【医学PPT课件】1991年诺贝尔生理医学奖-膜片钳技术
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
兆欧封接有两个重要后果，首先，小管内和细胞 外液之间的电阻高达100千兆欧姆，因此在同一钳 位电压下，膜单离子通道开放和关闭引起的离子
电流、电导以及通道开放的时间机率及通道的动 力学特性等皆可被测定。
• 第二，微电极尖端管口和膜之间封接的机械强度不同， 可以产生几种不同的记录方式。不同的记录方式可用 来研究通透性的不同方面。微电极尖端管口所围绕的 细胞膜就是要观察离子通道变化的“膜片”，如果在 这一小片膜上只含有一个或少数几个通道蛋白分子， 则可通过离子通道电导的特点，测定出单一通道开放 时的离子电流，从而对单通道的功能特性进行分析。 他们应用这套技术顺利地记录了蛙肌肉细胞上单一离 子通道电流。结果显示，蛙肌肉细胞的细胞膜上一个 离子通道可通过的电流约为20×10-12A，换成离子数 目大约是每秒通过一亿个离子。此后，他们又对离子 通道的运作，细胞分泌过程及通道的调节功能进行了 研究。
膜片钳技术原理图
Electrophysiology-Apparatus
Faraday cage
Microscope
CCD Camera
Vibration Isolation Table
Micro-Manipulators Remote Controller
Amplifiers
Electrophysiology-Apparatus
直从事电生理学方 面的研究
1976年Neher和Sakmann合作发明了patch clamp
技术，发现了细胞膜存在离子通道，而共同获得 1991年诺贝尔奖。
前言
• 1976年Neher和Sakmann建立了膜片钳技术 （patch clamp recording technique）。这是一种 以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上 单一的（或多个的）离子通道分子活动的技术。 以后由于吉欧姆阻抗封接（109Ω）方法的确立和 几种方法的创建，1980年以来，此技术已可用于 很多细胞系的研究。
• 在膜片钳技术出现之前，在电压固定条件下进行 的细胞膜电流记录法，只能向细胞内刺入二根电 极或者蔗糖和凡士林进行双重缝隙法（dual gap） 从细胞外进行记录，但这两种方法仅适用于非常 大的细胞。相反地，应用膜片钳法时对一般较小 细胞也能在电位固定的条件下记录出电流。这也 是膜片钳法的一个很大的优点。此外，膜片钳技 术还有可以直接控制细胞内环境的优点，同时也 存在相反的一面，即比较小的胞质中可动分子可 被渗漏，这又是它的不足之处。
膜片钳技术的意义
• 使影响膜通道因素单一化：在同一细胞膜上通道的种 类很多，可受到如化学、电压和机械等多种因素的影响 而改变其机能状态。如果细胞在活动过程中，始终认为 地维持其膜电位不变，清除了离子流的变化和膜电位变 化之间的相互作用，可使观察因素相对简单化。 • 使参与活动的离子通道单一化：由于静息膜电位的水 平可分别影响不同类型的离子通道，如果有意改变并维 持某一膜电位水平，将使一类膜离子通道首先失活，消 除这一类或几类通道的活动对实验结果的影响，再用一 些特异性离子通道阻断剂后，就可观察剩余通道的活动 规律。使参与活动的离子通道相对单一化。
1991年诺贝尔生理医学奖
膜片钳技术ຫໍສະໝຸດ Baidu
主讲人：唐国奎
获奖者简介
Neher出生于1944年，德 国人
1965年毕业于Wisconsin
University 1976年在耶鲁大学医学 院取得医学博士学位
此后长期从事基础医学 研究
Sakmann1942年出
生于德国的斯图加 特市
1963年毕业于 Tubingen 大学，一
A显示出玻璃微电极接触进入至细胞中。B则是使用高级 放大仪，将膜上的离子通道与微量吸管的尖端相触，以放
大一部分的细胞膜。其中，微量吸管内连接了电流放大器。 D表示电流通过离子通道，离子通道开启。C为通道的高 度放大：细胞外覆有受体以及离子滤器。
细胞膜电流的测定
膜片钳技术的原理
