第二章 生物材料的预处理和细胞破碎及固液分离
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第2章 细胞分离与破碎
BIOSEPARATION ENGINEERING
另外，向含菌体的料液中加入聚丙 另外，向含菌体的料液中加入聚丙 烯酰胺或聚乙烯亚胺等高分子絮凝 烯酰胺或聚乙烯亚胺等高分子絮凝 剂，可使菌体之间产生架桥作用而 形成较大的凝聚颗粒。 形成较大的凝聚颗粒。 凝聚或絮凝不仅有利于重力沉降， 凝聚或絮凝不仅有利于重力沉降， 而且还可以在过滤分离中大大提高 过滤速度和质量。 过滤速度和质量。当培养液中含有 蛋白质时． 蛋白质时．可使部分蛋白质凝聚而 同时过滤除去。 同时过滤除去。
1）对滤液进行絮凝或凝聚预处理，改变料液性质 2）在料液中加入助滤剂（如硅藻土）
2 细胞破碎
概述： 概述：
BIOSEPARATION ENGINEERING
许多生物产物在细胞培养过程中不能分泌到胞 外的培养液中，而保留在细胞内。 外的培养液中，而保留在细胞内。 这类生物产物需用上节所述方法收集菌体或细 胞后，进行细胞破碎(cell disruption)，使目 胞后，进行细胞破碎 ， 标产物选择性地释放到液相中。 标产物选择性地释放到液相中。 破碎的细胞或其碎片利用上节所述的固液分离 方法(主要是离心法 除去后， 主要是离心法)除去后 方法 主要是离心法 除去后，上清液用于进一 步的分离纯化。 步的分离纯化。
BIOSEPARATION ENGINEERING
1.3 过滤
利用薄片形多孔性介质(如滤布)截留固液悬 浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法 过滤是一种膜分离法
BIOSEPARATION ENGINEERING
滤液的透过阻力主要来自于：过滤介质和介 质表面堆积的滤饼 滤饼阻力是影响过滤速度的主要因素 提高过滤速度方法：
BIOSEPARATION ENGINEERING
生物材料的预处理、细胞破碎和液固分离幻灯片
甲苯破碎酵母 细胞
碱处理法 碱的皂化作用使细胞壁融解 制丙酮粉 丙酮脱水破坏结合键
剧烈 温和
便宜 高
影响因素：
分子量：大，效果好；过大， 溶解度↓
用量：低浓度增加用量有助架 桥，浓度过高吸附饱和失去架 桥作用，降低了效果。
pH：影响功能团电离度，电离 度↑，链伸展， 效果↑
操作条件：
搅拌：初期，快好；后期， 会破坏絮凝团
〔3〕变性作用
天然蛋白质分子受到某些物理因素〔如热、紫外线照射、 高压和外表张力等〕、化学因素〔如有机溶剂、脲、 胍、酸、碱等〕影响时，生物活性丧失，溶解度降低， 不对称性增高以及其他的物理化学常数发生改变。
2.过滤设备 板框过滤机
真空鼓式过滤机
3.过滤介质和助滤剂
〔1〕过滤介质
滤布或膜 耐酸碱、高温、化学试剂、抗拉性能好、有一
定的机械强度和孔隙度等
〔2〕助滤剂 要求为惰性物质、无毒、有一定细度及硬度，
本钱低廉。 参加方法： —预铺法：预铺在过滤机上 — 混合法：与发酵液一起参加 — 生成法：反响中生成沉淀 新生霉素发酵液： 常用有：硅藻土、纸浆、石棉、纤维素等
枯草杆菌的碱性蛋白酶发酵液： 氯化钙+磷酸盐 磷酸钙盐沉淀〔吸附、助滤〕
〔5〕等电沉淀 — 常与其他方法合用
〔6〕加各种沉淀剂沉淀 — 沉淀剂与蛋白质形成复合物沉淀
2.多糖的去除
酶：转化为单糖 如发酵液中残留的淀粉：淀粉酶
粘多糖与一些阳离子外表活性剂如十六烷基溴化 铵〔CTAB〕形成沉淀
3.高价金属离子的去除
〔2〕生物分子对环境反响十分敏感，构造与功能关系 比较复杂，生物活性物质离开生物体后，易变性，破 坏，必须十分小心的保护这些化合物的生理活性。
碱处理法 碱的皂化作用使细胞壁融解 制丙酮粉 丙酮脱水破坏结合键
剧烈 温和
便宜 高
影响因素：
分子量：大，效果好；过大， 溶解度↓
用量：低浓度增加用量有助架 桥，浓度过高吸附饱和失去架 桥作用，降低了效果。
pH：影响功能团电离度，电离 度↑，链伸展， 效果↑
操作条件：
搅拌：初期，快好；后期， 会破坏絮凝团
〔3〕变性作用
天然蛋白质分子受到某些物理因素〔如热、紫外线照射、 高压和外表张力等〕、化学因素〔如有机溶剂、脲、 胍、酸、碱等〕影响时，生物活性丧失，溶解度降低， 不对称性增高以及其他的物理化学常数发生改变。
2.过滤设备 板框过滤机
真空鼓式过滤机
3.过滤介质和助滤剂
〔1〕过滤介质
滤布或膜 耐酸碱、高温、化学试剂、抗拉性能好、有一
定的机械强度和孔隙度等
〔2〕助滤剂 要求为惰性物质、无毒、有一定细度及硬度，
本钱低廉。 参加方法： —预铺法：预铺在过滤机上 — 混合法：与发酵液一起参加 — 生成法：反响中生成沉淀 新生霉素发酵液： 常用有：硅藻土、纸浆、石棉、纤维素等
枯草杆菌的碱性蛋白酶发酵液： 氯化钙+磷酸盐 磷酸钙盐沉淀〔吸附、助滤〕
〔5〕等电沉淀 — 常与其他方法合用
〔6〕加各种沉淀剂沉淀 — 沉淀剂与蛋白质形成复合物沉淀
2.多糖的去除
酶：转化为单糖 如发酵液中残留的淀粉：淀粉酶
粘多糖与一些阳离子外表活性剂如十六烷基溴化 铵〔CTAB〕形成沉淀
3.高价金属离子的去除
〔2〕生物分子对环境反响十分敏感，构造与功能关系 比较复杂，生物活性物质离开生物体后，易变性，破 坏，必须十分小心的保护这些化合物的生理活性。
