固定化动物细胞大规模培养技术研究进展
动物细胞大规模培养技术研究进展
动物细胞大规模培养技术研究进展【摘要】当前动物细胞大规模培养技术已经成为生物技术领域的研究重点，同时被广泛应用于生物医药的研发、生产。
本文介绍了动物细胞大规模培养过程中的技术及研究进展。
【关键词】动物细胞；大规模培养技术；研究进展前言动物细胞培养出现在二十世纪初，并于1962年开始扩大，当前被广泛应用于生物、医学研究等。
依托动物细胞培养进行医用价值高的酶、疫苗、单抗、生长因子等的生产，已逐步发展为医药生物高新技术产业的一部分[1]。
当前依托动物细胞培养技术所制造生物制品在世界生物高技术产品市场份额中几乎占有一半的比例。
相关资料显示，生物技术药物属于新药开发的重要领域，在未来的制药工业中生物技术制药将成为重要新门类，上市的生物技术新药将高达数百种。
动物细胞大规模培养技术属于生物技术制药的重要环节，其水平当前集中于培养规模的扩大、细胞特征的改变等方面。
一、细胞生物反应器生物制品的生产离不开动物细胞的培养，其中生物反应器是进行动物细胞培养的重要设备。
因为动物细胞在生产红细胞生成素、尿激酶原、疫苗、干扰素等价值昂贵的生物制品时优势显著，所以关于动物细胞生物反应器的研制迅速。
（一）机械搅拌式这一类型的生物反应器开发相对早、应用也比较广泛，包括培养罐、阀、马达、管、泵、仪表。
在马达带动不锈钢搅拌系统可以对培养物进行混匀，罐顶的传感器连接监测培养物的pH值溶氧度、NH3、NH4+、温度、葡萄糖消耗等，规模为2000L，在微载体、灌注技术及多孔微球技术的配合下，其细胞密度将超过107/mL，消毒十分便利[2]。
培养的动物细胞类型多样、培养工艺易于放大、适宜于工厂化生产是其优势所在，但机械搅拌造成的剪刀力却会对细胞造成损害。
（二）气升式通过这一类型的生物反应器，气体混合物可以经底部喷射管到中央导管，这样中央导管的液体密度将比外部区域低，这就促成了循环。
其结构趋同于搅拌式，但是进行搅拌的不锈钢叶片换成了气流管，所以其形成的剪刀力较为温和，对细胞的损害相对较小。
固定化
固定化技术及其应用摘要固定化细胞技术是酶工程的核心技术之一，它将酶工程提高到一个新水平。
该技术简化了工业分离纯化的步骤，并使酶反应的连续生产成为现实。
目前，该技术已经广泛应用于食品、发酵、三废处理等行业，经济效益显著。
首先分析了固定化细胞的优缺点，介绍了近年来在食品、发酵和三废处理行业的应用，最后对其应用进行了展望。
关键词固定化酶；食品；发酵；三废处理；应用引言固定化细胞就是被限制自由移动的细胞，既细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并具备能被反复或连续使用的活力。
是在酶固定化基础上发展起来的一项技术。
【1】固定化微生物技术使用化学或物理手段，将游离细胞或者酶定位于限定的区域，使其保持活性并可反复利用的方法。
最初主要用于发酵生产，70年代后期，被利用到水处理领域，近年来则成为各国学者研究的热点【2】。
固定化微生物技术克服了生物细胞太小，与水溶液分离较难，易造成二次污染的缺点，保持了效率高、稳定性强、能纯化和保持高效菌种的优点，在废水处理领域有广阔的应用前景。
在实际应用过程中，如何固定、何种载体，才能使固定化微生物能较长时间的保持一定的强度和活度，才能降低固定化成本，延长固定微生物的使用寿命，是该技术在污水处理中得到广泛应用的关键。
固定化技术作为实现动物细胞大规模培养的重要途径, 相对悬浮培养而言具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强、产物易于收集和分离纯、对贴壁型和非贴壁型细胞【3】都适用的优点, 因此在动物细胞的大规模培养上得到越来越广泛的应用,相继出现了微载体、中空纤维及微囊化等多种固定化培养技术。
本文作者将结合动物细胞的培养特性,介绍目前动物细胞大规模培养中的固定化技术。
酶作为一种蛋白质，其催化活性与空间结构密切相关，在大多数情况下固相酶的催化活性较低，以固定化氨基酰化酶为例，选择比较好的载体材料和固定化方法，其活性一般也仅为游离酶的50％～60％。
大规模动物细胞培养问题及对策
5结论与展望
可以推断，更多的代谢中间产物对细胞培养的细微影响和机理将逐渐得以充分认识。对这些因素加以调节可以简化筛选特定克隆的方法。细胞培养营养需要的重点将继续朝着维持或增加产品质量及一致性上努力。基因改建在筛选、扩增目的基因及控制其表达或增强细胞寿命等方面显示出强大生命力。改善细胞环境是当前众多生物反应器及控制器研究者的不懈努力方向。随着对细胞生长和产物生成之间相关性研究的深入，对生物反应器更多培养状态参数的在线检测以及各种新细胞生物反应器系统的开发利用，新的培养/控制模式将会在现有基础上不断产生。不断成熟的大规模动物细胞培养技术不仅在生产药用蛋白方面，而且在基因治疗、基因疫苗用的病毒载体的生产、人工器官和组织移植用分化细胞的培养等研究领域都具有广阔的应用前景。
大规模动物细胞培养的问题及对策
大规模动物细胞培养的问题及对策
动物细胞培养开始于本世纪初，到1962年规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。由于动物细胞体外培养的生物学特性、相关产品结构的复杂性和质量以及一致性要求，动物细胞大规模培养技术仍难于满足具有重要医用价值生物制品的规模生产的需求，迫切需要进一步研究和发展细胞培养工艺。目前，世界众多研究领域集中在优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率并保证其质量和一致性上。
