血清学试验
梅毒螺旋体血清学试验常用方法
梅毒螺旋体血清学试验常用方法标题：深度解析梅毒螺旋体血清学试验常用方法梅毒螺旋体血清学试验是检测梅毒感染的常用方法之一，其结果对于梅毒的诊断有重要意义。
本文将深度解析梅毒螺旋体血清学试验的常用方法，包括其原理、操作流程、结果解读以及临床应用，并对梅毒螺旋体血清学试验的意义进行探讨。
1.梅毒螺旋体血清学试验的原理梅毒螺旋体血清学试验是通过检测患者血清中的抗梅毒螺旋体抗体来判断是否感染了梅毒。
常用的方法包括不同类型的血清学试验，如血浆凝集试验（RPR）、螺旋体血清凝集素试验（TPPA）和梅毒血清酶免疫吸附试验（EIA）。
这些方法可以检测患者的血清中是否含有特异性的抗梅毒螺旋体抗体，从而进行梅毒的诊断。
2.操作流程及常用方法梅毒螺旋体血清学试验的操作流程包括标本采集、标本处理、试剂配置、反应操作等步骤。
常用的方法包括RPR、TPPA和EIA。
RPR是一种快速筛查试验，可以在诊断初期进行使用，但其结果需要进一步确认。
TPPA是一种高度特异性的确认试验，可以用来确认疑似梅毒感染的患者。
EIA是一种定量检测方法，可以检测血清中特异性的抗体水平，有助于判断患者的感染程度。
3.结果解读及临床意义梅毒螺旋体血清学试验的结果需要进行准确解读。
阴性结果可以排除梅毒感染的可能，但也有假阴性的风险；阳性结果需要结合临床症状、病史及其他检测结果进行综合分析。
对于梅毒感染的患者，早期诊断和治疗至关重要，可以避免并发症的发生，同时也有助于阻断梅毒的传播。
4.个人观点和理解在进行梅毒螺旋体血清学试验时，我们需要充分理解不同方法的原理和操作流程，以确保结果的准确性。
梅毒螺旋体血清学试验的结果需要综合分析，结合临床情况进行判断，避免假阳性或假阴性结果的影响。
对于梅毒患者，及时的诊断和治疗对于控制疾病的传播和预防并发症的发生至关重要。
总结梅毒螺旋体血清学试验是诊断梅毒的重要方法之一，其结果对于患者的治疗和预后有重要意义。
通过深度解析梅毒螺旋体血清学试验的常用方法，我们可以更加全面地理解梅毒的诊断和治疗，为临床工作提供重要参考。
血清学试验
•
用已知免疫血清与细菌的可溶性抗原
接触，在有适量电解质存在时，于两液交
界面形成肉眼可见的白色沉淀环，来指示 抗原的存在。
抗原、抗体必须澄清
Ag
抗体比重大，可形成清晰的界面
Ab
• （三）荚膜肿胀试验
•
1.原理
•
用荚膜免疫血清（含抗体）与检材中细菌的荚膜抗原特异性
结合形成复合物，使荚膜呈肿胀现象。
•
2.方法
• （四）制动试验 • 原理 将特异性抗血清与相应运动活泼的细菌
悬液混合，则抗鞭毛抗体与鞭毛抗原结合，使 鞭毛强直、相互粘着而失去动力，细菌运动停 止，从而证明相应细菌的存在。 • 方法 将待检标本或增菌培养液1滴置于玻片 上，用显微镜观察细菌运动情况。再于待检标 本上加1滴适当稀释的抗血清，混匀，作悬滴 镜检。 • 结果 若滴加抗血清3～5分钟内，细菌运动停 止，菌体凝集成块为制动试验阳性；反之，滴 加抗血清后，细菌运动无改变为制动试验阴性。
•
（1）处理标本
•
标本用蒸馏水洗涤，接种于小鼠皮下，次日抽取皮下渗出液
（2）取洁净玻片一张，两侧各加待测 菌1～2接种环，于一侧加抗血清，另一 侧加正常兔血清，混匀；再于两侧各加 1％美蓝水溶液，加盖玻片，湿盒内室 温5～10分钟。
标本
（3）结果 阳性：试验侧为蓝色菌体周围可见界限清晰、厚薄不等的无 色环状物。对照侧无此现象。 阴性：试验侧与对照侧均不产生无色环状物为阴性。
• 原理
• （二）固相酶联免疫试验（ELISA）
• 1.基本原理 • ⑴使抗原和抗体结合到某种固相载体表面，并保持其
免疫活性。 • ⑵使抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或抗体，这
