亲和层析技术要点

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亲和层析基本知识亲和层析法是利用生物大分子与某些对应的专一

一、亲和层析基本知识亲和层析法是利用生物大分子与某些对应的专一分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一种生物大分子纯化方法，也叫做生物亲和或生物特异性亲和色谱。

这种特异可逆结合的物质很多，如抗原与抗体、底物与酶、激素与受体等，他们间的这种特异亲和能力又叫亲和力。

亲和色谱中，一对互相识别的分子互称对方为配体，如激素可认为是受体的配体，受体也可以认为是激素的配体。

其他组分不产生这种专一性的结合，而直接流出色谱柱。

然后，便可以利用洗脱剂将吸附在柱中的生物大分子洗脱下来。

亲和色谱法具有高度的专一性，而且色谱过程简单、快速，是一种理想的有效分离纯化生物大分子的手段。

二、固相载体的选择对于一个成功的亲和色谱分离来说，一个重要的因素就是选择合适的固体载体。

一个理想的载体，首先它必须尽可能少地同被分离的物质进行相互作用，以避免非特异的吸附作用。

因此，优先选用的是中性聚合物，例如，琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶。

其次，载体必须具有良好的通透性，即使在亲和剂键合在它的表面之后也必须保持这种特性。

连接亲和剂的先决条件是有足够量的某些化学基团存在，这些基团在不影响载体的结构，也不影响被连接的亲和剂的条件下被活化或衍生。

载体在结合亲和剂后，必须在机械性能和化学性质上具有稳定性，而且在改变pH、离子强度、温度以及变性剂的条件下也应该稳定。

载体必须有大的孔网结构，允许大分子物质自由出入。

再者，载体的组成大小也应均匀。

高孔度对于大分子物质的分离是个重要的条件，它的主要作用是提供欲分离的物质与配体间的接触机会。

配体大多结合在载体的孔内部，孔太小，生物大分子进不去，即使配体偶联率很高，结合生物大分子的量也不会太大。

这不是我们所希望的。

一般常用的载体有纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和多孔玻璃等。

三、配体的选择亲和层析的固体基质具有一个与之共价相连的特殊结合分子（如配位体），连接后的配体对互补分子的亲和力不会改变。

配体是发生亲和反应的功能部位，也是载体和被亲和分子之间的桥梁。

蛋白质亲和层析

蛋白质亲和层析蛋白质亲和层析是一种高效分离方法，它利用生物大分子之间的特异性作用来选择性地分离目标蛋白质。

该方法具有分离效率高、操作简单易行、适用性强、损失小等优点，被广泛应用于生物化学、生物医学和生物工程等研究领域。

以下针对蛋白质亲和层析的基本概念、方法流程、实验注意事项等进行详细介绍。

一、蛋白质亲和层析基本概念蛋白质亲和层析是利用配体固定于某一介质孔隙中，通过生物大分子之间的特异性作用，选择性地分离目标蛋白质的一种纯化方法。

通常用于分离蛋白质与其结合分子的复合物，例如酶与底物、抗体与抗原等。

常用的配体有亲和素、金属离子、抗体及蛋白质等。

二、蛋白质亲和层析方法流程1. 设计实验流程：确定目标蛋白质及其结合配体，选择适当的分离介质、操作条件及检测方法。

2. 制备分离介质：将选择的配体固定于固相载体（如琼脂糖、琼脂糖-硫酸盐、硅胶等）上。

3. 样品制备：采用适当的方法，“开裂”细胞，释放所需的目标蛋白质。

去除细胞碎片后，可进行酶、抗体等前处理。

4. 样品加载：将制备好的样品加入到分离介质中，充分混合。

5. 洗脱：将非特异性蛋白质等杂质彻底洗脱，最终目标蛋白质作为复合物结合态定向脱附。

6. 脱附和再生：可用特定的洗脱剂或酸碱条件等方法对结合蛋白质进行脱附，目的是复合物的释放以及再生与维护分离介质的性质和活性。

三、蛋白质亲和层析实验注意事项1. 选择适当的配体：根据目标蛋白质特异性、结构、物理化学性质等因素，选择有特异性和较高亲和力的配体。

2. 制备良好的分离介质：要求固相载体颗粒粒径均匀、孔隙适当，配体固定稳定。

3. 样品质量要好：可通过细胞全裂方案、适当的培养培养、存储方式、冻干等方法保证目标蛋白质的活性、纯度和稳定性等。

