免疫组化技术-PPT课件
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组织化学技术
江苏大学 基础医学与医学技术学院
卢小东
组织化学的基本概念：
组织化学：组织水平，对组织内存在的各种物 质进行定性、定量以及其局部的和移动的部位分 析的方法
• 免疫组织化学：基于抗原抗体反应 • 酶组织化学
疾病的病理学研究概括起来主要在基因和蛋白 水平上进行的研究。
免疫组织化学方法主要用于基因蛋白质水平 表达的研究。
HRP
HE
AP
荧光标记：荧光素标记抗体 •异 硫 氰 酸 荧 光 素 （ Fluorescien isothioyarale, FITC）520－530nm •四甲基异硫氰酸罗达明（ Teramethyle rhodamine isothiecyanata, TRITC） 620nm •四 乙 基 罗 达 明 （ Teraethyle rhodamine B200, RB200）590－600nm
固定时间：8-24hr
组织大小：2*1.5*0.3cm
防脱片处理： 多聚-L-赖氨酸； 硫酸铬钾明胶液。
增强特异性染色的措施和方法：
1）蛋白酶消化：a、胰蛋白酶消化 （0.05-0.1%）； b、胃蛋白酶消化（0.4%）。 2）热诱导的抗原修复： 方法：微波960C, 10min； 直接加温方法 1000C, 10min； 高压锅 1200C, 10min； 热处理液：0.01mol/L PH6.0 柠檬酸缓冲液
免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞 的染色分布有三种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜 表面型。阳性细胞显色深浅可反映出抗原的浓度，并 以此作为定性、定量和定位的依据。
阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间 有明显间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而 是累及一片细胞，两者可显著区别。
染色 显色部位 显色定位 显色程度 特异性染色 特定细胞或间质 特定，具有结构性 非特异性染色 细胞和间质均匀染色或更强 无特定部位，无结构性
合适的抗体稀释度： 过高，过低均会导致阴性结果。 即用型抗体；
浓缩型。
减少或消除非特异性染色的方法： 非特异性染色： 原因： 方法：
对照： 阳性对照：用一直抗原阳性的切片与 待测标本同时进行免疫细胞化学染色，阳性对 照应呈阳性结果，即为阳性对照。 阴性对照：用不含一直抗原的标本作 对照，实验结果为阴性，即为阴性对照。阴性 对照中还包括空白对照、替代对照、吸收和抑 制对照等，用以排除假阳性结果。
垂体腺瘤 ACTH
乳腺癌 c-erbB-2
免疫组化
A细胞 B细胞
D细胞
上皮性肿瘤标记 上皮膜抗原（EMA）： 广泛分布于各种正常上皮细胞膜及肿瘤中。 癌胚抗原（CEA）：主要存在于胎儿消化道上皮， 胰腺以及绝大部分内脏癌。
前列腺特异性抗原（PSA）：
甲胎蛋白（AFP）： 甲状腺球蛋白（Tg）：
蛋白表达=> 分布，定位，定量； 蛋白表达与与肿瘤生物学行为及预后关系等
材料： •抗体： 多 克 隆抗 体 ：为 针 对多 个 抗原 决 定簇的抗 体，为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。
单克隆抗体：为一个 B 淋巴细胞分化增殖产 生的抗体，可识别有限的抗原决定簇，特异 性强。
显示物：
酶标反应：
S-P法（LSAB）： 采用生物素标记的第二抗体与链霉素生物素蛋 白连接的过氧化物酶及基质素（底物）混合液来测 定细胞和组织中的抗原。
EnvisionⅠ法（二步法）： 原理：第二抗体上标记有多聚物酶（HRP or AP）复合物与第一抗体结合。二抗上的多聚物可 结合许多的HRP分子，使信号有显著提高，敏感 性较PAP法，ABC法高出几十倍，背景因多聚物葡 聚糖是人体内不存在，无非特异性干扰，尤其是 多聚物酶分子结合的第二抗体孵育时间短，该方 法更省时，简便。
①碱性磷酸酶（Alkatine phasphotase,AP）