动物细胞的灌注养方法
动物细胞培养同传统的微生物细胞培养相比,动物细胞培养存在着细胞倍增时间长、代谢途径复杂、对营养的要求高、对外界环境如温度、pH、溶氧、渗透压、剪切力的敏感性强、细胞状态容易改变等问题,大大增加了动物细胞培养的难度。如何完善细胞培养技术,提高动物细胞大规模培养的产率,一直是国内外研究的热点之一。
动物细胞大规模培养技术
•动物细胞大规模培养技术
(三) 培养基与细胞系
• 动物细胞培养基是细胞赖以生长、增殖的重 要因素。天然培养基、合成培养基后，无血清 培养基开发成为当今细胞领域的一大课题。
• 无血清培养基的优势在于避免血清的批次、质 量、成分等对细胞造成的污染、毒性和不利于 产品纯化等不良影响。
•
•动物细胞大规模培养技术
1悬浮培养技术
基本操作 (1)将动物培养材料分散成细胞悬浮液\ 过滤、离心、纯化、漂洗后接种到有适 宜培养液的培养系统中。传代时按比例 稀释即可继续培养。
•动物细胞大规模培养技术
•动物细胞大规模培养技术
• 对贴壁性•细2微胞载，最体初培采养用技在术培养液中加
人一定数量的小滚瓶，增加细胞生长的 贴壁面积。此方法构造简单，成本低， 重复性好，放大过程可依靠滚瓶数量的 增加。但产率低，劳动强度大，占空间 大。微载体系统培养贴壁细胞，一定程 度上改变了以上这些不足。微载体是直 径60—250um的微珠。
•动物细胞大规模培养技术
• 采用胶原酶消化比胰蛋白酶-EDTA法可获 得更完整的细胞膜和更高的细胞活性。 胶原酶专一性好，不损伤细胞膜，效果 较好。
•动物细胞大规模培养技术
(6)分离细胞：
• 对于回收率要求不高的细胞种类，分组 沉降简单易行。
• 脱离微载体的培养液放入细长容器，于上清液 中分离收集细胞，400r／min，2min离心加速 微载体沉淀。
• 1.病毒疫苗 • 2.非抗体免疫调节剂 • 3.多肽生长因子 • 4.酶类 • 5.激素 • 6.肿瘤特异性抗原 • 7.单克隆抗体 • 8.病毒杀虫剂
•动物细胞大规模培养技术
大规模培养细胞技术
[9]张立,严春,范卫民,等.Vero细胞的微载体培养——放大过程中的接种工艺[J].华东理工大学学报,1998,24:659~663
[10]Zhang L,Zhang Y,Yan C,et al.The culture of chicken embryo fibroblast cells on microcarriers to produce infectious bursal disease virus[J].App Biochem Biotechnol,1997,62:291~30
2.1.3
巨载体培养，是相对微载体和细胞而言的。在这种培养方式中，细胞虽然也像微载体一样贴附于固定的表面生长，但巨载体在生物反应器中是固定的，不因为搅拌而跟随培养液一起运动。
2.2悬浮培养
细胞悬浮培养是指在反应器中自有悬浮生长的过程。悬浮培养系统主要用于非贴壁依赖性细胞的培养。杂交瘤细胞的悬浮培养是研究得最广泛和透彻的动物细胞培养过程，培养规模最大，操作最成熟。近年来，随着无血清培养技术的发展，越来越多的贴壁依赖性细胞被驯化适合于无血清悬浮培养，例如重组CHO细胞和BHK细胞的大规模悬浮培养都获得了成功[11]。
大规模
摘要：细胞培养工作始于20世纪初，现已广泛应用于生物学、医学各个领域，成为细胞与组织研究的重要技术之一。近年来，随着基因工程和细胞工程技术的不断发展，动物细胞培养已成为大规模生产一系列有商品价值的生物制品的重要宿主，当前人们已经能够生产多种单克隆抗体、激素、细胞因子、病毒疫苗和具有特殊功能的效应细胞等。但是，实验室采用的细胞培养技术获得的细胞量有限，不能满足生产的需求，必修改用超产培养技术方法方可获得大量细胞，目前这种技术种类繁多，归纳起来有三大类：①贴壁培养法；②悬浮培养法；③固定化培养法。细胞体外培养技术的不断发展和完善，为组织和器官培养以及现代生物技术前沿的转基因动物技术、克隆技术、干细胞定向分化、体外受精、性别控制等一系列技术的发展奠定了基础。
动物细胞大规模培养技术
大规模培育技术应用简介通过大规模体外培育技术培育哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。
20 世界 60-70年月，就已创立了可用于大规模培育动物细胞的微载体培育系统和中空纤维细胞培育技术。
近十数年来，由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增，以传统的生物化学技术从动物组织猎取生物制品已远远不能满足这一需求。
随着细胞培育的原理与方法日臻完善，动物细胞大规模培育技术趋于成熟。
所谓动物细胞大规模培育技术〔large-scale culture technology〕是指在人工条件下〔设定ph、温度、溶氧等〕，在细胞生物反响器〔bioreactor〕中高密度大量培育动物细胞用于生产生物制品的技术。
目前可大规模培育的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho〔中华仓鼠卵巢〕细胞、BHK-21(仓鼠肾细胞)、Vero 细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依靠的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。