4. 洗脱过程控制：要严格控制洗脱条件，防止目标蛋白质异常脱失或浓度降低之外，同时要特别关注分离介质稳定性，以维护肯定柱介质活性和再生可能性。

蛋白质亲和层析是一种高效、通用的纯化方法，适用于从复杂基质中分离出目标蛋白质及其复合物。

亲和层析纯化蛋白注意事项

亲和层析纯化蛋白注意事项以亲和层析纯化蛋白注意事项为标题，写一篇文章。

亲和层析是一种常用的蛋白纯化方法，通过蛋白与配体之间的特异性相互作用，实现目标蛋白的分离纯化。

在进行亲和层析纯化蛋白的过程中，有一些注意事项需要我们特别关注。

选择合适的亲和层析柱非常重要。

不同的亲和层析柱具有不同的亲和基团，可以与不同的目标蛋白发生特异性相互作用。

在选择亲和层析柱时，需要考虑目标蛋白的性质，如分子量、等电点、亲和基团的配对等。

同时，还需要考虑目标蛋白与其他非特异性结合物的亲和性，以便在纯化过程中有效去除杂质。

样品的预处理也是亲和层析纯化蛋白的关键一步。

在样品中含有大量的杂质，如其他蛋白、核酸、小分子化合物等。

这些杂质会影响到目标蛋白与亲和基团的结合，降低纯化效果。

因此，在进行亲和层析纯化之前，需要对样品进行预处理，如去除杂质、浓缩目标蛋白等。

在进行亲和层析纯化蛋白的过程中，温度和pH值的控制也是非常重要的。

温度和pH值可以影响到目标蛋白与亲和基团之间的结合力和特异性。

一般来说，选择适当的温度和pH值可以增强目标蛋白与亲和基团的结合，提高纯化效果。

同时，还需要注意避免温度和pH值对目标蛋白的稳定性产生不利影响。

洗脱缓冲液的选择也是亲和层析纯化蛋白时需要注意的地方。

洗脱缓冲液的选择应根据亲和基团与目标蛋白的结合力以及目标蛋白与非特异性结合物的结合力来确定。

通常，使用一系列浓度递增的洗脱缓冲液可以有效地去除非特异性结合物，提高纯化效果。

但是，洗脱缓冲液的浓度也不能太高，否则可能会影响到目标蛋白的活性和稳定性。

对于亲和层析纯化蛋白的结果评价也是需要注意的。

在纯化过程中，可以通过检测目标蛋白的纯度、活性以及其他相关特性来评价纯化效果。

同时，还需要对纯化后的目标蛋白进行保存和储存，以保证其在后续实验中的可用性和稳定性。

亲和层析纯化蛋白是一种常用的蛋白纯化方法，但在实验过程中需要注意一些细节。

包括选择合适的亲和层析柱、样品的预处理、温度和pH值的控制、洗脱缓冲液的选择以及结果的评价等。

生物制药工艺学中亲和层析

亲和层析配基的性质与选择
配基的偶联:
1：酸酐法 2：羟基琥珀酰亚胺法 3：叠氮化作用 4：还原性烷基化合物（西夫碱）的形成
第二节:载体、配基、目的物的连接： (Conjunction of vector、ligand and target material)
载体（Vectors or Matrix) +
性的吸附，杂质不被吸附。用上样 Buffer冲洗柱体，杂质被冲洗下来。形成杂质峰（见下图）。
3. 洗脱（Elution）
选择适当的条件，将吸附在亲和介质
上的目的物解吸下来（见下图）。
Fig5 . Principle of preparing AC media
第三节：亲和层析的基本操作方法：
1.平衡（ Equilibration）
用平衡Buffer 冲洗柱体，至基线平稳.2. 样品上柱和冲洗：
（Sample application and wash）样品中的目的物与层析介质选择
2：配基（ligand）：被固定在基质上的分
子称为配基，配基和基质是以共价键结合的。
3：基质（matrix):亦称为载体（vector):是
构成固定相的骨架。
二：亲和层析有如下特点： (Characteristics of Affinity Chromatography)
1:纯化过程简单、迅速. 2:分离效率高。 3:产物纯度高。 4:必须针对某一分离对象制备专一的配基及
mRNA)。 3：酶与其底物。 4：激素与其受体。 5：维生素与结合蛋白。 6：糖蛋白与植物凝集素。
五：亲和层析载体的性质与选择
亲和层析载体的选择(selection of vectors)
1：多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过。

