高级分子生物学试题及答案

注意:每人答案务必不能完全一样

4．试述酵母双杂交系统的原理、构建及基本用途。(12分)

第一种答：酵母双杂交系统

★是一项专门用来研究蛋白质与蛋白质相互作用的技术，它首先由Fields S 和Song OK于1989年提出。这项新技术在验证已知蛋白质之间的相互作

用或筛选与特定靶蛋白呈特异性作用的候选蛋白的研究中已经得到了广

泛的应用。其可行性和有效性已被证实，并被推广到了诸如信号传导、细

胞周期调控、肿瘤基因表达等多个研究领域，受到越来越多的重视。

酵母双杂交系统的原理

★酵母双杂交系统技术使用蛋白质的两种具有特别功能的结构域：一种是与DNA结合的结合结构域（简称BD），另一种是激活DNA

转录的激活结构域（简称AD）。研究表明，这两种结构域并不需要一定

在同一个蛋白质上才起作用。事实上，一个含有BD的蛋白质在与另一个

含有AD的蛋白质结合以后就可以激活转录，该原理构成了酵母双杂交技

术的基础。

★在双杂交系统中，两种融合蛋白被表达：一种是目标蛋白—X，它有时被形象地称为诱饵蛋白。X在它的N-端与BD融合在一起；另一种

是潜在的能够与X结合的目标蛋白—Y。Y与AD融合在一起。如果X与Y

相互作用，那么XY的结合就形成一种完整的活性转录激活物。如此形成

的转录激活物能够驱动一个容易检测的报告基因的表达。于是，报告基因

的表达量可以用来作为测定X与Y相互作用的尺度。

酵母双杂交系统的建立

1.选择载体

2.将“诱饵”蛋白X的基因和目标蛋白Y的基因分别插入到BD

载体和AD载体之中，以形成BD-X和AD-Y融合蛋白

3.转染：使用特定的手段将重组后的BD-X载体和AD-Y载体转

染到特定的营养缺陷型酵母宿主细胞；

4.筛选：利用双营养缺陷型的恢复筛选出同时含有BD载体和

AD载体的细胞；

5.活性检测。

应用：

1. 发现新的蛋白质和蛋白质的新功能

2.在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用

3.筛选药物作用位点及药物对蛋白相互作用影响

4.建立基因组蛋白连锁图

第二种答：基本原理：酵母的转录活化因子GLA4含有两个功能结构域：氨基端的DNA结合结构域（BD）和羧基端的转录激活结构域（AD）。它们彼此分开时，各自仍具有各自的功能。Fields根据此特征设计了双杂交系统。（4）

构建过程：构建两个重组质粒：一个表达BD，另一个表达AD。如果在BD基因上再接上一个蛋白X基因，在AD基因上接上一个Y基因，将这两个质粒导入酵母菌中。这样，如果X、Y蛋白在酵母核内发生交互作用，则相当于将GAL4蛋白的BD和AD又重新连在一起，可以激活转录下游报告基因GAL1-lacZ的表达。通过测定β-半乳糖苷酶的活性来检测蛋白交互作用的发生。（6）

应用：检测蛋白与蛋白之间的相互作用。（2）

5.简述乳糖操纵子如何通过正负调控机制进行基因表达调控的?（共８分）

答：（1）阻遏蛋白的负调控：

①当细胞内有诱导物时，诱导物结合阻遏蛋白，此刻聚合酶与启动子形成开放式启动子复合物转录乳糖操纵基因

②当无诱导物时，阻遏蛋白结合与启动子与蛋白质部分重叠不转录

（2）CAP正调控：

①当细胞内缺少葡萄糖时，ATP-CAMP结合，CRP生成CAP与CAP位点结合，增强RNA聚合酶转录活性。

②当有葡萄糖存在时CAMP分解多合成少，CAP不与启动子上的CAP 位点结合，RNA聚合酶不与操纵子区结合无法起始转录,结构基因表达下降。

6.什么是miRNA以及它的特点及研究miRNA重要意义。(12分)

m iRNA是指微RNA，其长度通常为21nt~25 nt，由内源基因编码（如线虫体内发现的lin-4和let-7，长度分别为22 nt和21 nt），前体含有不完善的发夹结构，能够识别多个目标，通常与目标mRNA的3′-UTR结合，

从而阻止它们的翻译，但并不导致目标mRNA的水解。

概念：是广泛存在于真核生物中的一类内源性非编码小分子RNA，它是由约19~25个核苷酸组成。它本身不具有开放阅读框架(ORF) 。（2）

特点与意义：

（1）表达具有组织特异性和阶段特异性。即：在不同组织中表达有不同类

（2）型的miRNA,在生物发育的不同阶段里有不同的miRNA表达。（2）miRNA具有高度保守性，即各种miRNA都能在其他种系中找到同源体。（2）

（3）与靶mRNA 3’-UTR结合，序列特异性的在转录后水平调控基因的翻译表达。一些偏大的miRNA (27nt)可能参与了基因组的重组装。（2）

（4） miRNA独有的特征：其5’端第一个碱基对U有强烈的倾向性，而对G却有抗性，但第二到第四个碱基缺乏U，一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏C。（2）

（5） miRNA执行一定的生物学功能：在生长发育、信号转导、免疫调节、细胞周期、细胞的分化、增殖和凋亡以及肿瘤发生等方面发挥着重要作用。（2）

1、RNA干扰的发现和原理

RNA干扰是指通过双链RNA使目的mRNA降解，从而特异性地抑制目的蛋白表达的现象。

RNA干扰是普遍存在于真菌、植物、果蝇等各类真核生物之中的现象，类似于一种古老的免疫机制。

1990年，Napoli教授在研究矮牵牛花查尔酮基因时发现了基因共抑制现象（cosuppression）[1]。她在体外构建了控制矮牵牛花花色的基因查尔酮基因片段，连上花椰菜花叶病毒的35S启动子，连入农杆菌的T-DNA质粒，在矮牵牛花中过度表达。她原先预期，查尔酮的过度表达能加深牵牛花花色的紫色，但是结果却导致了矮牵牛花子代花色的褪色，内源性的查尔酮遭到沉默。Napoli教授把这一现象称之为内源性基因共抑制现象。

1998年，Andrew J. Hamilton教授研究了番茄ACC氧化酶基因的基因共抑制现象。他利用放射性标记法和放线菌酮处理法分析转录后ACC氧化酶基因的mRNA 和成熟mRNA。实验结果表明，外源重组基因片段能成功转录，但是mRNA成功转录出后，因为某种原因发生了转录后基因沉默（post transcriptional gene silencing PTGS）[2]。因此，Andrew J. Hamilton认为内源性基因共抑制现象属于转录后的基因沉默现象。1998年，Fire和Mello课题组接手了Guo教授研究的秀丽新小杆线虫发育过程中的一个关键基因par-1[3]的课题。他们以秀丽新小杆线虫为模型，发现在Guo 的课题中，引发线虫par-1基因沉默的是小片段的双链RNA[4]，而不是正义单链RNA或负义单链RNA。他们之后又研究了秀丽新小杆线虫的unc-22基因，进一步阐述了双链RNA在基因沉默中的作用，并创造性地使用了“RNA干扰”这个名词。

他们的研究成果激起了其他科学家研究RNA干扰现象的浓厚兴趣，由于他们的发现揭示了分子生物学中一个全新的，具有普遍性的机制，Andrew Fire, Craig C. Mello两位科学家因此在2006年获得诺贝尔奖

2. RNA干扰的原理

2.1 线虫中的RNA干扰模型