在过去几十年来，该技术经有了很大进展，从使用转瓶(roller bottle) 、CellCube 等贴壁细胞培育，进展为生物反响器〔Bioreactor〕进展大规模细胞培育。
第一代细胞培育技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产：一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是非批量生产简洁导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进展生产和质量控制。
随着生物技术的进展，迫切需要大规模的细胞培育，特别是培育表达特异性蛋白的哺乳动物细胞，以便获得大量有用的细胞表达产物。
承受玻璃瓶静置或旋转瓶的培育方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。
因而必需为工业化生产开创一种的技术方法。
自 70 年月以来，细胞培育用生物反响器有很大的进展，种类越来越多，规模越来越大，较常见的细胞培育生物反响器有空气提升反响器，中空纤维管反响器，无泡搅拌反响器及篮式生物反响器等。
细胞固定化技术的研究进展
细胞固定化技术的研究进展
吴海亮 2008年1月
细胞的固定化是在固定化酶基础上发展起来
的一种高新技术和方法，是指利用化学或物理的 手段将微生物自然固定于限定的空间区域内，保 持其固有的催化活性，并能反复使用。固定化生 物细胞能持续增殖、休眠及衰亡，其活性始终保 持稳定。固定化的生物细胞除保持其原有的识别、 结合和催化活性外，还具有易于分离、可重复使 用及稳定性提高等显著的优点。
1.1 有载体固定化细胞
有载体固定化细胞是将动物、植物或微生物 细胞固定于合适的不溶性载体上，并应用于工业 化生产。
有载体细胞固定化技术不但可以提高生产效 率，延长细胞寿命，增加生产能力，而且在生产 后期易于进行细胞的分离和回收，因此在生产实 践中得到了广泛的应用。
夏黎明等人将1.2％的Al2 O3 添加在质量分数为2％ 的CaCl2 溶液中，形成机械强度较好、富有弹性、对糖 的利用率高和发酵眭能好的凝胶粒子，用以固定化休哈 塔假丝酵母(Candida shehatae)细胞，证实了采用固定 化增殖细胞发酵己糖和戊糖，固定化凝胶珠的稳定性强， 操作简便，发酵速度快，生产周期短，酒精得率高。
1959年，Hattori和Furusaka首次将大肠杆 菌F.col吸附在树脂上，实现了细胞固定化。 1973年，含有L一天冬氨酸酶的微生物被固定化， 并用于L一天冬氨酸的生产。20世纪70年代末， 动物、植物固定化细胞技术也得到了快速的发展。
1、细胞固定化方法
细胞固定化方法很多，杨文英等介绍了吸附 法等7种 制备固定化细胞的方法。成庆利等人同根据有无 外加载体，将细胞固定化分为有载体固定化和无 载体固定化。
1.2 无载体固定化细胞
20世纪80年代初，K．Ease等人率先提出利 用某些具有自身强絮凝能力的菌株形成颗粒，以 此作为一种固定化细胞的方法，即无载体固定化 细胞。无载体固定化细胞即微生物细胞絮凝，通 常指细胞在生长期间发生的无性凝集。
动物细胞培养技术的研究与应用
动物细胞培养技术的研究与应用随着生物技术的不断发展，动物细胞培养技术也被广泛地应用于医药、生物学等领域。
作为一种重要的实验技术，在医学、生物学以及其他相关领域发挥着不可替代的作用。
本文将就动物细胞培养技术的研究与应用展开讨论。
一、动物细胞培养技术的基本原理动物细胞培养是将动物组织或细胞分离培养在营养液中的技术，这种方法可以使细胞脱离组织，在适当的营养环境中无限增殖，而不再受控制的细胞生长环境的限制。
由于动物细胞具有复杂的生命现象，因此在培养过程中要求细胞处于良好的生长环境下，如温度、营养、气体和水分等。
动物细胞培养技术主要包括原代培养、细胞的传代培养、冻存和解冻等过程。
其中，原代培养是指从动物组织或器官中直接分离得到的细胞，传代培养则是将原代培养得到的细胞继续培养。
而冻存和解冻则是为了保持动物细胞在长期保存期间的活力。
动物细胞培养技术的应用主要涉及到细胞研究和医学领域。
在细胞研究领域，它可以用于细胞遗传学、细胞生物学、细胞分子生物学、细胞生长和分化等领域的研究。
在医学领域，动物细胞培养技术可以用于药物研发、病毒研究、组织工程和干细胞研究等方面。
二、动物细胞培养技术的研究与发展自从20世纪50年代，人类对动物细胞培养技术的研究就已经开始。
当时主要是针对小鼠和人类的细胞进行培养。
后来，随着技术的不断发展和改进，动物细胞培养技术逐渐成熟，并广泛地应用于不同领域。
随着时间的推移，越来越多的细胞系被创立出来，也就是人们所熟知的各种细胞株。
在动物细胞培养技术的研究中，细胞表面和细胞固定化技术也是研究热点之一。
关于细胞表面控制技术，主要是为了研究细胞与其外界环境之间的相互作用，如细胞-蛋白相互作用等。
而细胞固定化技术则是为了使细胞固定在各种载体上，以便细胞在制药和环境领域中的应用。
此外，动物细胞培养技术还与其他研究领域相结合，如基因工程、蛋白质工程等。
总而言之，动物细胞培养技术的研究和发展是联系紧密的，不同领域的融合能够推进动物细胞培养技术的不断发展。
动物细胞大规模培养方法分析
科技论坛动物细胞大规模培养方法分析吴旭国（哈尔滨三木制药厂，黑龙江五常150232）摘要：动物细胞大规模培养方法已经广泛应用于生产各种生物制品，也广泛应用于各种兽用疫苗的生产。
动物细胞大规模培养技术是生物技术制药中非常重要的环节。
