第14章 分子发光分析法

analysis
relation between fluorescence and molecular structure
14.4 磷光光谱法 molecular phosphorescence
2013-7-15
第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家
N.Monardes ， 1575 年 他 提 到 在 含 有 一 种 称 为 “ Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝
J
分子能级示意图
5 4 3 2 1
0
S2
5 4 3 2 1 T2
S1 2
1
0
0
5 4 3 2 1
0
T1
第一、第二 、…电子激发 单重态 S1 、 S2… ； 第一、第二 、…电子激发 三重态 T1 、 T2 … ；

S0 2013-7-15
5 4 3 2 1
0
单重态与三重态
受激有机分子的电子激发态可以归纳为两种状态：
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14.1.5 影响荧光强度的因素
1. 分子结构
（1）跃迁类型：* → 的荧光效率高，系间窜越过程的速 率常数小，有利于荧光的产生； （2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移 （3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作 用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光 素有很强的荧光，酚酞却没有。 （4）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。
1. 激发光谱
固定发射波长 扫描激发波长 荧光激发光谱与 紫外-可见吸收光 谱类似
固定em=620nm(MAX)
ex =290nm (MAX)
0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
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2. 发射光谱(荧光光谱) 固定激发波长 扫描发射波长
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外转换
14.1.2 荧光(磷光)的量子效率
荧光量子效率的定义：
发射荧光的分子数 F 激发分子总数
F
kF k F ki
i 1 n
发射的光子数 吸收的光子数
kF、 主要取决与荧光物质的分子结构； ki主要取决化学环境， 同时也与荧光物质的分子结构有关。 大多数的荧光物质的量子效率在0.1~1之间； 例如：0.05mol/L的硫酸喹啉，F=0.55； 荧光素 F=1 化合物
撞，从而使荧光分子以无辐射形式跃迁回到基态；氧的熄灭
作用； 自猝灭：荧光物质浓度较大时，激发态分子与基态分子碰撞 。
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（5）内滤作用
内滤作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的
荧光，使得体系的荧光减弱。如色胺酸中的重铬酸钾。
自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
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(1) 跃迁的类型
对于有机荧光物质:
n →π* εmax＜ 100 π→π* εmax≥104
π * →π
π* → n
平均寿命10-5~10-7sec 平均寿命10-7~10-9sec ; kS → T小
π*→π 是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。 强荧光的有机化合物具备下特征: ①具有大的共轭π键结构； ②具有刚性的平面结构；
③最低的单重电子激发态为S1为π * →π型； ④取代基团为给电子取代基。
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(2) 共轭效应 产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越 大，离域大π键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易产生。 例如芳香族化合物：
化合物 苯 0.11 205 278 萘 0.29 286 321 蒽 0.46 365 400 丁 省 0.60 390 480 戊 0.52 580 640 省
特点
（1）灵敏度高
检测下限：0.1～0.001g/cm-3 （2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱； （3）试样量少
缺点：应用范围小。
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定量依据与方法
(1)定量依据
荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率 ：
If = Ia
由朗-比耳定律： Ia = I0(1-10- l c )
C H
C
H
F=0.75
F=0.03
反式二苯乙烯 强荧光物质
顺式二苯乙烯 非荧光物质
电离效应对荧光发射的影响
OH O-
OH
O-
OHH+
OHH+
pH=1, 有荧光
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pH=13, 无荧光
无荧光
有荧光
(4) 结构刚性效应 荧光物质的刚性和平面
芴 联苯
性增加，有利于荧光发射。
F=1
F=0.2
P/F
λ Fmax(nm) λ Pmax (nm) τ
p(s)
含有重原子的溶剂，由于重原子效应荧光减弱、磷光增强。
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4）取代基的位置**** 空间位阻对荧光发射的影响
H3C -O3S N CH3
H3C SO3N CH3
立体异构体对荧光发射的影响
H C H C
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14.1 荧光和磷光的基本原理
14.1.1 分子荧光和磷光的产生
E2
分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂---
υ υ
, ,
2
1
υ ,0 E1 υ υ υ
2
3 2 1 0 3 2 1 0 3 2 1 0
在每个电子能级上，都存在振动、
转动能级；
J J J
1
0
E0
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3 2 1 0
If = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c )
浓度很低时，将括号项近似处理后：
If = 2.3 I0 l c = Kc
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（2）定量方法
标准曲线法：
配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲
线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线 上求出浓度；
2）吸电子取代基减弱荧光 —C=0， —NO2，— COOH
不产生 p →π共轭
O
NO2
硝基苯：不产生荧光、弱磷光
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二苯甲酮：弱荧光、强磷光 S1 →T1的系间窜跃产率接近1
3) 重原子取代基效应
—Cl， — Br ， —I
S1 →T1的系间窜跃由于重原子的存在增强
化合物 萘 0.093 315 470 2.6 1-甲基萘 0.053 318 476 2.5 1-氟萘 0.068 316 473 1.4 1-氯萘 5.2 319 483 0.23 1-溴萘 6.4 320 484 0.014 1-碘萘 >1000 ~ 488 0.0023
