细胞培养实验技术手册

实验记录
24/2/2014
一、细胞培养
一、培养基的配制
a. RPMI 1640 1×（with L-glutamine）类培养基组分：RPMI ，10%FBS（胎牛血清），双抗生素（penicillin，盘尼西林（青霉素），streptomycin，链霉素）；
配制方法：500 ml RPMI(一瓶) + 50 ml FBS + 5 ml 双抗生素
b. DMEM 1×类培养基组分：DEMI，10% FBS，双抗生素；
配制方法：500 ml DMEM(一瓶) + 50 ml FBS + 5 ml 双抗生素
二、培养细胞RNA的提取
1.从培养箱中拿出6孔板（每孔培养2 ml），吸出培养液；
2.PBS清洗；用大枪管吸取PBS加入每个培养孔中（枪头不要触碰培养板，防止交叉污染），用1 ml枪吹匀清洗（把培养板倾斜，吸溶液指最高处打出）。

重复以上操作一次。

3. 每孔中加1 ml Trizol ，吸出放-80℃冰箱冷冻。

三、培养细胞DNA的提取
1.从培养箱中拿出6孔板（每孔培养2 ml），吸出培养液；
2.PBS清洗；用大枪管吸取PBS加入每个培养孔中（枪头不要触碰培养板，防止交叉污染），用1 ml枪吹匀清洗（把培养板倾斜，吸溶液至最高处打出）。

重复以上操作一次。

3. 向培养板中加酶消化（时间较长，放进培养箱，看到有白色悬浮后取出），取出加DMEM类培养基；
4. 吸出至1.5 ml 离心管，3600 rpm，4 min离心；
5. 吸出上清（不要触及沉淀），加PBS 1ml清洗，3600 rpm，4 min离心；
四、常用细胞系（人）
名称细胞类型来源核型培养液
A431 上皮型表皮细胞肿瘤非整倍体（76，XX）DMEM+10%FBS HeLa 上皮样宫颈癌非整倍体（81-83，XX）MEM+NEAA 10%FBS Hep G2 上皮样肝细胞癌非整倍体（55，XY）MEM+NEAA 10%FBS
MEM：极限必需培养液（Eagle）；NEAA：非必需氨基酸；DMEM：Dulbecco’s MEM改良培养液；RPMI：Roswell Park Memorial 研究所；BrdU：5-溴脱氧尿苷；APRI：腺苷磷酸核糖转移酶
实验室除snu系列与国产7721用1640培养基，其它用DMEM培养基。

五、原代培养----肝细胞
1.切除乳鼠肝脏组织放进小烧杯中，用PBS或培养液漂洗2-3次，去除血污；
2.加少量培养液，用剪子把组织剪碎，1 平方mm左右，再用吸管吹打；
3.加含10%小牛血清的1640培养液，制成均匀的细胞悬液，移入培养瓶，将组织块放在培养瓶底部，采用薄层营养液培养法，盖上瓶盖。

4.换液，只将旧的培养液吸弃，换上新的培养基。

六、传代培养
1.显微镜观察是否需要传代
细胞生长良好：上清液清亮，无悬浮物，折光性好，均质而透明，胞膜完整，胞内颗粒少，无空泡和脂滴。

细胞生长不良：悬浮物多，发差增大，胞膜不完整，胞质中颗粒多，出现空泡和脂滴。

2.贴壁细胞传代
①吸出瓶内旧培养液；
②用PBS轻缓漂洗细胞，两遍，小皿，2 ml，大皿，4 ml，尽量弃去旧培养液（防止消化液被稀释，造成效力下降）；
③向培养皿中加入适量胰蛋白酶，37℃2-3 min，（消化标准：细胞突起回缩，细胞间隙增大，细胞近乎圆形）；
④加入一定培养液（小皿1 ml,大皿2 ml），终止消化反应，反复吹打贴壁细胞，制成细胞悬液；
⑤传代/弃掉，剩余的细胞悬液加新的培养液，小皿4-5 ml,大皿10-12 ml;
⑥贴上细胞名称，代数，时间
3.悬浮细胞的传代
悬浮细胞不贴壁生长，传代时无需使用消化液处理；
悬浮细胞不贴附于支持物，胞体圆形，培养液中生长空间大，可长时间生长，便于做细胞代谢研究；
七、冻存细胞的复苏（提前开水浴箱37℃）
1.常用的冻存液：甘油，DMSO（二甲基亚砜，最常用，常温时对细胞有很强细胞毒作用，冻存过程中细胞代谢停止，不能发挥细胞毒作用）。

2.原则：快速融化，保证细胞外结晶在很短时间内融化，避免由于缓慢融化使水分溶入细胞内形成细胞内再结晶对细胞造成损伤；缓慢加液，加培养液时要慢，防止渗透压剧烈变化，造成细胞损伤；
加入冷的5-10倍的培养液充分稀释冻存液，以使DMSO对细胞的毒性作用降到最低点。