目前,动物细胞有悬浮培养和贴壁培养，技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率与保证其质量。
针对贴壁培养、悬浮培养和固定化培养等三种培养方法进行概述。
关键词：动物细胞；细胞培养；方法分析1细胞生长的基质依赖性1.1细胞对基质的依赖性根据细胞的生长特性和对基质的依赖性，可分为贴壁依赖性细胞和非贴壁依赖性细胞。
贴壁依赖性细胞的生长需要适量带电荷的固体或半固体支持表面，细胞自身分泌或人为在培养基中加入贴附因子，使细胞依附在支持物表面、才能生长和增殖，大多数动物细胞都属于此类，包括非淋巴组织细胞和许多异倍体细胞。
接触抑制性是当细胞长满整个培养表面后，就不再生长了，但仍然能存活一段时间。
非贴壁依赖性细胞的生长不依赖于固体支持物表面，可在培养液中悬浮生长，所以也被称为悬浮细胞。
血液、淋巴细胞、肿瘤细胞(包括杂交瘤细胞)和某些转化细胞属于此类。
有些细胞对固体支持物的依赖性不严格，可以贴壁生长，但在一定条件下，也可以悬浮生长。
1.2生长基质贴附细胞生长需要一个支持介质，培养器皿表面的材质不适合，因此人们采用在培养液中添加或在器皿表面覆盖生长基质，帮助细胞的贴附和生长。
把改变生长表面特性，促进细胞贴附的物质称为生长基质。
生长基质一般为胞外基质成分，主要介绍多聚赖氨酸、纤维连接蛋白、胶原、层黏蛋白、韧黏素等。
多聚赖氨酸是合成的赖氨酸多聚体，分子量为7-30ku的多聚赖氨酸可作为细胞生长基质。
纤维连接蛋白是细胞表面与血清浆中的大蛋白分子，具有维持细胞结构、促进贴附功能。
层黏蛋白为胞外基质中分子量900ku的非胶原性糖蛋白，影响细胞的贴附和运动，调节细胞生长和分化。
动物细胞大规模培养技术研究进展
摘要 ：文章 浅析 了动物 细胞 大规模培 养技 术 的研 究进展 。 关键 词 ：动物细 胞 ；培 养技 术 ：进 展 中图 分类号 ： ￥ ５ ８ 文献标 识码 ：Ａ
文 章编号 ： １ ７ — ４ ２（ ０ １ ０ — １ ８ １ ６ ４ ０ ３ ２ １ ）～ ２ ０ ７ —
动物细胞培 养开始 于上世纪初 ， 由胚胎 学技术衍 生而来 。１６ ９２ 年 以后其 规模 开始 增大 ，发展 到现在 已成为 生物制 品生产 以及基 因 工程等领域 必不 可少的工 具之一 。利用动 物细胞 培养 生产具有 较高 医用价值 的酶 、疫 苗 、单 抗和 生长因 子等 ，已成 为生 物医药 等高新 技术产业 的重要组 成部分 。在大 规模培养 动物细 胞的过 程 中，最根 本的是使培 养细胞 的条件 达到最 优化 ，尽 可 能降低或 消除外 界环境 对 细胞的影响 ，使细胞 维持高存活力和 高效表达 。
性 ，从而在增加细 胞的移动性 的同时提高 了细胞 贴壁率 。
４培 养 过程 的 在 线监 控
在 大规模培 养动物 细胞 中，生物离线取 样特 别是产物浓 度测 定 需 要较长 的时 间，不能及 时反 映细胞生 存环境 中的各 种参数变 化 。 因此 ，在线 过程 监控 就 显得 非常 重要 ，这样可 以创造 适合细胞 生存 的最 佳环境 ，减 少培养过 程 中的污染 。到现在 为止 ，在细胞培 养过 程 中 已经 能对 温度 、ｐ 值 、溶解 氧 浓度 进 行在 线分 析 并控 制 。此 Ｈ １细胞 最 适 生 长培 养 基 的 选择 外 ，估测 目前和未 来生物 反应过程 中葡 萄糖 的吸收率和 乳搪 的生成 动 物 细胞 培养 基是 细 胞体 外赖 以生长 、增殖 、分化 的 重要 因 率 的软件也 已经研制 成功 ，这使 得对细 胞大规模 培养过 程的状 态监 素 。 目前 ，动物细 胞大规模 培养 中 已经普 遍使用 无血清 培养基 ，在 控更加及 时、准确 。 此 之前 使 用过 天然 培 养基 和合 成 培养 基 。无 血清 培 养基 在 很 多方 ５细胞 生 长 所 需 的最 佳 条 件 面 虽然都显 示 了极 其强大 的优势和 发展前 景 ，但 无血清 培养 的应 用 影 响细胞 培养 的主 要 因素有温 度 、ｐ 值、ｃ ０ Ｈ Ｏ、Ｄ 、葡萄糖 、 诱 发的细胞 凋亡也 成为 了动物 细 胞无血清 培养技 术中亟 待解决 的问 乳酸 、氨 、甲基 乙二醛 、培 养基成 分等 。一般情 况下 ，温 度一般 为 题 。研 究发现 ，在培养基 中加入一 些化合物 ，如金精 三羧酸 （ｕ ｉ ｔ Ａｒｎ ３ ℃，ｐ 值在７ Ｏ ７４ ＿ ，ｃ ， ７ Ｈ ．一． ２间 Ｏ水平为４ １％ Ｄ 维持在２ — ０ ，葡 — ０， Ｏ ０５％ ｒ ｃｒ ｏｙｉ ｃ ｄ Ｔ ） ｉａｂ ｘｌＣａ ｉ，ＡＡ 、抗氧 化剂和锌离 子等 ，可阻止 因采 用无 萄糖是细胞培养过程 中的能量 的主要来源 ，需要维持在一定水平。乳 血清培养 基而导致 的一定程 度上的细胞凋 亡。 酸、氨、 甲基 乙二醛等是动物细胞培养 中的主要降低 甲基 乙二醛 的浓度是通过 降低葡 萄糖用 量来实现的。
大规模动物细胞培养技术在兽用生物制品的研究进展
大规模动物细胞培养技术在兽用生物制品的研究进展动物细胞培养开始于本世纪初1962 年，其规模不断的扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，，而大规模动物细胞培养技术已经成为生物技术制药中非常重要的环节。
目前，大规模动物细胞培养技术在兽用生物制品上面，也已经开始了一些大规模的生产应用，细胞大规模培养技术作为行业技术升级改革的重要内容，农业部自2012年2月1日起，停止受理转瓶培养生产方式的的兽用细胞苗生产线项目兽药GMP验收申请。
因此，传统转瓶工艺的应用越来越受到限制使用。
