茶叶多酚氧化酶活性测试

江南大学-食品化学实验讲义茶葉多酚氧化酶的活性測定

茶葉多酚氧化酶的活性測定

一、目的要求

通過實驗，掌握茶葉多酚氧化酶活性的測定方法。

二、基本原理

茶葉多酚氧化酶是茶樹體內最重要的酶類之一，它不僅在茶樹生理代謝

過程中起著重要作用，而且在茶葉加工，尤其在紅茶製造過程中，催化

多酚類物質的氧化也起著主導作用。

多酚氧化酶的活性檢測方法，包括檢壓法、分光光度法、氧電極法和滴

定法等。多酚氧化酶是一種含銅的氧化酶，在一定的溫度、pH條件下，

有氧存在時，能使催化鄰苯二酚氧化生成有色物質，單位時間內有色物

質在460nm處的吸光度與酶活性強弱成正相關，即可計算出多酚氧化酶

的活力和比活性。反應式如下：

多酚氧化酶

鄰苯二酚（兒茶酚）＋1∕2 O2——————→ 鄰醌＋ H2O

三、材料、儀器及試劑

1、材料：茶樹鮮葉。

2、儀器：721型分光光度計；離心機；恆溫水浴；研缽或勻漿機；試管；移液管；紗布袋等。

3、試劑：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；0.1M磷酸緩衝液（pH6.5）；硫酸銨；1%鄰苯二酚溶液；0.1%脯氨酸溶液；6M尿素溶液或20%三氯醋酸。

四、操作步驟

1、粗酶液的製備

稱取洗盡茶樹鮮葉5.0g於研缽（或勻漿機）中，加入2g 不溶性聚乙烯吡

咯烷酮（事先用蒸餾水浸洗，然後過濾以除去雜質）和100ml 0.1M pH6.5磷酸緩衝液,磨成勻漿，用幾層紗布袋過濾，濾液加入30%飽和度硫酸銨，

離心除沉澱，上清液再加硫酸銨使達60％飽和度，離心收集沉澱。將所

得沉澱溶於2~3ml 0.1M pH6.5磷酸緩衝液中，即為粗製酶液。

2、活性酶的測定

取酶液1ml於離心管中，加入3ml反應混合液（2.0ml 0.1M pH6.5磷酸緩

衝液，0.6ml 1%鄰苯二酚溶液；0.4ml 0.1%脯氨酸溶液），在37℃恆溫水

浴中保溫10min，立即加入6M尿素溶液3ml或20%三氯醋酸1ml終止反應。 4000rpm離心10min。取上清液，用1cm比色皿，在460nm波長處，在1~2min內測定吸光度值（A）。空白對照用緩衝液代替反應液中的鄰

苯二酚，其它條件相同。

五、酶活性的計算

以每克樣每分鐘內A460增加0.1為1個酶活力單位。

A460×酶提取液總量（ml）

酶活力（0.1A?g-1?min-1）＝——————————————————————————

0.1×反應時間（min）×樣品鮮重（g）×測定時酶液用量（ml）

六、注意事項

1、反應混合液必須現配現用，否則會因鄰苯二酚自動氧化而失效；鄰苯

二酚還可用兒茶素代替。

2、脯氨酸是用作有色氧化產物形成的穩定劑和加速劑。