ge亲和层析原理和方法

ge亲和层析原理和方法引言ge亲和层析（GE Affinity Chromatography）是一种常用的生物分离和纯化技术，广泛应用于蛋白质纯化和分析等领域。

本文将介绍ge亲和层析的原理和方法，并探讨其在生物科学研究中的应用。

一、ge亲和层析原理ge亲和层析原理基于生物分子之间的特异性相互作用，利用目标分子与特定配体之间的亲和力实现分离。

亲和层析的核心在于选择合适的配体，使其与目标分子具有高度的亲和力。

常用的配体包括抗体、金属离子、亲和标签等。

二、ge亲和层析方法1. 列层析法列层析法是ge亲和层析的常用方法之一。

将配体固定在层析柱上，将混合物（包括目标分子和其他杂质）加入柱上，通过洗脱等步骤实现目标分子的分离和纯化。

此方法操作简单、适用于大规模制备。

2. 批次层析法批次层析法是ge亲和层析的另一种常用方法。

将配体固定在固相材料上，将混合物与固相材料混合搅拌，通过洗脱等步骤实现目标分子的分离和纯化。

此方法适用于小规模制备和快速分离。

三、ge亲和层析的应用1. 蛋白质纯化ge亲和层析广泛应用于蛋白质的纯化。

通过选择合适的配体，可以实现对目标蛋白质的高效分离和纯化，提高纯化效率和纯度。

2. 抗体结合分析ge亲和层析可用于抗体结合分析，通过配体选择性地捕获目标抗体，实现对抗体结合特性的研究。

这对于药物研发和免疫学研究具有重要意义。

3. 蛋白质相互作用研究ge亲和层析还可用于研究蛋白质的相互作用。

通过将不同的配体固定在柱上，可以捕获目标蛋白质的结合伴侣，进一步揭示蛋白质相互作用网络。

4. 基因工程和生物药物制备ge亲和层析在基因工程和生物药物制备中有广泛应用。

通过选择合适的配体，可以实现对表达蛋白质的纯化和分离，提高生物药物的纯度和质量。

结论ge亲和层析是一种重要的生物分离和纯化技术，通过选择合适的配体和方法，可以实现对目标分子的高效分离和纯化。

它在蛋白质纯化、抗体结合分析、蛋白质相互作用研究以及基因工程和生物药物制备等领域具有广泛的应用前景。

亲和层析洗杂

亲和层析洗杂
"亲和层析洗"通常是指亲和层析法（Affinity Chromatography）的操作步骤之一。

这是一种用于分离和纯化生物分子的技术，利用其与特定配体之间的亲和力进行分离。

以下是亲和层析洗的内容：
1. 亲和层析填料准备：在柱子中填充具有特定亲和性的配体。

这个配体可以是抗体、受体、金属离子或其他具有特定亲和力的化合物。

2. 样品处理：样品通常是混合物，包含目标分子和其他成分。

该混合物通过预处理，例如细胞破碎、去除杂质等，以准备进行层析。

3. 样品加载：将经过预处理的样品通过填充了亲和层析柱的装置。

在这一步中，目标分子会与填料中的配体结合形成复合物。

4. 非目标成分洗脱：使用洗脱缓冲液冲洗柱子，以去除与填料无关的非目标成分。

这些成分通常不会与配体结合，所以能够较容易地从柱子中洗脱。

5. 目标分子洗脱：使用特定条件或化合物来洗脱目标分子。

这些条件能够破坏配体与目标分子的结合，使目标分子从柱子中洗脱出来。

6. 纯化和收集：收集洗脱出的目标分子，进行后续的纯化和分析。

亲和层析洗是亲和层析法的一部分，通过利用生物分子之间的特异亲和性，实现目标分子与填料上配体的结合和分离。

这种技术在生物学、生物化学和制药等领域广泛应用于分离和纯化生物大分子。

亲和层析技术

亲和层析技术（一）原理亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。

所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。

此法具有高效、快速、简便等优点。

（二）载体的基本要求和选择理想的载体应具有下列基本条件：①不溶于水，但高度亲水；②惰性物质，非特异性吸附少；③具有相当量的化学基团可供活化；④理化性质稳定；⑤机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定的流速；⑥通透性好，最好为多孔的网状结构，使大分子能自由通过；⑦能抵抗微生物和醇的作用。

可以做为固相载体的有皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素和琼脂糖。

在这些载体中，皂土、玻璃微球等吸附能力弱，且不能防止非特异性吸附。

纤维素的非特异性吸附强。

聚丙稀酰胺凝胶是目前的首选优良载体。

琼脂糖凝胶的优点是亲水性强，理化性质稳定，不受细菌和酶的作用，具有疏松的网状结构，在缓冲液离子浓度大于0.05Mol/L时，对蛋白质几乎没有非特异性吸附。

琼脂糖凝胶极易被溴化氢活化，活化后性质稳定，能经受层析的各种条件，如0.1Mol/L NaOH或1Mol/L HCl处理2h~3h及蛋白质变性剂7Mol/L尿素或6Mol/L盐酸胍处理，不引起性质改变，故易于再生和反复使用。

琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose，含糖浓度为2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。

因为Sepharose 4B的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。

（三）试剂与配制1．Sepharose 4B2．CNBr（剧毒）3．抗原或抗体4．1Mol/L NaHCO3 取NaHCO3 84.01g加水至1 000ml。

5．0.1Mol/L NaHCO36．2Mol/L NaOH7．0.01Mol/L pH7.4 PBS0.2Mol/L Na2HPO4 38.0ml0.2Mol/L Na2HPO4 162.0mlNaCl 32.76g加水至4 000ml。

第5章亲和层析

第5章亲和层析第5章亲和层析一、亲和层析的特点：①待分离物质与配基专一性结合，分辨率高，操作简单，通过一次性操作即可得到较高纯度的分离物质。

②具有浓缩作用，可以从含量很低的溶液中得到高浓度的样品，有的纯化倍数达几千倍。

③利用生物学的特异性进行分离，所以分离条件比较温和，能够很好地保持样品原有的生物学性质。

二、基本原理：生物大分子的识别功能：①酶：底物、抑制剂底物类物；②抗体：抗原、病毒细胞；③激素：受体；④外源凝集素：糖蛋白、表面受体蛋白；⑤核酸：互补碱基链段、组蛋白。

1 配基：亲和层析介质的配基有很多，归纳起来主要有以下几类：①有机小分子类主要有苯基类、烷基类、氨基酸类、核苷酸类等。

②生物大分子类主要有酶类、抑制剂类、蛋白质、抗原抗体类等。

③染料主要有蓝色葡聚糖、荧光染料等。

2 载体：纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶。

3 活化剂：（最常用的几种活化剂）溴化氰(CNBr)、环氧氯丙烷、1，4-丁二醚、戊二醛、高碘酸盐等。

三、亲和层析介质的制备：1 配基的选择（配基必备条件）：①能与活化剂的活化基团发生偶联作用，偶联后不影响配基和目标分子的专一结合特性。

②专一亲和性要强，能有效地分离目标分子。

③配基与目标分子结合后，在一定条件下能够被解吸附，且不破坏目标分子的生物活性。

④在分离过程中配基与目标分子无空间阻碍。

常用的配基：①酶：底物、底物类似物、抑制剂、辅因子（辅酶、金属离子等）；②抗体----抗原、病毒、细胞、激素、维生素----受体蛋白、载体蛋白；③外源凝集素----多糖化合物、糖蛋白、细胞表面受体蛋白、细胞；④核酸----互补碱基链段、组蛋白、核酸聚合物、核酸结合蛋白。