自从20世纪60年代微载体生物反应器培养技术建立以来，国外许多国家对其在疫苗生产中的应用进行了广泛研究，细胞悬浮培养已是当前国际上生物制品生产的主流模式。
动物细胞有悬浮培养和贴壁培养两种，技术水平的提高主要集中在培养规模的扩大、细胞培养环境的优化、细胞特性的改变、不断提高产品的产量及保证其质量上。
本文就大规模动物细胞培养技术在兽用疫苗上的应用进行综述，分析了其在獸用生物制品产业的发展趋势。
一、动物细胞培养方法1.贴壁培养贴壁培养是指细胞贴附在某种载体上，载体悬浮在反应器里的培养方法，一切贴壁型细胞都能够适用于贴壁培养。
在实际生产中具有贴壁生长特性的细胞种类较多，如CHO细胞、PK—15细胞、ST细胞和Vero细胞等。
由于贴壁细胞具有贴壁的要求，提高细胞的密度就是使细胞培养规模最大化的有效方法。
传统的贴壁细胞培养包括方瓶、扁瓶、转瓶等。
但是由于其不能有效监控细胞的生长，操作比较复杂，所占空间大，劳动量也大，贴附面积具有限制性，在实际生产使用中受到极大的限制。
目前，贴壁细胞的微载体培养在细胞生产中得到广泛的应用。
2.悬浮培养悬浮生长的细胞其培养和传代都十分简便，细胞经过一定程度的驯化培养后，直接悬浮在适宜的液体培养基中，置于特定的培养条件下即可良好的生长。
传代时也不需要再进行分散，只需要添加一定比例的培养基即可继续生长。
大规模培养常用方法(贴壁培养、悬浮培养与固定化培养)-1
大规模培养常用方法（贴壁培养、悬浮培养与固定化培养）-1根据动物细胞的类型，可采用贴壁培养、悬浮培养和固定化培养等三种培养方法进行大规模培养。
一、动物细胞生长特性及培养温度1. 细胞生长缓慢，易污染，培养需用抗生素2.细胞大，无细胞壁，机械强度低，环境适应性差3.需氧少，不耐受强力通风与搅拌4. 群体生长效应，贴壁生长（锚地依赖性）5.培养过程产品分布细胞内外，成本高6.原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡依据在体外培养时对生长基质依赖性差异，动物细胞可分为两类：●贴壁依赖型细胞：需要附着于带适量电荷的固体或半固体表面才能生长，大多数动物细胞，包括非淋巴组织细胞和许多异倍体细胞均属于这一类。
●非贴壁依赖型细胞：无需附着于固相表面即可生长，包括血液、淋巴组织细胞、许多肿瘤细胞及某些转化细胞。
培养细胞的最适温度相当于各种细胞或组织取材机体的正常温度。
人和哺乳动物细胞培养的最适温度为35~37℃。
偏离这一温度，细胞正常的代谢和生长将会受到影响，甚至死亡。
总的来说，培养细胞对低温的耐力比高温高。
温度不超过39℃时，细胞代谢强度与温度成正比；细胞培养置于39~40℃环境中1h，即受到一定损伤，但仍能恢复；当温度达43℃以上时，许多细胞将死亡。
当温度下降到30~20℃时，细胞代谢降低，因而与培养基之间物质交换减少。
首先看到的是细胞形态学的改变以及细胞从基质上脱落下来。
当培养物恢复到初始的培养温度时，它们原有的形态和代谢也随之恢复到原有水平。
二、贴壁培养（attachment culture）是指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。
1. 生长特性：贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。
一般数天后就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。
2.贴壁培养的优点：●容易更换培养液；细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。
细胞固定化技术及其研究进展
・１ ２・ ２
陕
西
农
业
科
学
胞， 所以交联法的应用受到一定限制， 实际中常与
其他方法 联合 使用 。 渗 透 交联 法 是先 采用 某 种试剂 （ 多为表 面 活 性 剂 ） 理细 胞 ， 处 提高 细胞 的通 透性 ， 进行 交联 再 固定化 ， 以保 证酶 的活性破 坏较小 ， 可 又减小 了传 质阻力 。 这样 既提高 了 固定化 细胞的稳 定 ｌ 又提 生， 高了 固定化细 胞的表 观酶活性 。
种载体之中。 根据载体材料和方法的不同， 包埋法 可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法两种 。即将细 胞包埋在 凝胶等 物质 内部 的微孔 中或 由各种高 分 子聚合物制成的小球内。 包埋法操作简单 ， 条件温 和， 对细 胞活性影 响小 ， 作的 固定化 细胞球 强度 制 高， 目前研究最广泛的方法。 是 肖 美燕等［］ １对包埋法固定化技术的特点、 ０ 常
或微生物细胞固定在合适的不溶性载体上的一种 技术 ， 有关这一技术在一些具体应用领域 的研究
综述也有报道［ ］其中杨文英等［还对固定化细 。。 矗 ］ 胞的形态学及生理学特征、 理化环境及生物膜的
动 力 学 等 特 性 作 了 简 要 评 述 。Ｇｕ ｙ— Ａａｎ ｌｉ Ｊｎｅ［综述 了 固定化 对 微生物 细 胞 生理特 性方 ｕ ｔｒ］ 面的影 响 ， 这对 提高微 生物的 生物催化 活性 ， 促进 固定化 微生物 的实际 应用具有 重要意 义 。固定 化
１ 细胞 固定化方法的分类及应用
从理论上讲 ， 任何一种限制细胞 自由流动的 技术 ， 都可以用于细胞的固定化。 前制备固定化 目 细胞 的 方法 有 吸 附法 、 价 结合 法 、 共 交联 法 、 埋 包 法、 絮凝 法 、 多孔 物 质包 络法 、 超过 滤 法 以及 多种 固定化方法的联用等， 中以吸附法和包埋法的 其 应用较 为普遍 。
