免疫组化技术-PPT课件

⑦以上每步后均用PBS液洗3×3min； ⑧用过氧化物酶基质液（DAB基质液）显色5－15min。 在光镜下观察。
⑨自来水冲洗，苏木素浅染，自来水冲洗还蓝， 梯度酒精脱水，干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。
免疫组化常见问题的处理：
组织材料的处理：
固定液为：10%中性福尔马林液； 4%多聚甲醛磷酸缓冲液（PH7.4）；
合适的抗体稀释度： 过高，过低均会导致阴性结果。 即用型抗体；
浓缩型。
减少或消除非特异性染色的方法： 非特异性染色： 原因： 方法：
对照： 阳性对照：用一直抗原阳性的切片与 待测标本同时进行免疫细胞化学染色，阳性对 照应呈阳性结果，即为阳性对照。 阴性对照：用不含一直抗原的标本作 对照，实验结果为阴性，即为阴性对照。阴性 对照中还包括空白对照、替代对照、吸收和抑 制对照等，用以排除假阳性结果。
垂体腺瘤 ACTH
乳腺癌 c-erbB-2
免疫组化
A细胞 B细胞
D细胞

上皮性肿瘤标记 上皮膜抗原（EMA）： 广泛分布于各种正常上皮细胞膜及肿瘤中。 癌胚抗原（CEA）：主要存在于胎儿消化道上皮， 胰腺以及绝大部分内脏癌。
前列腺特异性抗原（PSA）：
甲胎蛋白（AFP）： 甲状腺球蛋白（Tg）：
以LSAB法为例简单介绍染色步骤： ①石蜡切片脱蜡－水； ②3%H202抑制内源性过氧化物酶15min； ③每张切片加10-20ul非免疫性动物血清，室温孵育 5min； ④加特异性一抗，370C孵育30－60min，or 40C过夜；
⑤加20ul生物素标记的第二抗体，370C ，30min；
⑥加过氧化物酶标定的链菌素亲生物素 ， 370C ， 30min；
同一部位呈不同程度显 无分布规律，某一片均匀着 色 色
阳性细胞的染色特征： ①阳性细胞的染色分布有三种： 胞浆；细胞核；细胞膜表面 ②阳性细胞分布：灶性；弥漫性
③染色强度不一 ④切片边缘，刀痕or组织折叠，坏死，挤压区， 胶原结缔组织等常表现为相同的阳性染色强度。
对于阳性结果的定量判断： -，+，++，+++等分级和计数统计
S-P法（LSAB）： 采用生物素标记的第二抗体与链霉素生物素蛋 白连接的过氧化物酶及基质素（底物）混合液来测 定细胞和组织中的抗原。
EnvisionⅠ法（二步法）： 原理：第二抗体上标记有多聚物酶（HRP or AP）复合物与第一抗体结合。二抗上的多聚物可 结合许多的HRP分子，使信号有显著提高，敏感 性较PAP法，ABC法高出几十倍，背景因多聚物葡 聚糖是人体内不存在，无非特异性干扰，尤其是 多聚物酶分子结合的第二抗体孵育时间短，该方 法更省时，简便。
HRP
HE
AP
荧光标记：荧光素标记抗体 •异 硫 氰 酸 荧 光 素 （ Fluorescien isothioyarale, FITC）520－530nm •四甲基异硫氰酸罗达明（ Teramethyle rhodamine isothiecyanata, TRITC） 620nm •四 乙 基 罗 达 明 （ Teraethyle rhodamine B200, RB200）590－600nm
固定时间：8-24hr
组织大小：2*1.5*0.3cm
防脱片处理： 多聚-L-赖氨酸； 硫酸铬钾明胶液。
增强特异性染色的措施和方法：
1）蛋白酶消化：a、胰蛋白酶消化 （0.05-0.1%）； b、胃蛋白酶消化（0.4%）。 2）热诱导的抗原修复： 方法：微波960C, 10min； 直接加温方法 1000C, 10min； 高压锅 1200C, 10min； 热处理液：0.01mol/L PH6.0 柠檬酸缓冲液
①碱性磷酸酶（Alkatine phasphotase,AP）
AP 与不同的底物（萘酚 As-Mx 、快蓝、快红）作 用 ， 可 形 成 不 同 颜 色 的 终 产 物 。 用 新 品 红 （ New fuchsine ）显色，可形成不溶于有机溶剂的红色沉 淀，不褪色。
②辣根过氧化酶(Horseradise peroaidase,) HRP：底物为DAB－四盐酸二氨基联苯胺，产生棕 色沉淀，不溶于有机溶剂，不褪色。
免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞 的染色分布有三种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜 表面型。阳性细胞显色深浅可反映出抗原的浓度，并 以此作为定性、定量和定位的依据。
阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间 有明显间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而 是累及一片细胞，两者可显著区别。
染色 显色部位 显色定位 显色程度 特异性染色 特定细胞或间质 特定，具有结构性 非特异性染色 细胞和间质均匀染色或更强 无特定部位，无结构性
蛋白表达=> 分布，定位，定量； 蛋白表达与与肿瘤生物学行为及预后关系等
材料： •抗体： 多 克 隆抗 体 ：为 针 对多 个 抗原 决 定簇的抗 体，为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。
单克隆抗体：为一个 B 淋巴细胞分化增殖产 生的抗体，可识别有限的抗原决定簇，特异 性强。
显示物：
酶标反应：
胶体金：
•指金的水溶胶（以微小粒子分散在水溶液中，
•免疫电镜观察
主要方法： •直接法： •间接法：经过了第二抗体放大效应 •PAP法：以过氧化物酶和抗过氧化酶抗体形成复合 物，通过第二抗体的桥接与第一抗体结合，然后以 酶底物反应检出。
•ABC法： 生物素（Biotin）和卵白素（Avidin）为具有高 度亲合性的物质，一个卵白素分子可结合4个生 物素。当生物素标上特定的标记物质后or与抗体 结合后仍能与卵白素结合，因此，将抗体结合上 生物素，然后与卵白素和带有特殊标记物的生物 素的结合反应，而以适当方式显示。
组织化学技术
江苏大学 基础医学与医学技术学院
卢小东
组织化学的基本概念：
组织化学：组织水平，对组织内存在的各种物 质进行定性、定量以及其局部的和移动的部位分 析的方法
• 免疫组织化学：基于抗原抗体反应 • 酶组织化学
疾病的病理学研究概括起来主要在基因和蛋白 水平上进行的研究。
免疫组织化学方法主要用于基因蛋白质水平 表达的研究。