种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活 性。 • ⑶在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原） 和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗 原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的 抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载 体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加 如酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产 物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜 色反应的深浅进行定性或定量分析。
实验七 血清学试验
④结果判定 判定结果时用“+”表示反应的强度。 判定结果时用“+”表示反应的强度 表示反应的强度。 液体完全透明， ﹟：液体完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于 管底，振荡时，沉淀物呈片状、 管底，振荡时，沉淀物呈片状、块状或颗粒状 100％的菌体被凝集）。 （即100％的菌体被凝集）。 +++：液体略呈混浊， +++：液体略呈混浊，菌体大部分被凝集沉于管 振荡时情况如上（75％菌体被凝集）。 底，振荡时情况如上（75％菌体被凝集）。 ++：液体不甚透明，管底有明显的凝集沉淀，振 ++：液体不甚透明，管底有明显的凝集沉淀， 荡时有块状或小片絮状物（50％菌体被凝集）。 荡时有块状或小片絮状物（50％菌体被凝集）。 +：液体透明度不明显或不透明，有不甚显著的 液体透明度不明显或不透明， 沉淀或仅有沉淀的痕迹（25％菌体被凝集）。 沉淀或仅有沉淀的痕迹（25％菌体被凝集）。 液体不透明，管底无凝集， －：液体不透明，管底无凝集，有时管底可见有 一部分沉淀，但振荡后立即散开呈均匀混匀。 一部分沉淀，但振荡后立即散开呈均匀混匀。
2、琼脂扩散试验 称取1g琼脂粉 加至100ml 琼脂粉， ①琼脂板制备 称取1g琼脂粉，加至100ml 0.5% 石炭酸生理盐水中，煮沸使之溶解。 石炭酸生理盐水中，煮沸使之溶解。待温度降 55℃左右时浇玻板，厚约2 3mm左右 左右。 至55℃左右时浇玻板，厚约2～3mm左右。 在琼脂凝胶上打梅花孔，孔径为2mm， ②打孔 在琼脂凝胶上打梅花孔，孔径为2mm， 中间孔和周围孔间的距离大约为3mm。 中间孔和周围孔间的距离大约为3mm。 中间孔加炭疽沉淀血清， ③加样 中间孔加炭疽沉淀血清，周围孔中分别 加，炭疽沉淀抗原、待检抗原及盐水。 炭疽沉淀抗原、待检抗原及盐水。 将琼脂凝胶板放置湿盒中， 37℃ ④作用 将琼脂凝胶板放置湿盒中，于37℃扩散 24～72h，每天观察结果，观察三天。 24～72h，每天观察结果，观察三天。 抗原抗体扩散时， ⑤结果观察 抗原抗体扩散时，在两孔间比例最合 适的位置出现白色沉淀线， 适的位置出现白色沉淀线，出现白色沉淀线即 为反应阳性，不出现白色沉淀线为反应阴性。 为反应阳性，不出现白色沉淀线为反应阴性。
免疫检验考试辅导：血清学试验的特点
抗原抗体的特异性结合是指抗原分子上的抗原决定簇和抗体分子可变区结合的特异性，是由两者之间空间结构互补决定的。
抗原与相应抗体的结合具有高度的特异性，主要依靠抗原分子上的抗原决定簇和抗体末端可变区的氨基酸排列和立体构型，只有抗原决定簇的立体构型和抗体分子的立体构型完全吻合，才能发生反应。
如抗新城疫病毒的抗体只能与新城疫病毒结合，而不能与其他病毒结合。
但较大分子的蛋白质常含有多种抗原决定簇，如果两种不同的抗原之间含有部分共同的抗原决定簇，则发生交叉反应。
如肠炎沙门氏菌的抗血清能凝集鼠伤寒沙门氏菌。
一般来说亲缘关系越近，交叉反应的程度越高。
根据抗原抗体反应高度特异性的特点，在疾病诊断中可用抗原、抗体任何一方作为已知条件来检测另一未知方。
（二）敏感性
抗原抗体的结合还具有高度敏感性的特点，不仅可检测定性，还可以定量检测微量、极微量的抗原或抗体，其敏感度大大超过当前所应用的化学分析方法。
血清学试验的敏感性视其种类而异（表11－1）。
表11－1 血清学试验敏感性比较
测定方法
敏感性（每升）