动物细胞大规模培养技术研究进展
仲恺农业技术学院学报,18(3):64～70,2005Journal o f Zhongkai Univer sity o f Agriculture and Technology文章编号:1006-0774(2005)03-0064-07动物细胞大规模培养技术研究进展吴方丽1,金伟波2,王保莉2,3,张 涌3(1.西北农林科技大学植物保护学院;2.西北农林科技大学生命科学学院;3.西北农林科技大学生物工程研究所,陕西杨凌712100)摘要:利用动物细胞大规模培养技术可生产多种生物制品,为提高细胞活力和细胞生长密度,采用有多种添加成分的无血清培养基培养细胞,选择既有利于细胞生长又可提高培养细胞密度的微载体和条件温和、易操作、气体交换速度快的生物反应器,在线监控细胞生存环境和生理活动,减少培养过程中培养基的抑制因素,从而给细胞提供更好的生存环境;另外通过向细胞中导入抗凋亡基因,可减缓细胞凋亡的发生,提高细胞活性和蛋白产量;此外,在动物细胞大规模培养过程中,利用多孔微载体能高效、大量地增殖细胞,具有良好的应用前景.关键词:动物细胞;培养环境;生物反应器;微载体中图分类号:Q251 文献标识码:AR esearch advance in large2scale culture of animal cellsW U Fang2li1,J I N Wei2bo2,W ANG Bao2li2.3,ZH ANG Y ong3(1.C ollege of Plant Protection;2.C ollege of Life Sciences;3.Institute of Bio2Engineering,N orthwest A&F University,Y angling712100,China)Abstract:Many biological products were manu factured by means of large-scale culture of animal cells.T o increase cell-specific productivity and cell density,serum-free media supplemented with several nutriments were used for cell culture,and microcarriers were chosen in fav or of cell growth and high cell density.Biore2 actors with sim ple manipulation,g ood qualification and aeration were adopted.M ore suitable conditions for cell growth could be given through on-line supervising the environment for cell growth and restraint factors in cell culturing.Furtherm ore,the anti-apoptosis genes using recombinant DNA technology can increase cell viability and productivity.P orous microcarriers was em phasized in large-scale culture of animal cells.K ey w ords:animal cell;culture environment;bioreactor;microcarrier 组织培养技术是19世纪末由胚胎学技术衍生而来.近一个世纪以来,从能维持组织存活到生长出新细胞,从少数组织到各种组织细胞的培养,从精细的实验室培养技术到大规模的生产工艺,组织培养技术已成为生物制品生产以及基因工程等领域必不可少的工具之一.目前,动物细胞大规模培养技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、细胞培养环境的优化、生物反应器的改良、改变细胞特性、提高产品的产出率与保证其质量上.在动物细胞大规模培养的过程中,最根本的是使细胞的培养条件达到最优化,尽可能消除或减轻环境对细胞的影响,维持细胞高存活力和高效表达.若以生产蛋白为目的的体外细胞培养,同时还要充分考虑细胞表达产物的后续纯化.收稿日期:2005-04-18基金项目:国家高技术研究发展计划(863)计划资助项目(2001AA21308);西北农林科技大学重点专题基金资助项目.作者简介:吴方丽(1979-),女,河南睢县人,助教,博士.1 细胞最适生长培养基的选择培养基是细胞赖以体外生长、增殖、分化的重要因素.一般情况下,动物细胞的生长均有赖于血清的存在.但使用血清主要存在潜在的污染源、不同批次间蛋白含量差异大及价格高等弊端[1],给生物制品的生产造成了不便,这就引发了人们对无血清培养基的研究.结果发现,只要在培养基中添加某些适于细胞生长的成分,如纤连蛋白、转铁蛋白、胰岛素和表皮生长因子等,多种细胞即可在无血清供应的情况下生长[2],尤其是中华仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary ,CH O )细胞、杂交瘤细胞及重组骨髓瘤细胞等,其中胰岛素是无血清培养基中促进动物细胞生长最重要的多肽.CH O 细胞能在仅含重组人胰岛素的一种蛋白成分的无血清培养基中连续传代[3].