第二章 生物材料的预处理和细胞破碎及固液分离

（七）酶解法去除不溶性多糖
不溶性多糖会增大溶液黏度，使固液分离困难，可加入淀粉酶进行水 解，将发酵液中多余淀粉水解。
二、高价金属离子的去除
对提取和成品质量影响较大。 （一）离子交换法
通过阳离子树脂
如四环素发酵液通过122型树脂，除去Fe3+ ，同时也吸附色素， 提高滤液质量。
聚丙烯酸类阴离子絮凝剂和聚苯乙烯类衍生物。 无机高分子聚合物也是较好的一类絮凝剂，如聚合铝盐和聚合铁盐
等。 天然有机高分子絮凝剂，如壳聚糖和葡聚糖等聚糖类，还有明胶、
骨胶、海藻酸钠等。 微生物絮凝剂是近年来研究和开发的新型絮凝剂，它是一类由微生
物产生的具有絮凝细胞功能的物质。主要成分是糖蛋白、粘多糖、 纤维素及核酸等高分子物质。微生物絮凝剂和天然絮凝剂与化学合 成的絮凝剂相比，最大的优点是安全，无毒和不污染环境。
某些化学试剂能与蛋白质结合形成复合物沉淀，如三氯乙酸、水 杨酸、苦味酸等
（四）加入凝聚剂（小分子）
可使细胞、细胞碎片及蛋白质等胶体颗粒去除。 凝聚：在某些电解质作用下，使胶体粒子的扩散双电层
的排斥电位降低，破坏了胶体系统的分散状态，而使 胶体粒子聚集的过程。
胶体稳定的因素：电荷、水化层 电解质能中和电荷、破坏水化层 与蛋白质盐析的机理相同。
第二章 生物材料的预处理 和细胞破碎及固液分离
概述
微生物或动植物细胞在合适的培养基，ＰＨ值， 温度和通气搅拌（或厌气）等发酵条件下进行生长 和合成生物活性物质，因为在其培养（发酵）液中 包含了菌（细胞）体，胞内外代谢产物，胞内的细 胞物质及剩余的培养基残分等。
不管人们所需要的产物是胞内的还是胞外的或 是菌体本身，都首先要进行培养液的预处理和菌体 回收，只有将固，液分离开，才能从澄清的滤液中 采用物理、化学的方法提取代谢产物，或从细胞出 发进行破碎、碎片分离和提取胞内产物。
三、提取工艺对滤液质量的要求
不同工艺路线对滤液要求不同 离子交换法：无机离子、灰分要求低 溶剂萃取法：要求蛋白质含量较低，减轻乳化 直接沉淀法：对滤液质量要求高，需反复过滤，
结晶前还要脱色处理。如四环类抗生素。
第二节 生物材料的预处理
预处理的目的
（1）改变发酵液的物理性质，以利于固液分离。
（五）加入絮凝剂（高分子）
絮凝剂：天然或人工合成的有机高分子化合物，具长链 线状结构，易溶于水，有大量的活性基团。
吸附胶粒，产生架桥连接，形成粗大的絮凝团，有助于 过滤。
可与凝聚剂配合使用，提高絮凝效果。
影响因素：（1）分子量：链越长，吸附架桥效果越好，但自身在水 中溶解度也降低。
（2）用量：增加用量，有助于架桥，但过多会引起吸附饱和，降低 絮凝效果。
二、稳定性
分离提取时，生物活性物质处于不断变化之中，可被细胞本身的 酶所破坏，或为微生物所分解，还可能在制备时受到pH值、酸、 碱、温度、金属离子、盐、机械搅拌等的作用。
如青霉素稳定性较差，发酵液酸化pH需控制在 4.8～5.2，并且低温。
多粘菌素E稳定性较好，可在pH2.0、95℃处理，可 提高过滤速度。
主要方法：加热、凝聚和絮凝。
（2）去除发酵液中部分杂质（可溶性胶状物质和无机盐等），以利于后 续各步操作。
可溶性胶状物质：杂蛋白、核酸、不溶性多糖等，可使 溶液黏度增加，影响固液分离速度及后续操作（如堵 塞层析柱头）。
一、菌丝体和蛋白质的处理
（一）等电点沉淀
等电点时蛋白质溶解度最小（调pH）
（二）变性沉淀
变性蛋白质的溶解度较小，而产生沉淀
加热：使蛋白质变性、凝聚，同时降低液体黏度，加快 过滤速度
链霉素生产中，采用调pH至酸性（pH3.0），加热至 70℃，维持半个小时的方法来去除蛋白质，能使过滤速 度增大10-100倍，滤液粘度可降低1/6。
柠檬酸发酵液，采用加热至80℃以上，使蛋白质变性凝
（三）加各种沉淀剂沉淀
发酵液的带电现象
发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子的 表面，一般都带有电荷，带电的原因很多，主 要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。通 常发酵液中细胞或菌体带有负电荷，由于静电 引力的作用使溶液中带相反电荷的粒于（即正 离子）被吸附在其周围，在界面上形成了双电 层。
但是这些正离子还受到使它们均匀分布开去的 热运动的影响，具有离开胶粒表面的趋势，在 这两种相反作用的影响下，双电层就分裂成两 部分，在相距胶核表面约一个离子半径的stern 平面以内，正离子被紧密束缚在胶核表面，称 为吸附层或stern层；在stern平面以外，剩余 的正离子则在溶液中扩散开去，距离越远，浓 度越小，最后达到主体溶液的平均浓度，称为 扩散层。这样就形成了扩散双电层的结构模型。
（3）PH值：影响电离度，从而影响链的伸展形态。
（4）搅拌速度和时间 ：适当搅拌，可使絮凝剂迅速分散，但过快会 打碎絮凝团。
常用的絮凝剂
聚丙烯酰胺（po1yacry1amide）类和聚乙烯亚胺 （polyethyleneimine）衍生物，根据活性基团在水中解离情况不 同，可分为非离子型、阴离子型（含有羧基）和阳离子型（含有胺 基）三类。由于聚丙烯酰胺类絮凝剂具有用量少，一般以ppm计量， 絮凝体粗大，分离效果好，絮凝速度快以及种类多等优点，所以适 用范围广。
凝聚和絮凝：均是破坏发酵液中胶体的稳定性， 增大颗粒尺寸，增大颗粒的沉降或浮选速率。
（ห้องสมุดไป่ตู้）吸附
加入反应剂，相互反应生成沉淀，能吸附蛋白质和 菌体等胶粒，同时起助滤剂作用。
如四环素发酵液中加入黄血盐和硫酸锌，生成亚铁氰化锌钾 K2Zn3[Fe(CN)5]2的胶状沉淀，能将杂蛋白和菌体黏附而除 去。
在枯草杆菌发酵液中，常加入氯化钙和磷酸氢二钠，这两者本 身生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其它不溶性粒子吸
发酵（培养）结束后，首先将菌体或细胞、固态培养基等固态悬 浮颗粒与可溶性组分分离，即固液分离。
如固态悬浮颗粒较粗大，可直接进行。 如固态悬浮颗粒较细小，应先进行预处理。 如产物在胞内，还应先进行细胞破碎。
第一节 确定预处理方法的基本条件
一、了解生物活性物质存在的部位
胞外：细胞产生后，分泌到培养液中 胞内：游离在胞浆中、结合在质膜上等