生物工艺学第二章发酵液的预处理与固液分离2
收集胞内产物的细胞或菌体，分离除 去液相，
收集含生化物质的液相，分离除去固 体悬浮物（细胞、菌体、细胞碎片、 蛋白质的沉淀物和它们的絮凝体等）。
42
二 常见的固液分离方法
过滤 离心 膜分离 双水相萃取 ATPS 扩张床吸附 EBA
43
（一） 过 滤
过滤操作是借助于过滤介质，在一定的 压力差ΔP作用下，使悬浮液中的液体通过 介质的孔道，而固体颗粒被截留在介质上， 从而实现固液分离的单元操作。
发酵液中的杂质
A.高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）
在采用离子交换提炼时，会影响树脂对生化物质的交换容量。
B.杂蛋白
常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞，影响过滤效率。 采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力， 有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化，使两相分离不清。
因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。
4
为何要对发酵液进行预处理？
固液分离方法主要是过滤和离心。 对于细菌及某些放线菌，菌体细小，液体粘度
大，不能直接过滤，若用高速离心，能耗很大， 设备昂贵。若用膜分离技术（如微滤）易产生 膜污染，通量降低。 发酵液中由于菌体自溶，核酸、蛋白质及其它 有机粘性物质的存在也会影响固液分离。 因而寻找一种经济有效的方法来提高固液分离 速度显得十分必要。
24
目前最常见：聚丙烯酰胺类絮凝剂
聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点
用量少，一般以mg/L计量； 絮凝体粗大，分离效果好； 絮凝速度快； 种类多，适用范围广。
聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点：
存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺， 用于食品和医药工业时应谨慎。
25
2）天然有机高分子絮凝剂
收集含生化物质的液相，分离除去固 体悬浮物（细胞、菌体、细胞碎片、 蛋白质的沉淀物和它们的絮凝体等）。
42
二 常见的固液分离方法
过滤 离心 膜分离 双水相萃取 ATPS 扩张床吸附 EBA
43
（一） 过 滤
过滤操作是借助于过滤介质，在一定的 压力差ΔP作用下，使悬浮液中的液体通过 介质的孔道，而固体颗粒被截留在介质上， 从而实现固液分离的单元操作。
发酵液中的杂质
A.高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）
在采用离子交换提炼时，会影响树脂对生化物质的交换容量。
B.杂蛋白
常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞，影响过滤效率。 采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力， 有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化，使两相分离不清。
因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。
4
为何要对发酵液进行预处理？
固液分离方法主要是过滤和离心。 对于细菌及某些放线菌，菌体细小，液体粘度
大，不能直接过滤，若用高速离心，能耗很大， 设备昂贵。若用膜分离技术（如微滤）易产生 膜污染，通量降低。 发酵液中由于菌体自溶，核酸、蛋白质及其它 有机粘性物质的存在也会影响固液分离。 因而寻找一种经济有效的方法来提高固液分离 速度显得十分必要。
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目前最常见：聚丙烯酰胺类絮凝剂
聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点
用量少，一般以mg/L计量； 絮凝体粗大，分离效果好； 絮凝速度快； 种类多，适用范围广。
聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点：
存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺， 用于食品和医药工业时应谨慎。
25
2）天然有机高分子絮凝剂
第二章 预处理及固—液分离
4、过滤技术在生物技术中的应用
23、惰性助滤剂的使用
1）基本概念和使用方法
种颗粒均匀．质地坚硬．不可压缩的粉状或纤维状 的固体，能形成疏松结构。它能使滤饼疏松，减 小过滤阻力．使滤速增大，提高滤饼的刚性和孔 隙率的惰性材料。
要求：作助滤剂的物质应能较好地悬浮于料液 中，且颗粒大小合适，助滤剂中还不应含有可溶 于滤液的物质，以免污染滤液。助滤剂必须不吸 附或很少吸附生化物质。
对于好的定形的晶体，这是一种最直接的步
骤。常用来分离固体量较大的悬浮液.