在人类细胞培养中,某些细胞在无血清的条件下,其生长和抗体的产量甚至比有血清的培养基高出数倍.另外,应用无血清培养基还能有选择性地控制及避免成纤维细胞的过度生长.应用无血清培养基培养动物细胞的成功,还将为某些痘苗的生产降低成本[4].目前,大规模动物细胞培养中已经普遍使用无血清培养基,从而避免了血清培养基污染的可能性,并减少了纯化的难度.但无血清培养基缺乏广泛的适应性,不同的细胞甚至不同的细胞株和细胞系有各自独立的无血清培养基配方.如用于基因重组促人红细胞生成素(Recombinant human erythropoietin ,rHuEPO )生产且不含牛血清白蛋白的无血清培养基-p (Serum free medium -p ,SFM -p )培养液,就是在达尔贝可改良的伊格尔(Dulbecco πs m odified Eagle πs medium ,DME M )∶F12(1∶1)培养基中添加了Se 、乙醇胺、多种维生素、蛋白胨、胰岛素、转铁蛋白和一些细胞因子等成分构成的专用培养基[5].无血清培养基虽然在各个方面都显示出其强大的优势和发展前景,但采用无血清培养而诱发的细胞凋亡也成为动物细胞无血清培养技术中亟待解决的问题.在培养基中加入某些化合物,如金精三羧酸(Aurint ricarboxylic acid ,AT A )、锌离子、抗氧化剂和细胞因子等,在一定程度上可阻止因采用无血清培养基而导致的细胞凋亡[6].但是,由于培养基中所添加的蛋白成分主要还是来源于动物或人,仍然存在病毒污染的危险,只有完全采用非动物来源的材料,才是相对安全的,而植物提取物将是理想的选择.可以这样预测,未来开发的新一代无血清培养基,将是一种既无血清、无蛋白,又可以高温消毒,且适合于多种不同细胞生长的全能型培养基[7].2 生物反应器的选择在生物制品生产中,动物细胞培养已越来越重要,而动物细胞培养的最主要设备就是生物反应器(也称动物细胞发生器)[8～10].由于动物细胞(尤其是哺乳动物细胞)在促红细胞生成素(Erythropoietin ,EPO )、干扰素(Interferon ,IFN )、尿激酶原(Pro 2Urokinase ,Pro 2UK )、疫苗以及其他一些价值昂贵的生物制品的生产上具有独特的优势,因此近年来有关动物细胞生物反应器的研制进展迅速[11～13].目前国内外生物反应器的种类较多,应用于生产实际的也不少,概括下来主要有以下几种:211 机械搅拌式(S pinner )生物反应器机械搅拌式生物反应器是开发较早、应用较广的一类生物反应器,主要由培养罐、管、阀、泵、马达及仪表组成.培养物的混匀由马达带动的不锈钢搅拌系统实现,在罐体顶端还有一些传感器,可以连接监测培养物的温度、pH 值溶氧度(Diss olved oxygen ,DO )、葡萄糖消耗、NH 3、NH 4+等参数.这种反应器培养规模可达2000L ,若再配合微载体、多孔微球、灌注技术,可使细胞密度达到107/m L 以上,而且消毒方便.另外,其最大的优点是能培养各种类型的动物细胞,培养工艺容易放大,产品质量稳定,非常适合工厂化生产,但不足之处是机械搅拌所产生的剪切力对细胞有一定的损伤[14,15].212 气升式(Air lift )生物反应器气升式生物反应器的基本原理是气体混合物从底部的喷射管进入反应器的中央导流管,使得中央导流管侧的液体密度低于外部区域从而形成循环.它在结构上和搅拌式大同小异,其显著特点是用气流代替不锈钢叶片进行搅拌,因而产生的剪切力相对温和,对细胞损伤较小[16].英国Celltech 公司是应用气升式生物反应器进行动物细胞大规模培养的成功范例,该公司在1985年应用100L 气升式生物反应器对杂交瘤56第3期吴方丽,等:动物细胞大规模培养技术研究进展66仲恺农业技术学院学报第18卷细胞进行了大规模培养,现在还开发出了10000L气升式生物反应器用于各类单克隆抗体的规模化生产[17].国内也有人设计制造了10L规模的气升式生物反应器用于培养哺乳动物细胞和昆虫细胞等[18].213 中空纤维管(H ollow fiber)生物反应器中空纤维管生物反应器是开发较早且正在不断改进的一类生物反应器.其原理为泵动培养液通过成束的合成空心纤维管(毛细管)而使细胞固着在毛细管内壁上生长.如果毛细管的直径为350μm,表面积∶体积比为30∶7,因此大量成束的毛细管内壁提供了大量的细胞生长表面积.中空纤维管生物反应器的用途较广,既可培养悬浮生长的细胞,又可培养贴壁依赖性细胞,并且细胞密度最高可达109/m L[19],主要用于培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体.其特点是细胞培养环境温和,培养细胞密度较高,产品较容易分离纯化[20].但这种反应器的培养环境不够均一,在一定程度上影响了产品质量的稳定性.而且,中空纤维培养工艺不易放大,反应器本身的消毒和重复使用也相对较难[21].214 旋转式细胞培养系统20世纪90年代中期,美国宇航局(National aeronantics and space administration,NAS A)开发了一系列旋转式细胞培养系统(The rotary cell culture system,RCCS),又叫回转式生物反应器(R otating wall vessel biore2 actor,RW VB),这是目前世界上培养贴壁和悬浮细胞的最新装置.