亲和层析技术要点

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亲和层析的特点
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高度特异性
高效能 操作简便
亲和层析
快速 亲和力缓和
应用广泛
通用性差，洗脱不缓和
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亲和层析基本过程
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配基固定化 (Immobilise)
基质Matrix(载体):亲和层析中与配基共价结 合,使其固相化的物质。
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吸附 (Adsorption)
洗脱 (Elution )
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平衡 equilibration
上样 Sample applic.
洗涤 wash
洗脱 elution
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层析柱堵塞
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❖可能原因：细胞碎片
❖解决方案：离心或者用0.22μm的滤膜过滤 发酵液
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样品黏度太大？
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❖可能原因：宿主细胞的核酸含量太高
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1
亲和层析技术概述
2
亲和层析基本过程
3
His-tag亲和层析常见问题
4
Tips
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亲和层析技术概述
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❖What is Affinity Chromatography?
▪ 亲和层析是利用生物体中多数大分子物质具 有与某些相应的分子专一性可逆结合的特 性而建立的分离纯化技术
失；
❖5. 在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂，比 如0.1-1mM的PMSF，防止目的蛋白被降解；
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❖6. 缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏 水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达 50%（v/v）
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亲和层析发展史
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1910
1955
1967
用淀粉装柱 来分离淀粉 酶——第一 次认识到亲 和层析
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聚苯乙烯载 体连接上抗 原，分离血 液中相应的 抗体
琼脂糖载体取代聚苯 乙烯载体，使亲和层 析得到高速发展，成 为“第二大类”分离 纯化手段，应用广泛 ，亲和对众多。
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常见问题
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1 纯化的组分中没有 His标签的蛋白?
2
层析柱堵塞？
3
样品黏度太大？
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一、His标签蛋白没有结合上，都流穿了
❖ 可能原因1：超声的功率不对(太大，蛋白炭化， 太小，蛋白没有释放) 策略：改变超声功率，并在超声前加入溶菌酶
❖ 可能原因2：样品或者是结合缓冲液不正确 策略：检测pH 及样品和结合缓冲液的组成份。确 保在溶液 中鳌合剂或强还原剂的浓度及咪唑的浓 度不是太高。
因此欲高效分离纯化存在于相当大体积的组织匀 浆或发酵液中的极少量目标产物，同时又混有大 量理化性质相仿的其它生物活性物质时，仅根据 理化性质不同设计分离纯化工艺已远不能满足生 物技术发展的需要。这时就必须从生物亲和作用 力的角度进行研究，而亲和技术正是在此背景下 产生的。
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❖ 可能原因：蛋白已沉淀在柱上 策略：减少上样量，或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋 白的浓度。试用去污剂或改变NaCl 的浓度，或在变性条件(去折叠)下 洗脱(用4－8 M脲，或4－6 M 盐酸胍)。
❖ 可能原因：非特异性疏水或其他相互反应 策略：加非离子去污剂到洗脱缓冲液（如，2%Triton X-100）或增加 NaCl 的浓度。
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亲和层析纯化技术要点
小组成员:徐鹏，蒋美玲，季成，滕嘉琳， 金爽，任沛
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❖生物制药工艺上主要运用的几种色谱技术
吸附色谱
离子交换色谱
分配色谱 凝胶色谱
亲和色谱
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Affinity Chromatography
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金属离子螯合亲和层析
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❖金属离子螯合亲和层析是利用金属离子的 络合或形成螯合物的能力吸附蛋白质的分 离系统。
Ni Sepharose 6 Fast Flow
❖含His-tag的rhEGF： His的咪唑基可以与 Ni2+特异性结合。
❖解决办法：继续超声破碎，直至黏度降 低
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▪ 其专一性是由分子有关作用基团（官能团） 的化学结构与它们的空间排列决定的
▪ 亲和层析技术是目前分离纯化药物蛋白等生 物太分子最重要的方法之一
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Background
生物大分子自身的特殊性和复杂性：热稳定性差， 对环境的pH值、有机溶剂、某些无机载体和金属 离子很敏感。
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洗脱方法
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非特异性洗脱:改变缓冲液的pH、离子强度、 介电常数或温度使物质构象改变，浓缩、洗脱 后立即中和稀释或透析，使蛋白质迅速恢复到 天然结构
策略3：改变螯合的金属离子，寻找到最佳的结合 金属离子。
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二、His标签蛋白与Ni2+结合了，没有被洗脱下来
❖ 可能原因：洗脱条件太温和（组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上， 结合力较强） 策略：用增加咪唑的梯度洗脱或降低pH 来找出最佳的洗脱条件。
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基本概念
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❖亲和作用：生物物质具有识别特定物质并 与该物质分子结合的能力，且可以区分结 构与性质相似的其他分子，这种特异性的 相互作用称为亲和作用。
❖配基:亲和层析中能被某一生物大分子识别 和可逆结合的生物专一性物质。
❖配体：与配基是相对的概念。
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❖7. 应避免含碳酸氢钠，柠檬酸等物质；
❖8. 缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间；
❖9. 可加入变性剂促溶，盐酸胍（最高可6M），尿 素（最高可8M）
❖ 10.可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween， NP40等，最高2%，可以减少背景蛋白污染和去 除核酸污染；
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一、His标签蛋白没有结合上，都流穿了
❖ 可能原因3：组氨酸的标签没有完全的暴露 策略：在变性条件下(用4－8 M 脲，或4－6 M盐 酸胍)进行纯化。
❖ 可能原因4：His标签丢失 策略1：WB或者anti-his的抗体检查His是否表达， 上游构建，改变his-tag的位置(C-terminal or Nterminal)，必要时增加his个数(常用6-10个)。 策略2：孵育的时间不够，降低流速和增加孵育的 时间。
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❖配基应具备的特性： ❖1.对于欲纯化的生物物质应具有专一亲和性 ❖2.必须具备能被修饰的功能基团
常见配基-配体物质对：酶-底物 酶-抑制物 激素-受体 抗原-抗体 金属离子-氨基酸残基
cDNA-对应的基因片段，等
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特异性洗脱：再次利用生物学特异性只洗脱 和配基专一作用的蛋白质，不洗脱由于非专一 吸附上去的杂蛋白
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ຫໍສະໝຸດ Baidu
亲和层析的基本类型
❖生物亲和层析 ❖免疫亲和层析 ❖金属离子螯合亲和层析 ❖染料亲和层析 ❖拟生物亲和层析
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Tips
一些从实验手册里总结出来的Tips ❖1. 避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如：
NH4+，甘氨酸，精氨酸，Tris，等等； ❖2. 各种缓冲液中不能有强螯合剂，如EDTA，
EGTA，等等； ❖3. 各种缓冲液里不能有高浓度的强还原，比如
DTT，防止二价Ni被还原； ❖4. 不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流