2 载体的选择（理想载体的特性）：①不溶于水，但具有高度亲水性。

②具有多孔网状结构和良好的流动性和渗透性。

③机械性能良好，在一定静水压下不变形。

④有足够数量的化学基团与大量的配基相偶联。

亲和层析原理和方法

亲和层析原理和方法引言亲和层析是一种常用的分离纯化生物大分子的方法，广泛应用于生物工程、生物医学和生物化学等领域。

本文将介绍亲和层析的基本原理和常用方法。

一、亲和层析的基本原理亲和层析是利用化学结合的特异性，将目标分子与固定在层析柱上的亲和配体结合，从而实现目标分子的分离纯化。

其基本原理如下：1. 亲和配体选择性结合目标分子：亲和配体是一种具有特异性结合目标分子的生物大分子或化学物质。

通过选择合适的亲和配体，可以实现对目标分子的选择性结合。

2. 层析柱固定亲和配体：亲和配体通常通过共价键或非共价键的方法固定在层析柱的填料上。

固定亲和配体后，层析柱具有了对目标分子的特异性结合能力。

3. 样品溶液通过层析柱：样品溶液中含有目标分子和其他杂质分子。

当样品溶液通过层析柱时，目标分子会与层析柱上的亲和配体结合，而杂质分子则流经层析柱。

4. 目标分子的洗脱和回收：通过改变洗脱缓冲液的条件，可以使目标分子与亲和配体解离，从而实现目标分子的洗脱和回收。

二、常用的亲和层析方法亲和层析方法根据亲和配体的性质和结合方式的不同，可以分为多种不同的方法。

以下是几种常用的亲和层析方法：1. 金属离子亲和层析：利用金属离子与亲和配体之间的配位作用，实现对目标分子的选择性结合。

常用的金属离子包括Ni2+、Cu2+和Zn2+等。

2. 免疫亲和层析：利用抗体与抗原之间的特异性结合，实现对目标分子的选择性结合。

免疫亲和层析广泛应用于生物医学领域，用于分离纯化抗体和抗原。

3. 亲和色谱层析：利用染料、受体或配体等分子与目标分子之间的特异性结合，实现对目标分子的选择性结合。

常用的亲和色谱层析方法有离子交换层析、亲和柱层析等。

4. 亲和吸附层析：利用亲和吸附剂与目标分子之间的特异性结合，实现对目标分子的选择性结合。

常用的亲和吸附层析方法有亲和蛋白A/G层析、亲和葡萄糖层析等。

三、亲和层析的应用领域亲和层析作为一种常用的分离纯化方法，广泛应用于生物工程、生物医学和生物化学等领域。

dna亲和层析

dna亲和层析DNA亲和层析是一种分离和纯化特定DNA序列的技术。

它基于DNA结构的物理和化学特性，利用无机和有机化学反应的基础进行操作。

DNA亲和层析的基本原理是通过DNA双链结构的独特性质，将含有亲和指定的蛋白或化合物与其他DNA序列分离。

下面我们将更具体的了解DNA亲和层析的步骤。

1、预处理样品样品处理是DNA亲和层析的首要环节，对于纯化产品的收获直接反映样品质量。

样品应该充分摇匀后，使用必要的杀菌剂对样品进行消毒处理，如不含重金属，并保持营养成分的不变性。

另外，这是使用前操作纯化树脂的关键步骤，以去除不纯物质和局部污染，保持树脂材料的完整性和生物特征。

2、DNA连接DNA连接的目的是连接特定的连接部位，以便亲和柱树脂上的DNA结合。

DNA连接通常是通过将亲和融合蛋白注入，将融合蛋白与适当的表达质粒截取，并在水中孵育24小时用于纯化目的。

3、树脂滴定树脂滴定的目的是在样品通过过滤小孔树脂技术时产生的混合物中固定目标DNA。

购买树脂时需要注意其特定用途和亲和指数。

在使用前应通过相关材料得知树脂规格和性质，在标准化材料上进行初步实验后进行实验。

4、色谱洗脱和纯化色谱洗脱和纯化是通过DNA亲和树脂池中的柱子，将目标物分离出来的最后一步。

此步骤是通过以逆向溶液作为洗脱液，分别分离特定DNA 分析、基因进行分级分体分析。

在此步骤中，最重要的是确保一个合适的洗脱液种类和浓度的选择，这定义了分离效率的高或低。

DNA亲和层析利用DNA双链结构独特的物理、化学特性，采用有机和无机化学反应进行操作。

预处理样品、DNA连接、树脂滴定、色谱洗脱和纯化是DNA亲和层析的主要步骤。

正确的DNA亲和层析操作将在分离达到优良效果和富集纯度较高的目标DNA时反映出来，具有良好的应用前景。

亲和色谱层析

亲和色谱层析
亲和色谱层析是一种分离和纯化生物分子的方法，主要用于从混合物中分离目标生物分子，例如蛋白质、抗体、核酸等。

亲和色谱层析的基本原理是通过生物分子之间的特异性相互作用来实现分离。

以下是亲和色谱层析的主要步骤和原理：
1.亲和基质选择：选择一种适当的亲和基质（affinity matrix），这是一种包含亲和配体（affinity ligand）的材料，具有对目标分子的特异性结合能力。

亲和配体可以是抗体、金属离子、小分子化合物等，与目标分子有特异性相互作用。

2.样品加载：将混合物样品加载到亲和柱（亲和基质填充的柱子）中。

3.特异性结合：在亲和柱中，目标分子与亲和基质上的亲和配体特异性结合。

非目标分子则会通过柱子，被洗脱。

4.洗脱：通过改变缓冲液的条件，例如改变pH值、离子强度或温度，使得目标分子与亲和基质的亲和结合减弱，从而将目标分子洗脱下来。

5.收集纯化的目标分子：洗脱的溶液中包含了纯化的目标分子，可以进一步进行分析或其他实验。

亲和色谱层析的优势在于其对生物分子的高选择性，能够在不破坏目标分子生物活性的情况下进行分离和纯化。

然而，也需要根据具体的目标分子和样品特性选择适当的亲和基质和亲和配体。

亲和层析法 (Affinity chromatography)