AP 与不同的底物（萘酚 As-Mx 、快蓝、快红）作 用 ， 可 形 成 不 同 颜 色 的 终 产 物 。 用 新 品 红 （ New fuchsine ）显色，可形成不溶于有机溶剂的红色沉 淀，不褪色。
②辣根过氧化酶(Horseradise peroaidase,) HRP：底物为DAB－四盐酸二氨基联苯胺，产生棕 色沉淀，不溶于有机溶剂，不褪色。
⑦以上每步后均用PBS液洗3×3min； ⑧用过氧化物酶基质液（DAB基质液）显色5－15min。 在光镜下观察。
⑨自来水冲洗，苏木素浅染，自来水冲洗还蓝， 梯度酒精脱水，干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。
免疫组化常见问题的处理：
组织材料的处理：
固定液为：10%中性福尔马林液； 4%多聚甲醛磷酸缓冲液（PH7.4）；
同一部位呈不同程度显 无分布规律，某一片均匀着 色 色
阳性细胞的染色特征： ①阳性细胞的染色分布有三种： 胞浆；细胞核；细胞膜表面 ②阳性细胞分布：灶性；弥漫性
③染色强度不一 ④切片边缘，刀痕or组织折叠，坏死，挤压区， 胶原结缔组织等常表现为相同的阳性染色强度。
对于阳性结果的定量判断： -，+，++，+++等分级和计数统计
以LSAB法为例简单介绍染色步骤： ①石蜡切片脱蜡－水； ②3%H202抑制内源性过氧化物酶15min； ③每张切片加10-20ul非免疫性动物血清，室温孵育 5min； ④加特异性一抗，370C孵育30－60min，or 40C过夜；
⑤加20ul生物素标记的第二抗体，370C ，30min；
⑥加过氧化物酶标定的链菌素亲生物素 ， 370C ， 30min；
胶体金：
源自文库
•指金的水溶胶（以微小粒子分散在水溶液中，
•免疫电镜观察
主要方法： •直接法： •间接法：经过了第二抗体放大效应 •PAP法：以过氧化物酶和抗过氧化酶抗体形成复合 物，通过第二抗体的桥接与第一抗体结合，然后以 酶底物反应检出。
•ABC法： 生物素（Biotin）和卵白素（Avidin）为具有高 度亲合性的物质，一个卵白素分子可结合4个生 物素。当生物素标上特定的标记物质后or与抗体 结合后仍能与卵白素结合，因此，将抗体结合上 生物素，然后与卵白素和带有特殊标记物的生物 素的结合反应，而以适当方式显示。
江苏大学 基础医学与医学技术学院
卢小东
组织化学的基本概念：
组织化学：组织水平，对组织内存在的各种物 质进行定性、定量以及其局部的和移动的部位分 析的方法
• 免疫组织化学：基于抗原抗体反应 • 酶组织化学
疾病的病理学研究概括起来主要在基因和蛋白 水平上进行的研究。
免疫组织化学方法主要用于基因蛋白质水平 表达的研究。
HRP
HE
AP
荧光标记：荧光素标记抗体 •异 硫 氰 酸 荧 光 素 （ Fluorescien isothioyarale, FITC）520－530nm •四甲基异硫氰酸罗达明（ Teramethyle rhodamine isothiecyanata, TRITC） 620nm •四 乙 基 罗 达 明 （ Teraethyle rhodamine B200, RB200）590－600nm
固定时间：8-24hr
组织大小：2*1.5*0.3cm
防脱片处理： 多聚-L-赖氨酸； 硫酸铬钾明胶液。
增强特异性染色的措施和方法：
1）蛋白酶消化：a、胰蛋白酶消化 （0.05-0.1%）； b、胃蛋白酶消化（0.4%）。 2）热诱导的抗原修复： 方法：微波960C, 10min； 直接加温方法 1000C, 10min； 高压锅 1200C, 10min； 热处理液：0.01mol/L PH6.0 柠檬酸缓冲液
免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞 的染色分布有三种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜 表面型。阳性细胞显色深浅可反映出抗原的浓度，并 以此作为定性、定量和定位的依据。
阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间 有明显间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而 是累及一片细胞，两者可显著区别。