3.步骤：
①提前将恒温水浴箱调到37℃-42℃预热；取离心管、培养皿（酒精灯灭菌）；培养不同细胞，专管专用；
②将放在4℃冰箱平衡的细胞培养液拿出，用带有消毒水的纱布擦后放进超净台，瓶经灼烧后将盖拧松待用（避免开盖时间过长，PH改变）；
③在刻度离心管中加入5-6 ml 的培养液；
④从液氮中取出冻存管，用镊子夹其盖部，在37℃温水中快速摇动，管口不要遇水；
⑤冻存管迅速过火开盖，将底部细胞轻轻吹打起来，移至刻度离心管中；
⑥离心，离心对细胞不利，要低速离心，800-1000r/min, 3 min,实验室1200r/min,5 min; 在6 cm培养皿中加入培养液；
⑦离心完毕，离心管过火，将冻存液一次性倒进废液缸，管口过火，加入新鲜培养液，轻轻吹打，移至培养皿中；
⑧相差显微镜观察细胞的状况；复苏标准：1.折光性：健康细胞立体感强，细胞内颗粒少，非常透明，折光率高；2.细胞是否完整，细胞是否饱满。

八、细胞冻存：在体外培养细胞悬浮，加有冷冻保护剂（DMSO）的溶剂中，降至某温度，并在此温度长期保存。

原则：慢冻速融；缓慢冻存：可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶造成的细胞损伤；
冻存细胞：取10代以内为宜；
步骤：
1.配制冻存液；①30%血清+60%培养液+10%DMSO；②细胞不好培养时：90%血清+10%DMSO；
2.对数生长的贴壁细胞，弃去旧培养液，PBS洗两次；
3.加入胰酶消化，制成细胞悬液（悬浮生长则直接移至离心管中），800-1000 r/min离心5 min，弃上清；
4.加入冻存液，用吸管轻轻吹打，使细胞均匀，计数，冻存最终密度最少1×10的六次方；
5.按每管0.5-1 ml的量，将细胞悬液均匀装入冻存管，拧紧管盖；
6.标明冻存细胞名称，日期，操作者；
7.冻存直接关系到细胞复苏时的活力，分级冻存：4℃冰箱30min----转入-20℃冰箱30—60 min------转入-70℃--80℃冰箱过夜---------将冻存管放入-196℃液氮罐中保存；
注意事项：①冻存最好为对数生长期细胞，冻存前一天最好换一次液；②冻存和复苏最好用新的培养基；
③细胞低温保存的关键是0—20℃的处理（在此温度范围内，冰晶呈针状，极易导致细胞损伤）；④DMSO 无需灭菌（灭菌会破坏其分子结构导致降低冷冻效果）
九、收细胞
1.用枪将培养基吸弃；
2.1 ml PBS洗（一定要轻柔，防止将细胞吸去）用枪将弃液吸弃；
3.再加1 mlPBS吹打细胞，（因293T细胞是半贴壁细胞，不用胰酶消化）将细胞全部吸打到液体中；
4.将液体转入1.5 ml EP管，离心2000—3000 R，3—5 min;
5.用枪头吸净上清；
6.冷冻至-80℃冰箱；
若为贴壁细胞：1.将旧培养基吸弃；2.加胰酶消化细胞；3.加入新培养液中和胰酶；4.将液体转入1.5 ml EP 管，离心，弃上清；6.用1 ml PBS 清两遍，弃净上清；7.冻至-80℃冰箱；
二、提取RNA
一、工作台处理及RNA专用器材；用Erasol 处理工作台面；RNase-free 的枪头，EP管；
二、试剂准备
1.Trizol试剂；
2.氯仿（提RNA专用）；
3.异丙醇（提RNA专用）；
4.75%乙醇（DEPC水配制）；
5.高压处理的DEPC水：1000 ml双蒸水加入1 mlDEPC，37℃过夜，高压；
三、操作步骤
1.细胞处理：弃培养液，用预冷的PBS洗2遍，加入Trizol(小皿加1 ml,大皿加2 ml;关键步骤，含醋酸钠，在酸性环境RNA与蛋白质分离，DNA不分离，DNA与蛋白质被沉淀下来)，混匀，室温静置5 min;
2.反复吹打，将液体转入1.5 ml EP管中，加入0.2 ml氯仿，剧烈震荡15 S，静置5 min;
3.4℃离心，12000 g，15 min，样品分三层，取上清（注意不要吸到中间的白色层，否则易造成DNA污染）；
4.加入0.5 ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10 min;
5.4℃离心，12000 g 10min,弃上清；
6.加入1 ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃离心，8000 g 5min，弃上清；
7.冰上晾干，加入适量的DEPC水溶解（20 ul）；
8.取适量RNA进行浓度测定和电泳检样，剩余的RNA立即放-70℃冰箱保存；
评价RNA质量的标准是RNA的均一性和完整性
均一性：OD是光密度值，A是吸光值，是同一个意思；A260是核酸（RNA/DNA）最大吸光值的波长；A280是蛋白质最大吸光值的波长（A260/280比值可估计核酸纯度）；纯DNA的A260/A280是1.8，纯的RNA是2.0；比值太低说明有残留的蛋白质，比值过高说明RNA降解；
完整性：由于细胞中大部分RNA是rRNA，因此在理想的电泳图上能看到的条带有两个，28S、18S，且28S 是18S的两倍，如果RNA发生降解，则上述两条带变弱或消失，出现一条分子量很小的条带；
组织蛋白提取2014/4/2
RIPA
提取蛋白的lysis buffer: PI(蛋白抑制剂)
PMSF
把磨好的组织粉末加入2 ml离心管，加入200 ml lysis buffer,裂解30 min，12000 rpm离心。