双向免疫扩散试验
＜1mg
火箭电泳
＜0.5mg
对流电泳
＜0.1mg
免疫电泳
＜5～10mg
凝集试验
1μg
血凝抑制试验
0.1μg
补体结合试验
0.1μg
放射免疫分析法
＜1pg
酶联免疫吸附试验＜1ng
定量免疫荧光分析＜1pg
1 2 下页。
第九章血清学试验
第九章血清学试验§9-1血清学试验概述一、血清学试验的概念概念：抗原抗体反应是指抗原与相应的抗体之间发生的特异性结合反应。
因抗体主要存在于血清中，所以将体外发生的抗原抗体结合反应称为血清学反应或血清学试验。
在体内发生的抗原抗体反应是体液免疫应答的效应作用。
二、血清学试验的特点（一）特异性和交叉性（二）敏感性（三）可逆性（四）反应的二阶段性（五）最适比例与带现象（六）用已知测未知三、影响血清学试验的因素（一）电解质常用0.85%～0.9%（人、畜）或8%～10%（禽）的氯化钠或各种缓冲液（免疫标记技术）作为抗原和抗体的稀释液或反应液。
（二）温度在一定温度范围内，温度越高，加速抗原抗体结合和反应现象的出现。
（三）酸碱度血清学试验要求在一定的pH下进行，常用的pH值为6～8，（四）振荡适当的机械振荡能加速抗原抗体的结合反应（五）杂质和异物每批血清学试验都应设阳性对照和阴性对照试验。
四、血清学试验的应用及发展趋向（一）血清学试验的应用传染病、寄生虫病、肿瘤、自身免疫病、变态反应性疾病的确诊。
在动物疫病的群体检疫、疫苗免疫效果监测和流行病学调查。
生物活性物质的超微定量、物种及微生物鉴定和分型等方面。
基因分离，克隆筛选，表达产物的定性、定量分析和纯化等，已经成为现代分子生物学研究的重要手段。
（二）血清学试验的发展趋向反应的微量化和自动化方法的标准化和试剂的商品化技术的敏感特异和精密化检测技术的系列化方法简便快速。
§9-2凝集试验一、凝集试验的概念凝集试验：细菌、红细胞等颗粒性抗原，或吸附在红细胞、乳胶等颗粒性载体表面的可溶性抗原，与相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，经过一定时间，复合物互相凝聚形成肉眼可见的凝集团块，称为凝集试验（Agglutination test）。
参与凝集试验的抗原称凝集原，抗体称凝集素。
二、凝集试验的类型（一）直接凝集试验(Direct agglutination test)颗粒性抗原与相应抗体直接结合并出现凝集现象的试验称直接凝集试验。
血清学试验
2、胶乳凝集试验
3、协同凝集反应
抗体致敏载体，载体为金黄色葡萄球 菌A蛋白（SPA） SPA具有与IgG的Fc段结合的特性。
第三节 沉淀反应 （precipitation reaction)
可溶性抗原（如细菌的外毒素、内毒素、菌体 裂解液、病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出 液等）与相应的抗体结合，在适量电介质存在 下，形成肉眼可见的细微的白色沉淀。
第一节 血清学试验概述
二、特点
特异性与交叉性 敏感性 反应的可逆性 反应的二阶段性 最适比与带现象 用已知测未知
第一节 血清学试验概述
三、影响血清学试验的因素 电解质 温度 酸碱度 震荡 杂质和异物
第一节 血清学试验概述
四、应用及发展趋向
血清学试验在医学和兽医学领域已广泛应用，可 直接或间接从传染病、寄生虫病检出相应的抗原 或抗体。 血清学试验还广泛应用于生物活性物质的超微定 量、物种及微生物鉴定和分型等方面。 血清学试验也用于基因分离，克隆筛选，表达产 物的定性、定量分析和纯化等，已经成为现代分 子生物学研究的重要手段。
酶联免疫吸附试验（简称ELISA ）
将抗原或抗体吸附于固相载体的表面，酶标 记物与相应的抗体或抗原反应后，形成酶标 记抗原抗体复合物，在遇到相应底物时，结 合物上的酶催化底物产生水解、氧化或还原 等反应，从而生成可溶性或不溶性的有色物 质，可用肉眼或酶标测定仪判定结果。颜色 的深浅与相应的抗体或抗原量成正比，因此， 可根据颜色的深浅来定量抗体或抗原。
第三节 沉淀反应 （precipitation reaction)
可溶性抗原+相应抗体 肉眼可见的沉淀
第三节 沉淀反应 沉淀反应 （precipitation reaction)