染色 显色部位 显色定位 显色程度 特异性染色 特定细胞或间质 特定，具有结构性 非特异性染色 细胞和间质均匀染色或更强 无特定部位，无结构性
合适的抗体稀释度： 过高，过低均会导致阴性结果。 即用型抗体；
浓缩型。
减少或消除非特异性染色的方法： 非特异性染色： 原因： 方法：
对照： 阳性对照：用一直抗原阳性的切片与 待测标本同时进行免疫细胞化学染色，阳性对 照应呈阳性结果，即为阳性对照。 阴性对照：用不含一直抗原的标本作 对照，实验结果为阴性，即为阴性对照。阴性 对照中还包括空白对照、替代对照、吸收和抑 制对照等，用以排除假阳性结果。
垂体腺瘤 ACTH
乳腺癌 c-erbB-2
免疫组化
A细胞 B细胞
D细胞
上皮性肿瘤标记 上皮膜抗原（EMA）： 广泛分布于各种正常上皮细胞膜及肿瘤中。 癌胚抗原（CEA）：主要存在于胎儿消化道上皮， 胰腺以及绝大部分内脏癌。
前列腺特异性抗原（PSA）：
甲胎蛋白（AFP）： 甲状腺球蛋白（Tg）：
蛋白表达=> 分布，定位，定量； 蛋白表达与与肿瘤生物学行为及预后关系等
材料： •抗体： 多 克 隆抗 体 ：为 针 对多 个 抗原 决 定簇的抗 体，为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。
单克隆抗体：为一个 B 淋巴细胞分化增殖产 生的抗体，可识别有限的抗原决定簇，特异 性强。
显示物：
酶标反应：
S-P法（LSAB）： 采用生物素标记的第二抗体与链霉素生物素蛋 白连接的过氧化物酶及基质素（底物）混合液来测 定细胞和组织中的抗原。
EnvisionⅠ法（二步法）： 原理：第二抗体上标记有多聚物酶（HRP or AP）复合物与第一抗体结合。二抗上的多聚物可 结合许多的HRP分子，使信号有显著提高，敏感 性较PAP法，ABC法高出几十倍，背景因多聚物葡 聚糖是人体内不存在，无非特异性干扰，尤其是 多聚物酶分子结合的第二抗体孵育时间短，该方 法更省时，简便。
①碱性磷酸酶（Alkatine phasphotase,AP）
AP 与不同的底物（萘酚 As-Mx 、快蓝、快红）作 用 ， 可 形 成 不 同 颜 色 的 终 产 物 。 用 新 品 红 （ New fuchsine ）显色，可形成不溶于有机溶剂的红色沉 淀，不褪色。
②辣根过氧化酶(Horseradise peroaidase,) HRP：底物为DAB－四盐酸二氨基联苯胺，产生棕 色沉淀，不溶于有机溶剂，不褪色。
⑦以上每步后均用PBS液洗3×3min； ⑧用过氧化物酶基质液（DAB基质液）显色5－15min。 在光镜下观察。
⑨自来水冲洗，苏木素浅染，自来水冲洗还蓝， 梯度酒精脱水，干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。
免疫组化常见问题的处理：
组织材料的处理：
固定液为：10%中性福尔马林液； 4%多聚甲醛磷酸缓冲液（PH7.4）；
同一部位呈不同程度显 无分布规律，某一片均匀着 色 色
阳性细胞的染色特征： ①阳性细胞的染色分布有三种： 胞浆；细胞核；细胞膜表面 ②阳性细胞分布：灶性；弥漫性
③染色强度不一 ④切片边缘，刀痕or组织折叠，坏死，挤压区， 胶原结缔组织等常表现为相同的阳性染色强度。
对于阳性结果的定量判断： -，+，++，+++等分级和计数统计
以LSAB法为例简单介绍染色步骤： ①石蜡切片脱蜡－水； ②3%H202抑制内源性过氧化物酶15min； ③每张切片加10-20ul非免疫性动物血清，室温孵育 5min； ④加特异性一抗，370C孵育30－60min，or 40C过夜；
⑤加20ul生物素标记的第二抗体，370C ，30min；
⑥加过氧化物酶标定的链菌素亲生物素 ， 370C ， 30min；
胶体金：
源自文库
•指金的水溶胶（以微小粒子分散在水溶液中，
•免疫电镜观察
主要方法： •直接法： •间接法：经过了第二抗体放大效应 •PAP法：以过氧化物酶和抗过氧化酶抗体形成复合 物，通过第二抗体的桥接与第一抗体结合，然后以 酶底物反应检出。
•ABC法： 生物素（Biotin）和卵白素（Avidin）为具有高 度亲合性的物质，一个卵白素分子可结合4个生 物素。当生物素标上特定的标记物质后or与抗体 结合后仍能与卵白素结合，因此，将抗体结合上 生物素，然后与卵白素和带有特殊标记物的生物 素的结合反应，而以适当方式显示。