图2显示的是用同样的发夹茎，发夹换和扩增子大小的效果。

扩增子增加了长度，其Tm值也随着增加了。

但是，随着扩增子和发夹环的增加，发夹结构的Tm值减少。

比较短的环导致比较稳定的发夹，在17-135bp的范围内显示定量的关系。

与相同序列非标记探针对比，弹回引物有34base的环，增加了大约10度的Tm值（数据没有显示）。

发夹结构与扩增子相比的荧光信号在扩增子长度为120bp时最大。

扩增子越长，发夹结构的荧光信号减少，特别是300bp以上。

图3A显示的是弹回茎部长度的Tm值的效果。

茎部与扩增子的相对荧光信号强度大于图2。

因为弹回引物5’端末端包含了2bp的错配，阻止次要的弹回产物的延伸。

茎的长度变化为8-20bp，和扩增子及环的长度有最小的变化。

惊奇的是，虽然8bp双链的长度小于20bp双链长度的一半。

但是，8bp的双链的信号与20bp双链的荧光信号相似。

补充图1显示扩展研究扩增子长度的为6-28bp。

Tm值与双链长度显示线性相关。

用12或20bp的双链区分杂合子和纯合子，比较容易区分杂合子（图3b）。

A:C错配的杂合子减少发夹结构的Tm值6-8℃。

图4证实的是弹回引物区分同一位置单个碱基变化的能力。

图4A显示的是不同的纯合子的对比。

完全配对的发夹结构（A:T）比A:G，A:A，A:C错配稳定。

此外，所有的杂合子可以容易的识别和分离（图4B）。

突变在茎的三分之一的单个碱基的基因型是最好区分的，突变在茎的末尾一般检测不到（没有显示）。

图2：不对称PCR之后弹回引物熔解环的效果通过一个普通的24bp探针元素，针对同一目标位点设计弹回引物在不同间距退火。

PCR产物的范围是102至322bp，Tm值变化范围为80-84℃，发夹环的长度为17-236bp。

显示的是全部的熔解曲线，包括发夹结构和扩增子的熔解图，其中发夹结构环的长度为17b（最粗的黑线），34b（较粗的黑线），88b（较细的黑线），135b（最粗的灰线），177b（较粗的灰线），236b（较细的灰线）。

曲线经过标准化，去除了指数背景，显示与温度相对应的荧光信号的一阶导数图。

发夹结构的Tm值随着环大小的增加而减少。

所有发夹结构双链的长度是24b，除了135b的环额外的互补成25bp的双链。

通过临近预测，不考虑环或最终错配的效果的方法校正25bp双链（水平线）的观测Tm值，稳定额外的碱基对。

环的大小17-135b显示的是对数线性关系。

图5和图6显示的是人类基因组DNA的弹回基因分型。

图5显示的是F5 1691G>A 在384孔板上对100个以前分过型的样品基因分型的结果。