在过滤操作中，要求滤速快、滤液澄清，并且有高的收 率。
根据过滤机理，过滤操作可分为澄清过滤和滤饼过滤。
澄清过滤：
过滤介质为硅藻土、砂、颗粒活性炭、玻璃珠、塑料颗粒等，当悬浮液通过滤 层时，固体颗粒被阻拦或吸附在滤层的颗粒上，使滤液得以澄清，适合于固体 含量少于0.1g/100ml、颗粒直径在5-100um的悬浮液的过滤分离，如河水、麦 芽汁、酒类和饮料等的澄清。
2）固体剪切：研磨，珠磨，捣碎。
• 高速珠磨法
• 设备是珠后机，瑞士WBC公司和德国西门 子机械公司均制造各种型号的珠磨机，其破碎机 下：微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌浆 作用下充分混合，珠子之间以及珠子和细胞之间 和互相剪切、碰撞，促使细胞壁破碎，释出内含 物，在珠波分离器的协助下，珠子被滞留在破碎 室内，浆液流出，从而实现连续操作，破碎中， 生的热量由夹套中的冷却液带走。 存在的问题：操作参数多，一般赁经验估计 并且珠子之间的液体损失30％左右。
4.酶解法（enzymatic lysis）：
外加酶法： 根据细胞壁的结构和组成特点，选用适当的酶：溶菌酶、 纤维素酶、蜗牛酶、半纤维素酶、脂酶等，将细胞壁分解， 使细胞内含物释放出来。有些细菌对溶菌酶不敏感，加入 少量巯基试剂或8摩尔尿素处理后，使之转为对溶菌酶敏 感而溶解。 自溶法（autolysis）: 在一定PH和适当的温度下，利用组织细胞内自身的酶系 统将细胞破碎的方法。此过程需较长时间，常用少量防腐 剂如甲苯、氯仿等防止细胞的污染。
23、惰性助滤剂的使用
1）基本概念和使用方法
种颗粒均匀．质地坚硬．不可压缩的粉状或纤维状 的固体，能形成疏松结构。它能使滤饼疏松，减 小过滤阻力．使滤速增大，提高滤饼的刚性和孔 隙率的惰性材料。
要求：作助滤剂的物质应能较好地悬浮于料液 中，且颗粒大小合适，助滤剂中还不应含有可溶 于滤液的物质，以免污染滤液。助滤剂必须不吸 附或很少吸附生化物质。
对于好的定形的晶体，这是一种最直接的步
骤。常用来分离固体量较大的悬浮液.
在过滤操作中，要求滤速快、滤液澄清，并且有高的收 率。
根据过滤机理，过滤操作可分为澄清过滤和滤饼过滤。
澄清过滤：
过滤介质为硅藻土、砂、颗粒活性炭、玻璃珠、塑料颗粒等，当悬浮液通过滤 层时，固体颗粒被阻拦或吸附在滤层的颗粒上，使滤液得以澄清，适合于固体 含量少于0.1g/100ml、颗粒直径在5-100um的悬浮液的过滤分离，如河水、麦 芽汁、酒类和饮料等的澄清。
2）固体剪切：研磨，珠磨，捣碎。
• 高速珠磨法
• 设备是珠后机，瑞士WBC公司和德国西门 子机械公司均制造各种型号的珠磨机，其破碎机 下：微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌浆 作用下充分混合，珠子之间以及珠子和细胞之间 和互相剪切、碰撞，促使细胞壁破碎，释出内含 物，在珠波分离器的协助下，珠子被滞留在破碎 室内，浆液流出，从而实现连续操作，破碎中， 生的热量由夹套中的冷却液带走。 存在的问题：操作参数多，一般赁经验估计 并且珠子之间的液体损失30％左右。
4.酶解法（enzymatic lysis）：
外加酶法： 根据细胞壁的结构和组成特点，选用适当的酶：溶菌酶、 纤维素酶、蜗牛酶、半纤维素酶、脂酶等，将细胞壁分解， 使细胞内含物释放出来。有些细菌对溶菌酶不敏感，加入 少量巯基试剂或8摩尔尿素处理后，使之转为对溶菌酶敏 感而溶解。 自溶法（autolysis）: 在一定PH和适当的温度下，利用组织细胞内自身的酶系 统将细胞破碎的方法。此过程需较长时间，常用少量防腐 剂如甲苯、氯仿等防止细胞的污染。
《生化分离工程》思考题及答案
《生化分离工程》思量题及答案第一章绪论1、何为生化分离技术？其主要研究那些内容？生化分离技术是指从动植物组织培养液和微生物发酵液中分离、纯化生物产品的过程中所采用的方法和手段的总称。
2、生化分离的普通步骤包括哪些环节及技术？普通说来，生化分离过程主要包括 4 个方面：①原料液的预处理和固液分离，常用加热、调 PH、凝结和絮凝等方法；②初步纯化(提取)，常用沉淀、吸附、萃取、超滤等单元操作；③高度纯化(精制)，常选用色谱分离技术；④成品加工，有浓缩、结晶和干燥等技术。
3、生化分离工程有那些特点，及其重要性？特点： 1、目的产物在初始物料(发酵液)中的含量低； 2、培养液是多组分的混合物，除少量产物外，还有大量的细胞及碎片、其他代谢物(几百上千种)、培养基成份、无机盐等； 3、生化产物的稳定性低，易变质、易失活、易变性，对温度、pH 值、重金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等非常敏感； 4、对最终产品的质量要求高重要性：生物技术产品普通存在于一个复杂的多相体系中。
惟有经过分离和纯化等下游加工过程，才干制得符合使用要求的产品。
因此产品的分离纯化是生物技术工业化的必需手段。
在生物产品的开发研究中，分离过程的费用占全部研究费用的 50％以上；在产品的成本构成中，分离与纯化部份占总成本的 40~80％；精细、药用产品的比例更高达 70~90％。
显然开辟新的分离和纯化工艺是提高经济效益或者减少投资的重要途径。
5、为何生物技术领域中往往浮现“丰产不丰收”的现象？第二章预处理、过滤和细胞破碎1、发酵液预处理的目的是什么？主要有那几种方法？目的：改变发酵液的物理性质，加快悬浮液中固形物沉降的速率；出去大部份可溶性杂质，并尽可能使产物转入便于以后处理的相中(多数是液相)，以便于固液分离及后提取工序的顺利进行。