親和層析法（Affinity chromatography）在這裡，我們從四個方向介紹親和層析法。

1. 1.基本原理：說明親和層析法運作的方式。

2. 2.材質選擇：解釋如何選用適當的填充物。

3. 3.樣品的分離：說明如何達到最佳的分離效果。

4. 4.親和層析法的應用：使用親合層析法的時機。

一、基本原理親和層析（affinity chromatography）也稱為功能層析（function chromatography）、生物專一吸附（biospecific adsorption）或是選擇層析（selective chromatography）。

所謂的親和力，乃生物大分子和其配體（ligand）之間形成可逆結合的能力，如酵素和它的受質（substrate）、抗體和抗原、激素和受體（receptor）、RNA和其互補的DNA等，親和層析就是根據這種親和力發展出來的純化方法，例如將酶的substrate接在固體支持物上，再用此支持物填裝管柱，當含有這種酶的樣品溶液通過管柱時，酶便被吸附在管柱上，其它的蛋白質及雜質不被吸附，全部從層析柱流出，最後使用適當的緩衝液，將欲分離的酶從柱中洗出來，經過這些步驟便能得到純化的酶。

整個過程如下：二、材質選擇欲進行親和層析，ligand的選擇相當重要，ligand可以是輔酶、酶的抑制劑或抗體，具備的條件如下：1. 1.能與欲分離的物質進行專一性的結合，親和力愈大愈好。

2. 2.Ligand與分子結合後，在一定的條件下又能解離，而且不會因解離破壞原本的生物活性。

3. 3.Ligand上具有能連結到固體支持物上的團基，結合後不影響它與欲分離物質的結合專一性。

在實際操作上，若要純化的是某一種酶，則lignad選用此酶的競爭性抑制劑、受質（substrate）、輔酶或是效應劑（effector ）；若是要純化酶的抑制劑，就選用此酶作為ligand；純化能與某維生素結合的蛋白質，可以使用這種維生素當ligand；純化激素的受體（receptor），選用荷爾蒙當ligand。

亲和层析法注意事项

亲和层析法注意事项亲和层析法是一种常用的生物分子分离方法，需要注意以下事项：亲和层析柱的长度：亲和层析柱一般较短，通常在10cm左右。

过长的层析柱会导致样品与配体之间的亲和力下降，影响分离效果。

样品处理：亲和层析对样品处理要求较高，需要将样品中的杂质尽量去除，以减少对分离效果的影响。

同时，样品液的浓度也不宜过高，以免影响吸附效果。

缓冲液选择：亲和层析中选择的缓冲液应使待分离的生物大分子与配体有较强的亲和力，同时应有一定的离子强度，以减小基质、配体与样品其他组分之间的非特异性吸附。

温度控制：生物分子间的亲和力受温度影响，通常亲和力随温度的升高而下降。

因此，在上样时可以选择适当较低的温度，使待分离的物质与配体有较大的亲和力，能够充分地结合；而在后面的洗脱过程中可以选择适当较高的温度，使待分离的物质与配体的亲和力下降，以便于将待分离的物质从配体上洗脱下来。

流速控制：上样时应注意选择适当的流速，以保证样品和亲和吸附剂有充分的接触时间进行吸附。

如果样品液的浓度过高，可以降低流速以便于样品与亲和吸附剂有更充分的接触时间进行吸附。

平衡缓冲液的流速可以快一些，但如果待分离物质与配体结合较弱，平衡缓冲液的流速还是较慢为宜。

重复上样：如果待分离物质与配体的亲和力较小或者样品浓度较高、杂质较多时，可以在上样后停止流动，让样品在层析柱中反应一段时间，或者将上样后流出液进行二次上样，以增加吸附量。

洗脱液选择：洗脱液的选择应使待分离的物质与配体的亲和力下降，以便于将待分离的物质从配体上洗脱下来。

如果存在较强的非特异性吸附，可以用适当较高离子强度的平衡缓冲液进行洗涤，但应注意平衡缓冲液不应对待分离物质与配体的结合有明显影响，以免将待分离物质同时洗下。

以上是亲和层析法的一些注意事项，实际操作中需要根据具体情况进行调整和优化。

亲和层析纯化蛋白

亲和层析纯化蛋白
亲和层析纯化蛋白是一种广泛被应用于蛋白纯化的技术，在这种技术中，通过利用靶蛋白与某一亲和剂相互结合的特异性，达到将蛋白从混合
物中分离出来的目的。