• 膜片钳技术是用玻璃微电极（膜片电极或膜片吸管） 接触细胞膜，以吉欧姆（GΩ）以上的阻抗使之封接， 使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域（膜片） 与其周围在电学上绝缘，在此基础上固定电位，对 此膜片上的离子通道的离子电流（pA级）进行监测 记录的方法。
DAD-VC system
MicroManipulators
CCD Camera
Patch clamp
膜片钳法的各种模式
• 首先建立的单通道记录法（single channel recording）是细胞吸附式（cell-attached mode），其 后又建立了膜内面向外模式（inside-out）和膜外面 向外（outside-out）的模式。后来，又分别建立了开 放细胞吸附内面向外模式（open cell-attached insideout mode）和穿孔囊泡外面向外模式（perforated cell-attached inside-out mode）。全细胞记录法是指 在常规的方法的基础上，附加穿孔膜片（perforated patch）的模式。
• Neher和Sakmann将直径1~5μm的玻璃微电极在火 上抛光，然后与经蛋白酶处理清洁的细胞表面紧
密接触。电极尖端与膜之间的接触，使尖端内的 小片膜与其余部位在电学上绝缘，形成50MΩ封接， 保证了电流经微电极进入测量电路。以后，Neher 又作了改进，用负压轻吸微电极造成管口与膜脂
质双层之间非常紧密的封接（千兆欧封接）。千
膜片钳法的各种模式图
膜片钳技术的优缺点
• 膜片钳技术的最主要的优点在于阻抗封接形成的结果 使漏出电流极少，所以能正确地进行电压固定。然而 不足的是，在形成巨阻抗封接时，由于腔内负压的作 用使膜片被吸入微电极腔内，形成所谓的“Ω”形膜片， 从而造成不可避免的机械性刺激。
• 由巨阻抗封接带来的第二大优点是背底噪声水平达到 极低。因为由热噪声引起漂移的标准误差与阻抗的平 方根值成正比，所以巨阻抗封接是可达到最小。此外， 虽然所用的膜片钳放大器的探头场效应管运算放大器 电压噪声较小，但对其也不能忽视。由于膜片微电极 在安装时的阻抗性电流噪声与封接阻抗（Rs ）成反比， 故也可因巨阻抗封接而大大减小。
电流、电导以及通道开放的时间机率及通道的动 力学特性等皆可被测定。
• 第二，微电极尖端管口和膜之间封接的机械强度不同， 可以产生几种不同的记录方式。不同的记录方式可用 来研究通透性的不同方面。微电极尖端管口所围绕的 细胞膜就是要观察离子通道变化的“膜片”，如果在 这一小片膜上只含有一个或少数几个通道蛋白分子， 则可通过离子通道电导的特点，测定出单一通道开放 时的离子电流，从而对单通道的功能特性进行分析。 他们应用这套技术顺利地记录了蛙肌肉细胞上单一离 子通道电流。结果显示，蛙肌肉细胞的细胞膜上一个 离子通道可通过的电流约为20×10-12A，换成离子数 目大约是每秒通过一亿个离子。此后，他们又对离子 通道的运作，细胞分泌过程及通道的调节功能进行了 研究。
膜片钳技术原理图
Electrophysiology-Apparatus
Faraday cage
Microscope
CCD Camera
Vibration Isolation Table
Micro-Manipulators Remote Controller
Amplifiers
Electrophysiology-Apparatus
直从事电生理学方 面的研究
1976年Neher和Sakmann合作发明了patch clamp
技术，发现了细胞膜存在离子通道，而共同获得 1991年诺贝尔奖。
前言
• 1976年Neher和Sakmann建立了膜片钳技术 （patch clamp recording technique）。这是一种 以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上 单一的（或多个的）离子通道分子活动的技术。 以后由于吉欧姆阻抗封接（109Ω）方法的确立和 几种方法的创建，1980年以来，此技术已可用于 很多细胞系的研究。