：①加热法。
升高温度可有效降低液体粘度，从而提高过滤速率，常用于粘度随温度变化较大的流体。
控制适当温度和受热时间，能使蛋白质凝结形成较大颗粒，进一步改善发酵液的过滤特性。
预处理和固液分离
第三章
第一节
第二节
第三节
三、化学法（Chemical treatment）
（一）、加入化学试剂 1、用碱处理 2、用脂溶性有机溶剂 3、表面活性剂 （二）酶解法（Enzymatic lysis） （三）制成丙酮粉
第三章
第一节
第二节
第三节
四、选择破碎方法的依据
（一）、规模及成本 工业规模：高压匀浆和珠磨 （二）、目的物的稳定性 （三）、破碎效果和产物释放率
第三章
第一节
第二节
第三节
三、细胞培养液的预处理
（一）、杂蛋白质的去除 1、加入凝聚剂 2、加入絮凝剂 3、吸附 4、等电点沉淀 5、加各种沉淀剂沉淀 6、变性沉淀
第三章
第一节
第二节
第三节
1、凝聚(coagulation)
凝聚作用是指在某些电解质作用下，使胶体粒子的 扩散双电层的排斥电位降低，破坏了胶体系统的分 散状态，而使胶体粒子聚集的过程。
{
第三章
第一节
第二节
第三节
第二节 细胞破碎
第三章
第一节
第二节
第三节
概述
细胞破碎
细胞破碎（cell disruption）技术是指利用外力破坏细 胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放 出来的技术。 细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物 质（产品）的基础。 随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认 为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。
第三节
一、选择预处理方法的依据
1、生物活性物质来源、存在状态: “胞内” 、“胞外”、前体 2、后续工艺要求 3、稳定性 可被材料中酶、微生物破坏，还可能受 酸、碱、盐、重金属离子、机械搅拌、温 度、甚至空气和光线作用改变活性。
第一节
第二节
第三节
三、化学法（Chemical treatment）
（一）、加入化学试剂 1、用碱处理 2、用脂溶性有机溶剂 3、表面活性剂 （二）酶解法（Enzymatic lysis） （三）制成丙酮粉
第三章
第一节
第二节
第三节
四、选择破碎方法的依据
（一）、规模及成本 工业规模：高压匀浆和珠磨 （二）、目的物的稳定性 （三）、破碎效果和产物释放率
第三章
第一节
第二节
第三节
三、细胞培养液的预处理
（一）、杂蛋白质的去除 1、加入凝聚剂 2、加入絮凝剂 3、吸附 4、等电点沉淀 5、加各种沉淀剂沉淀 6、变性沉淀
第三章
第一节
第二节
第三节
1、凝聚(coagulation)
凝聚作用是指在某些电解质作用下，使胶体粒子的 扩散双电层的排斥电位降低，破坏了胶体系统的分 散状态，而使胶体粒子聚集的过程。
{
第三章
第一节
第二节
第三节
第二节 细胞破碎
第三章
第一节
第二节
第三节
概述
细胞破碎
细胞破碎（cell disruption）技术是指利用外力破坏细 胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放 出来的技术。 细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物 质（产品）的基础。 随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认 为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。
第三节
一、选择预处理方法的依据
1、生物活性物质来源、存在状态: “胞内” 、“胞外”、前体 2、后续工艺要求 3、稳定性 可被材料中酶、微生物破坏，还可能受 酸、碱、盐、重金属离子、机械搅拌、温 度、甚至空气和光线作用改变活性。
生物分离工程预处理和固液分离
发酵液的预处理和固液分离
悬浮液的预处理
高分子絮凝剂的吸附架桥作用
发酵液的预处理和固液分离
悬浮液的预处理
常用的絮凝剂
聚丙烯酰胺（po1yacry1amide）类和聚乙烯亚胺
（polyethyleneimine）衍生物，根据活性基团在水中解离情况不同， 可分为非离子型、阴离子型（含有羧基）和阳离子型（含有胺基）三 类。由于聚丙烯酰胺类絮凝剂具有用量少，一般以ppm计量，絮凝体 粗大，分离效果好，絮凝速度快以及种类多等优点，所以适用范围广。 聚丙烯酸类阴离子絮凝剂和聚苯乙烯类衍生物。 无机高分子聚合物也是较好的一类絮凝剂，如聚合铝盐和聚合铁盐等。 天然有机高分子絮凝剂，如壳聚糖和葡聚糖等聚糖类，还有明胶、骨 胶、海藻酸钠等。 微生物絮凝剂是近年来研究和开发的新型絮凝剂，它是一类由微生物 产生的具有絮凝细胞功能的物质。主要成分是糖蛋白、粘多糖、纤维 素及核酸等高分子物质。微生物絮凝剂和天然絮凝剂与化学合成的絮 凝剂相比，最大的优点是安全，无毒和不污染环境。
凝聚和絮凝在发酵液预处理中的应用
凝聚和絮凝技术能有效的改变细胞菌体和蛋 白质等胶体粒子的分散状态,使其聚集起来,增大 体积以便固液分离,常用于菌体细小而且黏度大的 发酵液的预处理中.