具体流程如下：
1.选择适当的亲和剂：根据目标蛋白表面的属性，选择合适的亲和剂，例如特定抗体、金属离子（例如Ni2+）、亲和配体等。

2.制备亲和树脂：将亲和剂固定在树脂上，以制备亲和树脂。

3.样品制备：将含有目标蛋白的混合物制备好，例如细胞裂解物、过
滤液等。

4.样品沉积：将样品与亲和树脂混合，使亲和树脂中的亲和剂与目标
蛋白结合。

5.洗脱：将非特异性结合物和杂质用缓冲液进行洗脱。

6.蛋白洗脱：通过改变洗脱缓冲液的条件，如pH、离子浓度等，使
目标蛋白与亲和剂解离。

7.蛋白纯化：收集目标蛋白溶液，以得到纯化的蛋白。

需要注意的是，在亲和层析过程中，亲和剂选择、树脂选择以及缓冲
液的配比等，均会对纯化效果产生影响。

因此，需要根据各种参数进行优化，以得到更好的纯化效果。

亲和层析的洗脱方法

亲和层析的洗脱方法一、亲和层析洗脱方法的基本概念。

1.1 亲和层析是一种很巧妙的分离技术。

它就像一把精准的钥匙开一把锁一样，利用生物分子间特异性的亲和力来分离目标分子。

比如说，抗原和抗体之间的那种亲密无间的结合关系，就可以被利用在亲和层析里。

1.2 而洗脱呢，简单来说就是把我们想要的东西从这个亲和层析的柱子上弄下来。

这就好比从树上摘果子，得有合适的方法，不然果子要么摘不下来，要么就弄坏了。

二、特异性洗脱方法。

2.1 竞争性洗脱。

这是一种很常用的方法。

就像两个人抢一个座位一样，我们加入一种能和目标分子竞争与配体结合的物质。

比如说，在抗原抗体的亲和层析中，我们可以加入过量的游离抗原，这样原本结合在柱子上的抗原就会被竞争下来。

这就像是在拔河比赛里，来了个更有力气的，把原来占着位置的一方给拉走了。

2.2 改变pH值洗脱。

这也是个很有效的手段。

生物分子的结合有时候就像两个人手拉手，pH值就像是周围的环境温度。

当我们改变pH值的时候，就好像改变了温度，分子之间的结合力就会受到影响。

有的分子在酸性环境下结合得很牢固，我们把它变成碱性环境，可能就像松开了紧握着的手，目标分子就从柱子上脱落下来了。

2.3 离子强度变化洗脱。

这就好比在水里加盐或者糖一样。

我们增加离子强度，就像是在原来平静的分子结合的“小湖”里搅起了波澜。

对于一些依靠离子键结合的亲和体系，增加离子强度会破坏这种结合，使得目标分子被洗脱下来。

这有点像往一群紧密排列的小珠子里加了很多沙子，珠子之间的排列就被打乱了。

三、非特异性洗脱方法。

3.1 变性洗脱。

这是一种比较“粗暴”的方法。

就像把一个精致的小房子给拆了一样。

我们使用一些能使蛋白质等生物分子变性的试剂，比如尿素或者盐酸胍。

这种方法虽然能把目标分子弄下来，但是目标分子的结构可能就被破坏了，就像把一个漂亮的花瓶打碎了，虽然得到了花瓶的碎片，但是花瓶已经不是原来完整的样子了。

所以这种方法一般是在特殊情况下才使用，不到万不得已不会轻易尝试。

实验十一亲和层析（最后）

实验十一亲和层析（最后）实验十一亲和层析纯化胰蛋白酶一、引言前面我们所学的凝胶过滤法、离子交换法以及电泳等一系列分离纯化生物大分子的手段，比起早期采用的盐析法，有机溶剂及等电点沉淀法等，分离效果要好得多。

但是，这些方法中，或是利用生物大分子在一定条件下不同的溶解度、电荷分布、总电荷的不同，或是依据其分子的大小和形状的不同。

一句话，多是利用生物分子间物理和化学性质的差异来进行分离纯化的。

由于这些方法的特异性比较低，加之待分离物质之间的物化性质差异较小，常常要综合不同的分离方法。

经过许多步骤才能使生物分子达到一定的纯度。

这样既费时间，又费试剂，有时最后产品还不能令人满意。

另外，有些生物大分子，往往在生物组织或发酵液中的含量很低，相对地说杂质很多，特别是一些具有生物活性的分子，往往由于分离纯化的步骤很多，时间过长，造成破坏以致失活，产率很低。