血清学试验流程
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实验室血清学常用检测方法
常用血清学检测方法介绍一、酶联免疫吸附试验诊断技术目前，该项技术已在兽医学上得到广泛的应用，大多数动物传染病都已经研制成ELISA检测方法。
1、酶联免疫吸附试验的原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。
再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。
此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
2、ELISA的类型根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
用于动物疫病检测的ELISA主要有以下几种类型：①.双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法。
在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质、微生物病原体第二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。
例如猪瘟病毒检测ELISA、禽流感病毒抗原捕获ELISA，就是根据这种原理设计的。
②.双抗原夹心法测抗体反应模式与双抗体夹心法类似。
用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。
与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。
乙肝HBs的检测常采用本法。
本法关键在于酶标抗原的制备，需要根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于于间接法。
此外，该方法不受被检动物种属差异的限制。
③.间接法测抗体间接法是检测抗体常用的方法。
其原理为利用酶标记的抗体（抗免疫球蛋白抗体），检测与固相抗原结合的受检抗体（见图1）。
支原体肺炎血清学试验(测抗体)作业指导书
支原体肺炎血清学试验（测抗体）作业指导书1. 原理斑点反应板是固相MP抗原特异地与血清中抗MP抗体结合形成复合物，胶体金标记的抗人IgG或M、A抗体（试剂B）再与复合物结合，形成肉眼可见的红色圆斑。
2.标本采集2.1标本种类：血清2.2标本要求：新鲜，无溶血，无脂血。
2.3标本存放：室温﹤8小时，4℃—8℃存﹤48小时。
3.试剂组合3.1斑点反应板：40板，含固相MP抗原。
3.2试剂A：1瓶（～10ml）含TBJ缓冲液等。
3.3试剂B：1瓶（～6ml）含胶体金标记抗（IgG或IgM、A）。
3.4标本吸管：40支，每滴约50ml。
3.5阴阳性对照卡，一张。
4.操作方法4.1取出斑点反应板，室温10分钟。
4.2加试剂A（2滴）于反应板孔中，待充分吸入。
4.3用样品吸管加样品0.5ml（4滴）于反应板孔中，待体液充分吸入。
4.4去除蓝色过滤盖。
4.5加试剂B（3滴）于反应板孔中，待液体充分吸入。
4.6加试剂A（1～2滴）于反应板孔中，待液体吸入后观察结果。
5.结果判断：3分钟内与对照卡阴性阳性对照，读取结果。
6.操作性能：快速简便，特异性好，灵敏度高，重复性好。
7.结果处理7.1若结果失败，则重复测试，并作质控校正。
7.2若失控，则重检试剂盒。
8.方法局限性8.1溶血、脂血结果有影响。
8.2观察结果对弱阳性存在差异。
9.临床意义：肺炎支原体（MP）是引起呼吸道感染的常见病原微生物，它除可引起非典型肺炎外，常可引起呼吸道感染、气管炎、支气管炎、淋巴结炎，也可引起肺大泡、肺脓肿，另外，它还可引起其他系统并发症，如心肌炎、心包炎、脑膜炎、关节炎、胃炎、溶血性贫血等，由于MP对一般治疗肺炎的药物有耐药性，因此，及时进行检查有助于诊断及治疗。
本试剂可方便快速地检测血清中抗MP抗体（MP-A6），在临床上可作为支原体感染的辅助诊断，并可作为MP感染的流行病学研究的有效方法。