发酵液的预处理和固液分离
悬浮液的预处理
发酵液的带电现象
发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子的表面，一般
都带有电荷，带电的原因很多，主要是吸附溶液中的离子 或自身基团的电离。通常发酵液中细胞或菌体带有负电荷， 由于静电引力的作用使溶液中带相反电荷的粒于（即正离 子）被吸附在其周围，在界面上形成了双电层。 但是这些正离子还受到使它们均匀分布开去的热运动的影 响，具有离开胶粒表面的趋势，在这两种相反作用的影响 下，双电层就分裂成两部分，在相距胶核表面约一个离子 半径的stern平面以内，正离子被紧密束缚在胶核表面，称 为吸附层或stern层；在stern平面以外，剩余的正离子则 在溶液中扩散开去，距离越远，浓度越小，最后达到主体 溶液的平均浓度，称为扩散层。这样就形成了扩散双电层 的结构模型。
蛋白质分离纯化的一般程序
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。
所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。
常用的破碎组织细胞的方法有：1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。
常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。
2. 渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。
3. 反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。
这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。
4. 超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。
5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。
(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。
抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。
如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。
在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。
（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。
比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。
常用的有下列几种方法：1. 等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。
2. 盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。
被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。
3. 有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。
能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。
此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。
由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。
预处理和固液分离生物分离工程
பைடு நூலகம்详细描述
过滤分离法是一种常用的固液分离技术，通 过使用具有不同孔径的滤材，将溶液中的固 体颗粒截留在滤材表面或内部，从而实现固 液分离。该方法具有操作简便、分离效果稳 定的特点，广泛应用于各种工业生产中。
离心分离法
总结词
利用离心力的作用使物质进行分离的方法。
详细描述
离心分离法是一种高效的固液分离技术，通 过高速旋转的离心机产生强大的离心力，使 溶液中的固体颗粒和液体有效分离。该方法 适用于大规模的固液分离，具有分离效率高 、处理能力强的优点。离心分离法在制药、
总结词
利用物质在溶液中的溶解度差异进行分 离的方法。
VS
详细描述
沉淀分离法是一种常见的固液分离技术， 通过在溶液中加入适当的沉淀剂，使目标 物质从溶液中析出，从而实现分离。该方 法适用于从大量溶液中分离微量物质的情 况，具有操作简便、成本低廉的优点。
过滤分离法
总结词
利用滤材的孔径大小进行物质截留的方法。
另外，还可以利用酶的生物活性进行 分离纯化，如酶反应法、酶抑制法等 。
04
生物分离工程的应用
在医药领域的应用
抗生素分离
通过生物分离技术，从微生物发 酵液中提取和纯化抗生素，用于 治疗各种感染性疾病。
疫苗制备
利用生物分离技术，从病毒或细 胞培养物中提取和纯化疫苗，用 于预防传染病。
血液分离
通过生物分离技术，将血液中的 不同成分分离出来，用于输血、 制备血液制品和开展医学研究。
预处理和固液分离生物分离工程
目录
• 预处理技术 • 固液分离技术 • 生物分离工程 • 生物分离工程的应用 • 生物分离工程的挑战与展望
01
预处理技术
混合物预处理
第二章_原料的预处理
18 l
由于菌体细胞的直径很小，沉降速度很慢，因此常需向菌 体的料液中加入絮凝剂，使菌体细胞凝聚成较大颗粒后过滤除 去。
1.4 离心沉降（适用于分离较小的颗粒）
广泛应用于固液、液液相的分离。 1.离心沉降速度
d 2 s 2 R Vs 18
令：
S=
2 dp ( s L )