• 在膜片钳技术出现之前，在电压固定条件下进行 的细胞膜电流记录法，只能向细胞内刺入二根电 极或者蔗糖和凡士林进行双重缝隙法（dual gap） 从细胞外进行记录，但这两种方法仅适用于非常 大的细胞。相反地，应用膜片钳法时对一般较小 细胞也能在电位固定的条件下记录出电流。这也 是膜片钳法的一个很大的优点。此外，膜片钳技 术还有可以直接控制细胞内环境的优点，同时也 存在相反的一面，即比较小的胞质中可动分子可 被渗漏，这又是它的不足之处。
膜片钳技术的意义
• 使影响膜通道因素单一化：在同一细胞膜上通道的种 类很多，可受到如化学、电压和机械等多种因素的影响 而改变其机能状态。如果细胞在活动过程中，始终认为 地维持其膜电位不变，清除了离子流的变化和膜电位变 化之间的相互作用，可使观察因素相对简单化。 • 使参与活动的离子通道单一化：由于静息膜电位的水 平可分别影响不同类型的离子通道，如果有意改变并维 持某一膜电位水平，将使一类膜离子通道首先失活，消 除这一类或几类通道的活动对实验结果的影响，再用一 些特异性离子通道阻断剂后，就可观察剩余通道的活动 规律。使参与活动的离子通道相对单一化。
1991年诺贝尔生理医学奖
膜片钳技术ຫໍສະໝຸດ Baidu
主讲人：唐国奎
获奖者简介
Neher出生于1944年，德 国人
1965年毕业于Wisconsin
University 1976年在耶鲁大学医学 院取得医学博士学位
此后长期从事基础医学 研究
Sakmann1942年出
生于德国的斯图加 特市
1963年毕业于 Tubingen 大学，一
A显示出玻璃微电极接触进入至细胞中。B则是使用高级 放大仪，将膜上的离子通道与微量吸管的尖端相触，以放
大一部分的细胞膜。其中，微量吸管内连接了电流放大器。 D表示电流通过离子通道，离子通道开启。C为通道的高 度放大：细胞外覆有受体以及离子滤器。
细胞膜电流的测定
膜片钳技术的原理
• 膜片钳技术是用玻璃微电极（膜片电极或膜片吸管） 接触细胞膜，以吉欧姆（GΩ）以上的阻抗使之封接， 使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域（膜片） 与其周围在电学上绝缘，在此基础上固定电位，对 此膜片上的离子通道的离子电流（pA级）进行监测 记录的方法。
DAD-VC system
MicroManipulators
CCD Camera
Patch clamp
膜片钳法的各种模式
• 首先建立的单通道记录法（single channel recording）是细胞吸附式（cell-attached mode），其 后又建立了膜内面向外模式（inside-out）和膜外面 向外（outside-out）的模式。后来，又分别建立了开 放细胞吸附内面向外模式（open cell-attached insideout mode）和穿孔囊泡外面向外模式（perforated cell-attached inside-out mode）。全细胞记录法是指 在常规的方法的基础上，附加穿孔膜片（perforated patch）的模式。
• Neher和Sakmann将直径1~5μm的玻璃微电极在火 上抛光，然后与经蛋白酶处理清洁的细胞表面紧
密接触。电极尖端与膜之间的接触，使尖端内的 小片膜与其余部位在电学上绝缘，形成50MΩ封接， 保证了电流经微电极进入测量电路。以后，Neher 又作了改进，用负压轻吸微电极造成管口与膜脂
质双层之间非常紧密的封接（千兆欧封接）。千
膜片钳法的各种模式图
膜片钳技术的优缺点
• 膜片钳技术的最主要的优点在于阻抗封接形成的结果 使漏出电流极少，所以能正确地进行电压固定。然而 不足的是，在形成巨阻抗封接时，由于腔内负压的作 用使膜片被吸入微电极腔内，形成所谓的“Ω”形膜片， 从而造成不可避免的机械性刺激。
• 由巨阻抗封接带来的第二大优点是背底噪声水平达到 极低。因为由热噪声引起漂移的标准误差与阻抗的平 方根值成正比，所以巨阻抗封接是可达到最小。此外， 虽然所用的膜片钳放大器的探头场效应管运算放大器 电压噪声较小，但对其也不能忽视。由于膜片微电极 在安装时的阻抗性电流噪声与封接阻抗（Rs ）成反比， 故也可因巨阻抗封接而大大减小。