12 经典血清学试验
十二章经典血清学实验一、名词解释凝结性实验：按照是否产生凝结现象，用已知抗体或抗本来判定相应（未知）抗原或抗体的免疫反应。
凝集反应：细菌，红细胞等颗粒性抗原，或吸附在颗粒性载体表面的可溶性抗原，与相应抗体发生特异性反应，在适当电解质存在下，经过一段时光形成肉眼可见的凝集现象。
反应中的抗原称为凝集原，反应中的抗体称为凝集素。
直接凝集反应：颗粒性抗原与相应抗体直接发生特异性结合并浮上肉眼可见的凝集现象称为直接凝集反应。
间接凝集反应：将可溶性抗原（或抗体）吸附在一种与免疫无关的惰性载体颗粒表面，使其成为致敏载体，然后与相应抗体（或抗原）结合，在电解质存在的条件下发生凝集的现象。
葡萄球菌A蛋白（SPA）：是金黄色葡萄球菌的特异性表面抗原，能与IgG分子的Fc片段结合，当SPA-Ab与相应抗原结合时，就可产生协同凝集反应。
HA：有些病毒具有能凝集某种哺乳动物和禽类红细胞的特性，依此特性建立的检测主意称为病毒血凝实验。
HI：按照病毒的特异性抗体可以抑制血凝现象建立的检测主意称为血凝抑制实验。
沉淀反应：可溶性抗原与相应抗体结合，在适量电解质存在的条件下，形成肉眼可见的白色沉淀。
参加沉淀反应的可溶性抗原称为沉淀原，抗体称为沉淀素。
琼脂免疫蔓延：抗原，抗体在琼脂凝胶中蔓延，当二者在比例适当处相遇，即发生沉淀反应。
反应的沉淀物因颗粒较大，故在凝胶中不再蔓延，而形成沉淀带。
电泳：带电质点在电场中向着带异向电荷的电场移动。
免疫电泳：由琼脂双蔓延与琼脂电泳技术结合的实验。
凝集价/滴度/抗体效价：浮上50%以上凝集的血清最大稀释度为该血清的凝集价。
沉淀价：环状沉淀实验时，以浮上白色沉淀环的最高抗原稀释倍数作为沉淀素的效价，即沉淀价。
中和指数：在尽头法中和实验中，使病毒感染力减少至50%的血清中和效价称为中和指数。
中和效价：中和实验中，被检血清中抗体中和病毒的能力。
病毒的毒价：引起半数感染动物死亡的病毒最小量。
第1页/共5页二、简答题1.凝集反应和沉淀反应的基本类型有哪些？有何用途？2.凝集反应和沉淀反应的区别？（凝集反应和沉淀反应各有什么特点？）3.琼脂凝胶免疫蔓延实验有哪些不同的主意？举例说明它们的用途？抗原，抗体在琼脂凝胶中蔓延，当二者在比例适当处相遇，即发生沉淀反应。
血清学试验
微生物以及其他一些抗原性物质进入机体后，能在机体的血清中产生特异性抗体，。这种抗体与相应的抗原在体外相遇，可以表现出凝聚、沉淀、溶解、补体结合等多种反应，这些反应的试验都是采用免疫血清来进行的，所以称为血清学试验。现将其原理及其应用作简要介绍。
（ 2）试管法 在一系列的小试管中，加入等量的、不同稀释度的被检血清，最后一管以生理盐水代替血清，作为对照。在各试管中，再滴加等量细菌悬液，使均匀混合，置于水浴（ 52～ 55℃）保温约 4h后，观察结果，而后再置于 4℃冰箱中过夜，再观察结果。以最高稀释度血清管发生凝集者，为免疫血清的凝集效价。凝集效价越高，则说明抗体含量越多。
一、 抗原与抗体
（一）抗 原
凡能刺激机体产生特异性抗体，并能与所产生的抗体进行结合发生反应的物质，称为抗原。
1. 抗原的性质
（ 1）抗原一般为大分子胶体，相应分子质量在 10万以上。相对分子质量越大，抗原性越高。由于大分子胶体物质在机体内停留时间较长，因此能刺激机体产生抗体。
将微生物细胞或动物红血球的悬浊液与含有相应特异抗体的血清混合，可以在电解质（ 0.85%NaCL）溶液中发生反应，并出现肉眼可见的凝聚块，这种现象，就叫凝聚反应。参与反应的微生物细胞或血球等，称为凝集原，免疫血清中的特异抗体，称为凝集素。
1. 试验方法
（ 1）玻片法 吸取一滴经生理盐水（ 0.85%NaCL）稀释的免疫血清置于玻片上，另加一小滴细菌悬液（用生理盐水制成的菌液）。使之充分混合，在几分钟内，即可出现凝集现象。同时以生理盐水代替免疫血清作对照。
有关免疫电泳的应用，由于具体操作上的不同，还有其他多种方法，例如“火
箭”免疫电泳、交叉免疫电泳等等。
2. 沉淀反应与凝聚反应的区分
血清学试验