（3）凝聚和絮凝： 将化学药剂预先投加到悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋 白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使它们聚集成 可分离的絮凝体，在进行分离。 特点：使颗粒尺寸增加，增大颗粒的沉降或浮选速率，提高 滤饼的渗透性或在深床过滤时产生较好的颗粒保留作 用。 凝聚：在投加的化学物质（如铝、铁的盐类或石灰等）作用 下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成1mm大小块状凝聚 体的过程。 絮凝：使用絮凝剂（天然或合成的大分子量聚电解质）将胶
平衡区带离心（等密度离心法）: 在离心前预先配制介质的密度梯度，此种密度梯度液包 含了被分离样品中所有粒子的密度，待分离的样品铺在梯度 液顶上或和梯度液先混合，离心开始后，当梯度液由于离心 力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时原来 分布均匀的粒子也发生重新分布。当管底介质的密度大于粒 子的密度，即ρL＞ρs时粒子上浮；在弯顶处ρs＞ρL时，则粒子 沉降，最后粒子进入到一个它本身的密度位置即ρs＝ρL，此 时粒子不再移动，粒子形成纯组分的区带，区带与样品粒子 的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关，因此只要转 速、温度不变，则延长离心时间也不能改变这些粒子的成带 位置。 此法一般应用于物质的大小相近，而密度差异较大时。 常用的梯度液是CsCl。
18 L
S为Байду номын сангаас降系数
从该式中可看出：
①当ρs＞ρL，则S＞0，粒子顺着离心方向沉降。 ②当ρs＝ρL，则S＝0，粒子到达某一位置后达到平衡。 ③当ρs＜ρL，则S＜0，粒子逆着离心方向上浮。 离心沉降时，颗粒的相对分子质量越大，沉降系数越大，离心沉降速 度越大。
2 发酵液的预处理细胞破碎与固液分离
过滤助剂
过滤助剂可解决两个问题
–滤饼的可压缩性问题 –小粒子如菌丝碎片和细菌细胞，会渗入到 转鼓真空过滤预覆盖层内部。使得预覆盖层 的部分孔被堵塞，影响了渗透性。加入助滤 剂可以解决这一问题
常用的过滤助剂 硅藻土、珍珠岩、活性白土
助滤剂的加入有两种方法
在滤布上预先铺一层助滤剂(1~2mm)， 该方法，会使滤速降低，但滤液透明 度增加。
特点
对于不同菌种的发酵液、超声波处理的效果不 同，杆菌比球菌易破碎、革兰氏阴性菌细胞比革兰 氏阳性菌细胞容易破碎，对酵母菌的效果级差。该 法不适于大规模操作，因为放大后，要输入很高的 能量来提供必要的冷却，这是困难的。
超 声 波 破 碎 仪
2.2.3.2 化学和生物化学渗透
酸碱处理 可以使蛋白质水解，细胞溶解或使某些组 分从细胞内渗漏出来。
区带离心（Zonal centrifugation）
密度梯度制作： • 先调配不同浓度（密度）的蔗糖溶液，然后在离 心管中以浓度从大到小层层加入即可。 • 将一定浓度的蔗糖溶液经一定时间的高速离心后 可制成连续的蔗糖密度梯度。 • CsCl 和NaBr在离心力的作用下可自动形成密度 梯度。
区带离心：差速区带离心和平衡区带离心。
袋 式 过 滤 机
2.1.2.2 离心
优点：分离速度快，分离效率高、液 相澄清度好，操作时卫生条件好； × 缺点：设备投资高、能耗大。
表2.3 离心机的种类和适用范围
项目 离心力
细胞 细胞核 细胞器
低速离心机 2000-7000g
高速离心机 8000800000g
超离心机 100000600000g
2.1.1.2 改善培养液的性能
主要通过降低发酵液的黏度、调节适宜的pH 值和温度、絮凝与凝聚等操作来实现
第二章 生物材料的预处理和细胞破碎及固液分离
但是这些正离子还受到使它们均匀分布开去的 热运动的影响，具有离开胶粒表面的趋势，在 这两种相反作用的影响下，双电层就分裂成两 部分，在相距胶核表面约一个离子半径的stern 平面以内，正离子被紧密束缚在胶核表面，称 为吸附层或stern层；在stern平面以外，剩余 的正离子则在溶液中扩散开去，距离越远，浓 度越小，最后达到主体溶液的平均浓度，称为 扩散层。这样就形成了扩散双电层的结构模型。
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29
高压匀浆法
影响细胞破碎的主要因素：压力、循环次数、温 度。
操作压力：50～70MPa，一般为55MPa 一次破碎率：12%～67%，达到90%要多次 提高操作压力，有利于破碎，减少循环次数 温度由5℃提高到30℃，酵母破碎率提高1.5倍 适用于酵母和大多数细菌的破碎。 不适用于高度分枝的微生物，因为会堵塞阀。
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6
第二节 生物材料的预处理
预处理的目的
（1）改变发酵液的物理性质，以利于固液分离。
主要方法：加热、凝聚和絮凝。
（2）去除发酵液中部分杂质（可溶性胶状物质 和无机盐等），以利于后续各步操作。
可溶性胶状物质：杂蛋白、核酸、不溶性多糖等，可 使溶液黏度增加，影响固液分离速度及后续操作（如 堵塞层析柱头）。
细菌细胞壁主要成分是肽聚糖 革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖层组
成（20～80nm)，较难破碎。 革兰氏阴性菌的细胞壁的肽聚糖层较薄
（2～3nm)，还有两层外壁层。
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23
肽聚糖（peptidoglycan）
肽聚糖是难溶性的聚糖链 （glycan chain），借助 短肽交联而成的网状结构， 包围在细胞周围，使细胞 具有一定的形状和强度。
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主要方法：加热、凝聚和பைடு நூலகம்凝。
（2）去除发酵液中部分杂质（可溶性胶状物质和无机盐等），以利于后 续各步操作。