F
λexmax(nm) λemmax (nm)
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(3) 取代基效应
1）给电子取代基加强荧光 —HN2， — NHR ， —NR2， — OH， — OR 产生 p →π共轭 化合物
相对荧光强度
苯 10
苯酚 18
苯胺 20
苯基氰 20
苯甲醚 20
λ emmax (nm) 278~310 285~365 310~405 280~390 285~345
比较法：
在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；
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荧光分析法的应用
(1)无机化合物
与有机试剂配合形成荧光配合物后测量；可测量约60多种元 素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；
14.1 荧光和磷光的基本原理
第十四章 分子发光光谱法
molecular luminescence
luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence
14.2 分子荧光光谱仪
fluorescence spectroscopy 14.3 分子荧光光谱法的应用
S1
T1
S0
基态
S0
激发态单重态
S0
激发态三重态
分子电子激发态的多重性：M=2S+1; S为电子自旋量子数的 代数和(0或1)；大多数有机分子电子数偶数，基态：电子自旋 成对，是单重态；激发态：单重态、三重态；三重态能级比相 应单重态能级低（洪特规则）；
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荧光和磷光的产生；分子的去激发
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14.2 分子荧光光谱仪
测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 光源：氙灯和高压汞灯， 或染料激光器(可见与紫外 区) 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 检测器：光电倍增管。 2013-7-15
F
0.11
0.29
0.46
0.60
0.52
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14.1.3 分子荧光光谱
荧光激发光谱与发射光谱
荧光(磷光)均为光致发光
MX hv i MX *
i 1
n
MX MX hv j
* j 1
n
IF4800
4400 4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
蓝移:
△ E n →π*
＜
△ E n →π*
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几
（3）溶液pH
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制，例
如苯胺；
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（4）荧光猝灭
荧光猝灭：荧光分子与其他溶质分子之间相互作用，使荧光 强度减弱。引起荧光强度降低的物质-猝灭剂 碰撞猝灭（动态猝灭）：被激发的荧光分子与猝灭剂发生碰
色。
直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光 度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这 种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不 是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念， 他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。 1867年，Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作， 应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定。 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由 Jette和West提出了第一台荧光计。
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-O
O C
O
N N
荧光素 不产生荧光
产生荧光
偶氮苯
COO-
F=0.92
-O C COOO
N N
偶氮菲
酚酞 产生荧光 不产生荧光
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2. 环境因素
（1）溶剂的影响
无溶剂化作用 △ Eπ→π* ＞ 有溶剂化作用 △ Eπ→π*
在极性溶剂中：
红移:
（2）温度的影响
率增加；
铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；
铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定
(2) 有机化合物
见表 2013-7-15
2013-7-15
2013-7-15
荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有 荧光发射的同时测量磷光。 测量方法：
14.4 磷光光谱法（理解）
通常借助于荧光和磷
光寿命的差别，采用 磷光镜的装置将荧光 隔开。
紫外-可见分光光度计:
光源 单色器 样品池 检测器 数据处理 仪器控制
荧光(磷光)分光光度计:
激发 单色器
光源
样品池
发射 单色器
检测器
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数据处理 仪器控制
紫外-可见分光光度计 测量池(吸收池)
荧光分光光度计 样品池
It
It IF,p I0
I0
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14.3 分子荧光光谱法的应用
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14.1.4 荧光光谱的特征
1.Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比 激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 2. 镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样 ）成镜像对称关系。
3 2 1 0
S1
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3 2 1 0
S0
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荧光激发光谱
荧光发射光谱
200
250
300
350
400
450
500
蒽的激发光谱和荧光光谱 /nm
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3.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长 的能量(如能级图 2 , 1)，产生不同吸收带， 但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃 迁回到基态，产生波长一定的荧光(如 ’2 )。
振动弛豫
S2
内转换
反系间 窜跃
系间 窜跃
１. 辐射跃迁的类型 荧 磷 光：10-8 sec 光：10~10-3 sec
紫 外 可 见 吸 收 光 谱
S1
２. 无辐射跃迁的类型 振动弛豫: Vr 10-12sec T1 外 转 换:无辐射跃迁 回到基态
荧光 磷 光
内 转 换:S2~S1能级
之间有重叠 系间窜跃: S1~T1能级 之间有重叠 反系间窜跃:由外部获 取能量后 T1 ~ S1