凝集滴度，即一个凝集单位。如表18-1-1的病毒血凝滴度为27， 即将病毒原液作27倍稀释，其中含一个血凝单位的病毒。 ❖ 由于病毒血凝抑制试验中需要的病毒液应含4个血凝单位，因此， 需要对原病毒液进行25倍稀释。
补体结合试验
试验系统、原理和结果判定
反应系统
指示系统
反应结果的判定
已知抗原 （抗体）
补体
绵羊红 细胞
如溶血则 为阴性
待检血清 （抗原）
溶血素
如不溶血 则为阳性
中和试验
概念：根据抗体能否中和病毒的感染性而建立的免疫
学试验。
原理：病毒与抗血清中抗体特异结合后失去感染易感
动物、鸡胚或细胞活性。
举例
一种抗原成分出现一条沉淀
带。如两个相邻孔之间抗原
相同，则沉淀带融合，如1、
2；抗原不同，则互相交叉，
如3；部分相同则部分融合，
另外不同部分则交叉，如4。
免疫电泳
免疫电泳技术是把凝胶扩散 试验与电泳技术相结合的免 疫检测技术。即将琼脂扩散 置于直流电场中进行，让电 流来加速抗原与抗体的扩散 并规定其扩散方向，在比例 合适处形成可见的沉淀带。
抗 补 体 抗 体
抗补体法
酶标抗体技术
原理：将酶分子标记在抗体或抗原分子上， 利用抗原抗体反应的特异性及酶的高催化活 性进行检测。
用于标记的酶：辣根过氧化物酶 （HRP）、碱 性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。
酶标抗体技术分类
免疫酶组织化学染色技术 酶联免疫吸附试验 斑点-酶联免疫吸附试验
酶联免疫吸附试验
用已知测未知
第一节 血清学试验概述
第十一章血清学试验第一节血清学试验概述一、血清学试验的概念抗原抗体反应是指抗原与相应的抗体之间发生的特异性结合反应。
它既可以发生在体内，也可以发生在体外。
在体内发生的抗原抗体反应是体液免疫应答的效应作用。
体外的抗原抗体结合反应主要用于检测抗原或抗体，用于免疫学诊断。
因抗体主要存在于血清中，所以将体外发生的抗原抗体结合反应称为血清学反应或血清学试验。
血清学试验具有高度的特异性，广泛应用于微生物的鉴定、传染病及寄生虫病的诊断和监测。
二、血清学试验的特点（一）特异性和交叉性抗原抗体的特异性结合是指抗原分子上的抗原决定簇和抗体分子可变区结合的特异性，是由两者之间空间结构互补决定的。
抗原与相应抗体的结合具有高度的特异性，主要依靠抗原分子上的抗原决定簇和抗体末端可变区的氨基酸排列和立体构型，只有抗原决定簇的立体构型和抗体分子的立体构型完全吻合，才能发生反应。
如抗新城疫病毒的抗体只能与新城疫病毒结合，而不能与其他病毒结合。
但较大分子的蛋白质常含有多种抗原决定簇，如果两种不同的抗原之间含有部分共同的抗原决定簇，则发生交叉反应。
如肠炎沙门氏菌的抗血清能凝集鼠伤寒沙门氏菌。
一般来说亲缘关系越近，交叉反应的程度越高。
根据抗原抗体反应高度特异性的特点，在疾病诊断中可用抗原、抗体任何一方作为已知条件来检测另一未知方。
（二）敏感性抗原抗体的结合还具有高度敏感性的特点，不仅可检测定性，还可以定量检测微量、极微量的抗原或抗体，其敏感度大大超过当前所应用的化学分析方法。
血清学试验的敏感性视其种类而异（表11－1）。
表11－1 血清学试验敏感性比较（三）可逆性抗原与抗体的结合是分子表面的结合，这种结合是可逆的，结合条件为0℃～40℃、pH4～9。
如温度超过60℃或pH降到3以下，或加入解离剂（如硫氰化钾、尿素等）时，则抗原抗体复合物又可重新解离，并且分离后抗原或抗体的性质仍不改变。
免疫技术中的亲合层析法，常用改变pH和离子强度促使抗原抗体复合物解离，从而纯化抗原或抗体。
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酸碱度：血清学反应通常用pH6～8，过酸或过碱都可使
复合物解离，pH值在等电点时，可引起非特异凝集。
振荡：适当的机械振荡能增加分子或颗粒间的相互碰撞，
加速抗原抗体的结合反应，但强烈的振荡可使抗原抗体 复合物解离。
杂质和异物：试验介质中如有与反应无关的杂质、异物
存在时，会抑制反应的进行或引起非特异性反应。
原理：将荧光色素标记在抗体或抗原上，与相应的
抗原或抗体特异性结合后，用荧光显微镜观察所标 记的荧光，以分析示踪相应的抗原或抗体的方法 。
荧光素：荧光色素是能产生明显荧光，又能作为染