可溶性胶状物质：杂蛋白、核酸、不溶性多糖等，可使 溶液黏度增加，影响固液分离速度及后续操作（如堵 塞层析柱头）。
一、菌丝体和蛋白质的处理
（一）等电点沉淀
等电点时蛋白质溶解度最小（调pH）
（二）变性沉淀
变性蛋白质的溶解度较小，而产生沉淀
加热：使蛋白质变性、凝聚，同时降低液体黏度，加快 过滤速度
链霉素生产中，采用调pH至酸性（pH3.0），加热至 70℃，维持半个小时的方法来去除蛋白质，能使过滤速 度增大10-100倍，滤液粘度可降低1/6。
柠檬酸发酵液，采用加热至80℃以上，使蛋白质变性凝
（三）加各种沉淀剂沉淀
三、提取工艺对滤液质量的要求
不同工艺路线对滤液要求不同 离子交换法：无机离子、灰分要求低 溶剂萃取法：要求蛋白质含量较低，减轻乳化 直接沉淀法：对滤液质量要求高，需反复过滤，
结晶前还要脱色处理。如四环类抗生素。
第二节 生物材料的预处理
预处理的目的
（1）改变发酵液的物理性质，以利于固液分离。
第二章 生物材料的预处理 和细胞破碎及固液分离
概述
微生物或动植物细胞在合适的培养基，ＰＨ值， 温度和通气搅拌（或厌气）等发酵条件下进行生长 和合成生物活性物质，因为在其培养（发酵）液中 包含了菌（细胞）体，胞内外代谢产物，胞内的细 胞物质及剩余的培养基残分等。
不管人们所需要的产物是胞内的还是胞外的或 是菌体本身，都首先要进行培养液的预处理和菌体 回收，只有将固，液分离开，才能从澄清的滤液中 采用物理、化学的方法提取代谢产物，或从细胞出 发进行破碎、碎片分离和提取胞内产物。
某些化学试剂能与蛋白质结合形成复合物沉淀，如三氯乙酸、水 杨酸、苦味酸等
（四）加入凝聚剂（小分子）
可使细胞、细胞碎片及蛋白质等胶体颗粒去除。 凝聚：在某些电解质作用下，使胶体粒子的扩散双电层
的排斥电位降低，破坏了胶体系统的分散状态，而使 胶体粒子聚集的过程。
胶体稳定的因素：电荷、水化层 电解质能中和电荷、破坏水化层 与蛋白质盐析的机理相同。
发酵（培养）结束后，首先将菌体或细胞、固态培养基等固态悬 浮颗粒与可溶性组分分离，即固液分离。
如固态悬浮颗粒较粗大，可直接进行。 如固态悬浮颗粒较细小，应先进行预处理。 如产物在胞内，还应先进行细胞破碎。
第一节 确定预处理方法的基本条件
一、了解生物活性物质存在的部位
胞外：细胞产生后，分泌到培养液中 胞内：游离在胞浆中、结合在质膜上等
（3）PH值：影响电离度，从而影响链的伸展形态。
（4）搅拌速度和时间 ：适当搅拌，可使絮凝剂迅速分散，但过快会 打碎絮凝团。
常用的絮凝剂
聚丙烯酰胺（po1yacry1amide）类和聚乙烯亚胺 （polyethyleneimine）衍生物，根据活性基团在水中解离情况不 同，可分为非离子型、阴离子型（含有羧基）和阳离子型（含有胺 基）三类。由于聚丙烯酰胺类絮凝剂具有用量少，一般以ppm计量， 絮凝体粗大，分离效果好，絮凝速度快以及种类多等优点，所以适 用范围广。
发酵液的带电现象
发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子的 表面，一般都带有电荷，带电的原因很多，主 要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。通 常发酵液中细胞或菌体带有负电荷，由于静电 引力的作用使溶液中带相反电荷的粒于（即正 离子）被吸附在其周围，在界面上形成了双电 层。
但是这些正离子还受到使它们均匀分布开去的 热运动的影响，具有离开胶粒表面的趋势，在 这两种相反作用的影响下，双电层就分裂成两 部分，在相距胶核表面约一个离子半径的stern 平面以内，正离子被紧密束缚在胶核表面，称 为吸附层或stern层；在stern平面以外，剩余 的正离子则在溶液中扩散开去，距离越远，浓 度越小，最后达到主体溶液的平均浓度，称为 扩散层。这样就形成了扩散双电层的结构模型。
（五）加入絮凝剂（高分子）
絮凝剂：天然或人工合成的有机高分子化合物，具长链 线状结构，易溶于水，有大量的活性基团。
吸附胶粒，产生架桥连接，形成粗大的絮凝团，有助于 过滤。
可与凝聚剂配合使用，提高絮凝效果。
影响因素：（1）分子量：链越长，吸附架桥效果越好，但自身在水 中溶解度也降低。
（2）用量：增加用量，有助于架桥，但过多会引起吸附饱和，降低 絮凝效果。
二、稳定性
分离提取时，生物活性物质处于不断变化之中，可被细胞本身的 酶所破坏，或为微生物所分解，还可能在制备时受到pH值、酸、 碱、温度、金属离子、盐、机械搅拌等的作用。
如青霉素稳定性较差，发酵液酸化pH需控制在 4.8～5.2，并且低温。
多粘菌素E稳定性较好，可在pH2.0、95℃处理，可 提高过滤速度。
（七）酶解法去除不溶性多糖
不溶性多糖会增大溶液黏度，使固液分离困难，可加入淀粉酶进行水 解，将发酵液中多余淀粉水解。
二、高价金属离子的去除
对提取和成品质量影响较大。 （一）离子交换法
通过阳离子树脂
如四环素发酵液通过122型树脂，除去Fe3+ ，同时也吸附色素， 提高滤液质量。
聚丙烯酸类阴离子絮凝剂和聚苯乙烯类衍生物。 无机高分子聚合物也是较好的一类絮凝剂，如聚合铝盐和聚合铁盐
等。 天然有机高分子絮凝剂，如壳聚糖和葡聚糖等聚糖类，还有明胶、
骨胶、海藻酸钠等。 微生物絮凝剂是近年来研究和开发的新型絮凝剂，它是一类由微生
物产生的具有絮凝细胞功能的物质。主要成分是糖蛋白、粘多糖、 纤维素及核酸等高分子物质。微生物絮凝剂和天然絮凝剂与化学合 成的絮凝剂相比，最大的优点是安全，无毒和不污染环境。
凝聚和絮凝：均是破坏发酵液中胶体的稳定性， 增大颗粒尺寸，增大颗粒的沉降或浮选速率。
（六）吸附
加入反应剂，相互反应生成沉淀，能吸附蛋白质和 菌体等胶粒，同时起助滤剂作用。
如四环素发酵液中加入黄血盐和硫酸锌，生成亚铁氰化锌钾 K2Zn3[Fe(CN)5]2的胶状沉淀，能将杂蛋白和菌体黏附而除 去。
在枯草杆菌发酵液中，常加入氯化钙和磷酸氢二钠，这两者本 身生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其它不溶性粒子吸
（2）去除发酵液中部分杂质（可溶性胶状物质和无机盐等），以利于后 续各步操作。