这就促使人们去寻求新的方法来解决存在的问题。

亲和层析法是近十多年来迅速地发展并广泛被采用来分离纯化生物大分子的一种十分有效的方法。

它具有分离快速，纯化效率高。

特别是对于那些含量少，杂质多，采用常规方法难于分离的生物活性分子，显示了独特的优越性。

有时一次被分离物质的纯度可提高几倍，十几倍甚至几百倍。

因此，亲和层析技术已成为纯化生物分子，特别是纯化生物活性物质最重要的方法之一。

二、实验目的与要求1.理解亲和层析法的基本原理，并通过实验能初步掌握制备一种亲和吸附剂的操作方法；2.理解和掌握亲和层析实验操作技术；3.学会一种测定蛋白水解酶活力及比活的方法。

三、基本原理简言之，亲的层析主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。

这是由一种典型的吸附层析发展而来的分离纯化方法。

许多生物分子都有一种独特的生物学功能。

即它们都具有能和某些相对应的专一分子可逆地结合的特性（分子间通过某些次级键结合，如范德华力，疏水力，氢键等，在一定条件下又可解离）。

亲和层析技术要点

❖ 可能原因：蛋白已沉淀在柱上策略：减少上样量，或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋白的浓度。试用去污剂或改变NaCl 的浓度，或在变性条件(去折叠)下洗脱(用4－8 M脲，或4－6 M 盐酸胍)。
❖ 可能原因：非特异性疏水或其他相互反应策略：加非离子去污剂到洗脱缓冲液（如，2%Triton X-100）或增加 NaCl 的浓度。
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1
亲和层析技术概述
2
亲和层析基本过程
3
His-tag亲和层析常见问题
4
Tips

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亲和层析技术概述
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❖What is Affinity Chromatography?
▪ 亲和层析是利用生物体中多数大分子物质具有与某些相应的分子专一性可逆结合的特性而建立的分离纯化技术
策略3：改变螯合的金属离子，寻找到最佳的结合金属离子。

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二、His标签蛋白与Ni2+结合了，没有被洗脱下来
❖ 可能原因：洗脱条件太温和（组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上，结合力较强）策略：用增加咪唑的梯度洗脱或降低pH 来找出最佳的洗脱条件。
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一、His标签蛋白没有结合上，都流穿了
❖ 可能原因1：超声的功率不对(太大，蛋白炭化，太小，蛋白没有释放) 策略：改变超声功率，并在超声前加入溶菌酶
❖ 可能原因2：样品或者是结合缓冲液不正确策略：检测pH 及样品和结合缓冲液的组成份。确保在溶液中鳌合剂或强还原剂的浓度及咪唑的浓度不是太高。

《生物制药工艺学》9亲和层析

1.溴化氰活化法
溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化过程主要是生成亚氨基碳酸盐活性基团，它可以和伯氨基（NH2）反应，主要生成异脲衍生物。（进行于羟基处）
含有伯氨基的配基，如氨基酸、蛋白质都可以结合在载体上，对于蛋白质而言，最可能发生反应的基团是N－末端的a－氨基
优点：共价键结合，牢，结合位点多；偶联效率高缺点：有毒性，反应条件剧烈，有可能使配基失活
（三）多孔玻璃珠的活化
对于多孔玻璃珠等无机凝胶的活化通常采用硅烷化试剂与玻璃反应生成烷基胺－玻璃，在多孔玻璃上引进氨基，再通过这些氨基进一步反应引入活性基团，与适当的配体偶联。
二．载体与配基的连接（一）碳二亚胺缩合法（常用）（二）酸酐法（三）叠氮化法（四）重氮化法
三.用于固定化配基的凝胶衍生物
特殊配基（special ligand）
通用配基（general ligand）
• 用于一类物质的分离提纯。 • 用NADH作脱氢酶类亲和层析的通用配基； • 用ATP作激酶类亲和层析的通用配基； • 用外源性凝集素作糖蛋白类亲和层析时的通
用配基等。
载体的活化与偶联
• 多糖基质的活化与偶联 • 聚丙烯酰胺凝胶及其它凝胶衍生物活化
L
＋
配基
S 样品
＋L 配基固定化
L＋S 吸附样品 LS 样品洗脱
LS
L
LS
＋杂质
L ＋S
• 亲和层析的特点 • 亲和层析的载体 • 亲和配基 • 载体的活化和偶联 • 影响吸附剂亲和力的几个因素 • 配基与间隔臂的连接 • 亲和层析的吸附和洗脱
特点
• 经过一次处理可得到高纯度活性物质，适用于从成份复杂且杂质含量远大于目标物的混合物中提纯目标物，且可区分目的物有无活性；