料使用的有机化合物。最常用的是异硫氰酸荧光素 (FITC)。
荧光抗体染色
染色方法
荧光素
抗抗体
抗 补 体 定
反应系统 已知抗原 （抗体） 待检血清 （抗原）
指示系统
绵羊红 细胞 溶血素
反应结果的判定 如溶血则 为阴性
如不溶血 则为阳性
补体
中和试验
概念：根据抗体能否中和病毒的感染性而建立的免
疫学试验。
原理：病毒与抗血清中抗体特异结合后失去感染易
感动物、鸡胚或细胞活性。
两种不同的抗原之间
含有共同的抗原决定
其他抗体相结合。
簇，则发生交叉反应 。
反应的二阶段性
第一阶段
抗原与抗体的特异性结 合阶段，此阶段反应快、 仅数秒至数分钟，但不 出现可见反应。
第二阶段
抗原抗体复合物出现可 见反应阶段。此阶段反 应慢、需数分钟、数十 分钟或更久。
敏感性
抗原抗体的结合还具有高度敏感
最适比例与带现象
前 带
后 带
可逆性
抗原与抗体的结合是分子表面的结合，这种
结 合 是 可 逆 的 ， 结 合 条 件 为 0℃ ～ 40℃ 、
pH4 ～ 9 。如温度超过 60℃或 pH 降到 3 以下，
或加入解离剂时，则抗原抗体复合物又可重
新解离，并且分离后抗原或抗体的性质仍不
改变。
用已知测未知
以能使100%红细胞不发生凝集的血清最大稀释倍数为该血清的HI 滴度，以2的指数表示。
沉淀试验的概念
可溶性抗原与相应
的抗体结合，在适 量电解质存在下， 经过一定时间，形 成肉眼可见的白色 沉淀，称为沉淀试 验。
沉淀试验的类型
环状沉淀试验 琼脂凝胶扩散试验 免疫电泳
环状沉淀试验
方法：在小口径试管中进行。
1.样本稀释
2.加样 3.温育 4.洗涤 5.加酶标二抗 6.温育
7.洗涤
8.加底物 9.避光显色 10.终止反应 11.结果测定
所有的血清学试验都
是用已知抗原测定未
知抗体，或用已知抗
体测定未知抗原。
影响血清学试验的因素
电解质： 血清学反应须在适当浓度的电解质参与下，
才出现可见反应。0.9%氯化钠溶液。8-10%
温度： 在一定温度范围内，温度越高，抗原、抗体
分子运动速度越快，这可以增加其碰撞的机会，加速 抗原抗体结合和反应现象的出现 。
血清学试验的类型
凝集试验
沉淀试验 补体结合试验 中和试验 免疫标记技术
凝集试验的概念
细菌、红细胞等颗粒性抗原，或吸附
在红细胞、乳胶等颗粒性载体表面的
可溶性抗原，与相应抗体结合后，在 有适量电解质存在下，经过一定时间， 复合物互相凝聚形成肉眼可见的凝集 团块，称为凝集试验。
凝集试验的类型
举例
IBDV
9～11d鸡胚
24～48h 鸡胚死亡 鸡胚不死亡
IBDV +抗血清
9～11d鸡胚
免疫标记技术
抗原与抗体结合了，但复
合物小，不能通过凝集或 沉淀用肉眼观察到。
该怎么办？
将抗体或抗原联结在一个特定
的易于检测的物质上，通过检
测特定物质的存在，间接反映 抗原抗体发生了结合。
荧光抗体标记技术
间接凝集试验
概念：
将可溶性抗原或抗体与载
类型：
间接血凝试验 乳胶凝集试验 协同凝集试验
体连接后，再与相应的抗 体或抗原作用，所出现的 特异性凝集反应为间接凝 集试验。
间接血凝试验原理
红细胞
抗原
致敏红细胞
被检抗体
致敏红细胞
红细胞凝集
凝集强度判定 ＋ （100%红细胞凝集）：边缘不整齐，有红色颗粒布满孔底） ± （50%红细胞凝集）V型孔：孔底可见红色颗粒，中央有少量 红细胞沉淀 － 红细胞呈点状沉于孔底，无红色颗粒。 能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数，为该病毒的红细胞 凝集滴度，即一个凝集单位。如表18-1-1的病毒血凝滴度为27， 即将病毒原液作27倍稀释，其中含一个血凝单位的病毒。 由于病毒血凝抑制试验中需要的病毒液应含4个血凝单位，因此， 需要对原病毒液进行25倍稀释。
原理：试管内，下层沉淀素与
上层沉淀原在液界面应形成白 色沉淀环。
用途：主要用于抗原的定性试
沉淀原
白色沉淀环
沉淀素
验，如炭疽杆菌的 Ascoli 试验、 链球菌的血清型鉴定、血迹鉴 定等。
琼脂凝胶扩散试验
原理
1%琼脂凝胶孔径为 85nm，能使许多可溶性抗
原与抗体在凝胶中扩散。当抗原与抗体在凝
胶中的一定位置上相遇时，则两者结合形成
沉淀线。