可溶性胶状物质：杂蛋白、核酸、不溶性多糖等，可使 溶液黏度增加，影响固液分离速度及后续操作（如堵 塞层析柱头）。
一、菌丝体和蛋白质的处理
（一）等电点沉淀
等电点时蛋白质溶解度最小（调pH）
（二）变性沉淀
变性蛋白质的溶解度较小，而产生沉淀
加热：使蛋白质变性、凝聚，同时降低液体黏度，加快 过滤速度
链霉素生产中，采用调pH至酸性（pH3.0），加热至 70℃，维持半个小时的方法来去除蛋白质，能使过滤速 度增大10-100倍，滤液粘度可降低1/6。
柠檬酸发酵液，采用加热至80℃以上，使蛋白质变性凝
（三）加各种沉淀剂沉淀
三、提取工艺对滤液质量的要求
不同工艺路线对滤液要求不同 离子交换法：无机离子、灰分要求低 溶剂萃取法：要求蛋白质含量较低，减轻乳化 直接沉淀法：对滤液质量要求高，需反复过滤，
结晶前还要脱色处理。如四环类抗生素。
第二节 生物材料的预处理
预处理的目的
（1）改变发酵液的物理性质，以利于固液分离。
第二章 生物材料的预处理 和细胞破碎及固液分离
概述
微生物或动植物细胞在合适的培养基，ＰＨ值， 温度和通气搅拌（或厌气）等发酵条件下进行生长 和合成生物活性物质，因为在其培养（发酵）液中 包含了菌（细胞）体，胞内外代谢产物，胞内的细 胞物质及剩余的培养基残分等。
不管人们所需要的产物是胞内的还是胞外的或 是菌体本身，都首先要进行培养液的预处理和菌体 回收，只有将固，液分离开，才能从澄清的滤液中 采用物理、化学的方法提取代谢产物，或从细胞出 发进行破碎、碎片分离和提取胞内产物。
某些化学试剂能与蛋白质结合形成复合物沉淀，如三氯乙酸、水 杨酸、苦味酸等
（四）加入凝聚剂（小分子）
可使细胞、细胞碎片及蛋白质等胶体颗粒去除。 凝聚：在某些电解质作用下，使胶体粒子的扩散双电层
的排斥电位降低，破坏了胶体系统的分散状态，而使 胶体粒子聚集的过程。
胶体稳定的因素：电荷、水化层 电解质能中和电荷、破坏水化层 与蛋白质盐析的机理相同。
发酵（培养）结束后，首先将菌体或细胞、固态培养基等固态悬 浮颗粒与可溶性组分分离，即固液分离。
如固态悬浮颗粒较粗大，可直接进行。 如固态悬浮颗粒较细小，应先进行预处理。 如产物在胞内，还应先进行细胞破碎。
第一节 确定预处理方法的基本条件
一、了解生物活性物质存在的部位
胞外：细胞产生后，分泌到培养液中 胞内：游离在胞浆中、结合在质膜上等
（3）PH值：影响电离度，从而影响链的伸展形态。
（4）搅拌速度和时间 ：适当搅拌，可使絮凝剂迅速分散，但过快会 打碎絮凝团。
常用的絮凝剂
聚丙烯酰胺（po1yacry1amide）类和聚乙烯亚胺 （polyethyleneimine）衍生物，根据活性基团在水中解离情况不 同，可分为非离子型、阴离子型（含有羧基）和阳离子型（含有胺 基）三类。由于聚丙烯酰胺类絮凝剂具有用量少，一般以ppm计量， 絮凝体粗大，分离效果好，絮凝速度快以及种类多等优点，所以适 用范围广。
发酵液的带电现象
发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子的 表面，一般都带有电荷，带电的原因很多，主 要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。通 常发酵液中细胞或菌体带有负电荷，由于静电 引力的作用使溶液中带相反电荷的粒于（即正 离子）被吸附在其周围，在界面上形成了双电 层。
但是这些正离子还受到使它们均匀分布开去的 热运动的影响，具有离开胶粒表面的趋势，在 这两种相反作用的影响下，双电层就分裂成两 部分，在相距胶核表面约一个离子半径的stern 平面以内，正离子被紧密束缚在胶核表面，称 为吸附层或stern层；在stern平面以外，剩余 的正离子则在溶液中扩散开去，距离越远，浓 度越小，最后达到主体溶液的平均浓度，称为 扩散层。这样就形成了扩散双电层的结构模型。
（五）加入絮凝剂（高分子）
絮凝剂：天然或人工合成的有机高分子化合物，具长链 线状结构，易溶于水，有大量的活性基团。
吸附胶粒，产生架桥连接，形成粗大的絮凝团，有助于 过滤。
可与凝聚剂配合使用，提高絮凝效果。
影响因素：（1）分子量：链越长，吸附架桥效果越好，但自身在水 中溶解度也降低。
（2）用量：增加用量，有助于架桥，但过多会引起吸附饱和，降低 絮凝效果。
二、稳定性
分离提取时，生物活性物质处于不断变化之中，可被细胞本身的 酶所破坏，或为微生物所分解，还可能在制备时受到pH值、酸、 碱、温度、金属离子、盐、机械搅拌等的作用。
如青霉素稳定性较差，发酵液酸化pH需控制在 4.8～5.2，并且低温。
多粘菌素E稳定性较好，可在pH2.0、95℃处理，可 提高过滤速度。
（七）酶解法去除不溶性多糖
不溶性多糖会增大溶液黏度，使固液分离困难，可加入淀粉酶进行水 解，将发酵液中多余淀粉水解。
二、高价金属离子的去除
对提取和成品质量影响较大。 （一）离子交换法
通过阳离子树脂
如四环素发酵液通过122型树脂，除去Fe3+ ，同时也吸附色素， 提高滤液质量。
聚丙烯酸类阴离子絮凝剂和聚苯乙烯类衍生物。 无机高分子聚合物也是较好的一类絮凝剂，如聚合铝盐和聚合铁盐
等。 天然有机高分子絮凝剂，如壳聚糖和葡聚糖等聚糖类，还有明胶、
骨胶、海藻酸钠等。 微生物絮凝剂是近年来研究和开发的新型絮凝剂，它是一类由微生
物产生的具有絮凝细胞功能的物质。主要成分是糖蛋白、粘多糖、 纤维素及核酸等高分子物质。微生物絮凝剂和天然絮凝剂与化学合 成的絮凝剂相比，最大的优点是安全，无毒和不污染环境。
凝聚和絮凝：均是破坏发酵液中胶体的稳定性， 增大颗粒尺寸，增大颗粒的沉降或浮选速率。
（六）吸附
加入反应剂，相互反应生成沉淀，能吸附蛋白质和 菌体等胶粒，同时起助滤剂作用。
如四环素发酵液中加入黄血盐和硫酸锌，生成亚铁氰化锌钾 K2Zn3[Fe(CN)5]2的胶状沉淀，能将杂蛋白和菌体黏附而除 去。
在枯草杆菌发酵液中，常加入氯化钙和磷酸氢二钠，这两者本 身生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其它不溶性粒子吸