琼脂凝胶扩散试验类型
单向单扩散
单向双扩散
双向单扩散
双向双扩散 方法 用途
双向双扩散方法
此法系采用1%琼脂倒于平皿或玻片上，
制成凝胶板，可按需要打孔。将抗原、
抗体分别滴入孔内，放置湿盒中，在
37˚C湿箱中24-72h后观察。
双向双扩散用途
试验方法 间接法：用于测定 抗体 夹心法：用于测定 大分子抗原 双夹心法：用于测 定大分子抗原
酶联免疫吸附试验应用
目前已广泛于应用多种细菌病和病毒病
的诊断和检测。如猪传染性胃肠炎、鸡
新城疫、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬
病、蓝舌病、蓝耳病、猪瘟、口蹄疫等 传染病的诊断和抗体监测常用此技术。
方法：
抗原的比较和鉴定：在抗原 与抗体孔间形成沉淀带。每 一种抗原成分出现一条沉淀 带。如两个相邻孔之间抗原 相同，则沉淀带融合，如1、 2；抗原不同，则互相交叉， 如3；部分相同则部分融合， 另外不同部分则交叉，如4。
免疫电泳
免疫电泳技术是把凝胶扩散
试验与电泳技术相结合的免 疫检测技术。即将琼脂扩散 置于直流电场中进行，让电 流来加速抗原与抗体的扩散 并规定其扩散方向，在比例 合适处形成可见的沉淀带。
性的特点，不仅可检测定性，还 可以定量检测微量、极微量的抗
原或抗体。
抗原与抗体结合，其比例适当时才可出现肉眼可见反应。抗体 除IgM是5价，SIgA 4价外，一般抗体都含有两个结合位点（二 价）；抗原则根据分子大小，有10～50个不等的结合点。当抗 原抗体比例适当时，两者结合后，尚有未饱和的结合点，可以 继续与游离的抗体、抗原或与抗原抗体结合物的未饱和点相联 结，逐渐形成愈来愈大的复合物，出现了肉眼可见反应。比例 最适合，出现反应最快，反应产物愈多。 如果抗原或抗体过多，抗体和抗原结合点的聚合一开始时即达 到饱和，形成小的复合物则不能继续与相邻抗原、抗体结合， 不出现可见反应，谓之带现象。
方法：在试管中进行。 特点：准确、耗时。 用途：定量试验，如
诊断布氏杆菌病，测 定抗体的凝集价。
结果判定 结果用“+”表示反应强度。 ++++：液体完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底。
+++ ：液体透明，菌体基本被凝集沉于管底。
++ ：液体不甚透明，管底有明显的凝集沉淀。 + ：液体透明度不明显或不透明，有不明显的沉淀或有沉淀的痕迹。 — ：液体不透明，呈均匀混浊，管底无凝集。有时有少量菌体集中于管底中 心，呈脐状，但振摇时，立即散开呈均匀浑浊。 以出现“++”的最高血清稀释倍数即为该份血清的效价，又叫凝集价。大动物 （马，牛，骆驼等）以凝集价1：100以上判为阳性，1：50的凝集价判为可 疑。中小动物（猪，羊，狗等）以凝集价1：50以上判为阳性，1：25的凝集 价判为可疑。 如对照管不符合要求时，试管须废弃重做。
抗体
抗 原 直接法
间接法 抗补体法
酶标抗体技术
原理：将酶分子标记在抗体或抗原分子上，
利用抗原抗体反应的特异性及酶的高催化活
性进行检测。
用于标记的酶：辣根过氧化物酶（HRP ）、碱
性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。
酶标抗体技术分类
免疫酶组织化学染色技术 酶联免疫吸附试验 斑点-酶联免疫吸附试验
直接凝集试验
间接凝集试验
直接凝集试验
概念：颗粒性抗原与相应抗体在电解质的
参与下，直接结合，凝集成团的现象，
称直接凝集试验。
类型：按其操作方法可分为玻片法和试管
法。
1．玻片凝集试验
方法：在玻璃板或瓷
片上进行。 特点：简单、快速。 用途：定性试验，如 细菌鉴定、血型鉴定 等。
2．试管凝集试验
酶联免疫吸附试验
原理
通过化学方法将酶与抗体结合
起来。酶标记后的抗体仍然保 持着能与相应抗原结合的免疫 学活性及酶的催化活性。酶标 抗体与抗原结合后，形成酶标 抗体-抗原复合物。复合物上的 酶，在遇到相应的底物时，催 化底物分解，使底物中的供氧 体由无色的还原型变成有色的 氧化型，呈现颜色反应，用肉 眼或酶标仪判定结果。
血清学诊断
血清学试验的概念
由于抗体主要存在于
血清中，所以将体外