该系统原先是为保护在宇航中所进行的纤细的组织培养而设计的.然而,它的低剪切力、高物质传递效率和微重力的独特环境,使人们在普通实验室的组织培养箱内也能培养出三维细胞组织[22,23].RCCS是绕水平轴旋转、无气泡的膜扩散式气体交换的培养系统.因该系统无推进器、空气升液器、气泡或搅拌器,故几乎没有破坏性的剪切力,使得大细胞团得以形成.与普通系统相比,RCCS的一个主要优势是进行能分化或模仿父系组织结构和功能的组织培养.使人们能得到和在人体内一样的培养产物[24～26].由于可模拟空间中的微重力环境,该生物反应器被誉为空间生物反应器.其模拟空间环境的机理是它可使培养物的重力向量在旋转过程中产生随机化,导致一定程度的重力降低,使细胞处于一种模拟自由落体状态,以此模拟微重力环境[27].RCCS由于没有搅拌剪切力的影响,细胞可以在相对温和的环境中进行三维生长,同时随机化的重力向量可能直接影响细胞的基因表达,或者间接促进细胞的增殖分化和组织器官形成,因而这种生物反应器可用于当前十分热门的组织工程研究,也可用于探索微重力环境对细胞生长、分化的影响[28,29].215 其它生物反应器近年来在组织与细胞工程领域用到的还有流化床生物反应器(Fluidized bioreactor)、Petri碟生物反应器(Petri bioreactor)、脉动式生物反应器(Pulsatile bioreactor)、摇床式生物反应器(Shaking bioreactor)、填充床生物反应器(Packed bed bioreactor)等[9,10,12,30],由于这些生物反应器应用不普遍,故不作详述.3 培养用微载体的选择大多数被培养的动物细胞都是贴壁依赖性细胞,而传统的贴壁依赖性细胞的培养是通过静止或转瓶培养等方式获得,其操作繁复,且耗费空间及人力.1967年,Van Wesel[31]首先提出了“微载体”培养系统,为贴壁依赖性细胞的高产培养提出了一个新的概念.经过几十年的研究,现在微载体培养已广泛应用于动物细胞的培养,并取得了许多成果.如微载体的大小和电荷量达到了最优化,以提高细胞的生长能力;微载体表面特性的改善,以利于细胞的快速贴壁等.细胞成功地在微载体上扩展的能力随细胞系和培养基的不同而变化,因此为特定细胞选择合适的微载体比选择微载体本身更重要.近年来开始使用的多孔微载体[32]可提供大的表面积∶体积和最大的细胞密度[33],然而以该载体培养的有些细胞系却贴在微载体内,其“移动性”相对较差.因此需要研制一种更好的培养方式,以提高微孔的开放性或者改善其表面特性,从而在提高细胞贴壁率的同时增加细胞的移动性.4 培养过程的在线监控在动物细胞的大规模培养中,生物离线取样特别是产物浓度测定需要较长的时间,不能及时反映细胞生存环境中的各种参数变化,因而在线过程监控在动物细胞的大规模培养中具有非常重要的地位,可以创造适合细胞生存的最佳环境,减少污染等.目前在培养过程中已经能对温度、pH 值、溶解氧浓度进行在线分析,并可进行有效控制.最近几年,有关细胞培养过程监控的研究迅速增多,在线测量氧吸收速率,可以确定从细胞生长期生产病毒到感染期和细胞死亡后终止感染的转换时间;用在线葡萄糖分析仪的测定来调整灌流速度等[34].另外,估测目前和未来生物反应过程中葡萄糖的吸收率及乳搪的生成率的软件也已经研制成功[35],这使得对细胞培养过程的状态监控更加及时、准确.5 维持细胞生长所需的最佳条件影响细胞培养的主要因素有C O 2、DO 、温度、pH 值、葡萄糖、氨、乳酸、甲基乙二醛、培养基成分等.一般来说,最适C O 2水平为4%～10%,DO 维持在20%～50%,温度一般为37℃,pH 值在710～714之间.葡萄糖是细胞培养过程中的主要能量来源,必须维持在一定水平.氨、乳酸、甲基乙二醛等是动物细胞培养的主要限制因素.氨离子抑制谷氨酰胺(G lutamine ,G 1n )的代谢途径,应限制G ln 用量,并尽可能去除培养基中的氨;高浓度乳酸可抑制细胞生长,应降低培养基中的葡萄糖浓度以减少乳酸产生,在动物细胞大规模培养中常常需添加果糖,以减少葡萄糖的使用量;甲基乙二醛能改变氨基酸、蛋白质和核酸的氨基和巯基,实际应用中降低甲基乙二醛的浓度主要也是通过降低葡萄糖用量来实现的[7].6 物理场效应对细胞生长的影响各种物理场如静电场、磁场等都会对细胞的代谢产生一定的作用[36,37].物理场对细胞的刺激作用存在阈值,不同的物理场对不同细胞存在不同的场效应.人们目前对各种物理场对细胞的刺激效应有了一定研究,并试图将之应用到动物细胞培养体系之中[38].Bowlin 等[39]证实,细胞经电场作用刺激后,其生理活性有很大的提高,胞外某些物质的含量也明显上升.这说明适当的电场刺激可以提高细胞培养的效率.同时,一定的静电场还有助于细胞产物的分离[40].611 增强细胞抗凋亡能力在动物细胞大规模培养的初期,细胞数量不断增加,表达重组蛋白的能力也在逐步提高.随着细胞数量达到顶峰之后,细胞数量和表达水平将下降.因此,在动物细胞大规模培养的后期,维持细胞的高活力是一个富有挑战性的课题.最初的研究似乎表明细胞死亡大多由于坏死,而人们逐渐认识到至少有一些细胞系在生物反应器中出现细胞死亡的主要原因是细胞凋亡[7].随着细胞凋亡分子机制研究的不断深入,细胞凋亡的发生被认为是动物细胞大规模培养过程的重要制约环节,预防并控制细胞凋亡也因此成为研究的热点.用基因工程方法将Bcl 22这种细胞调亡抑制基因导入细胞,已成为众多学者的选择[41,42].Bcl 22基因的过量表达能抑制G ln 或氧缺乏引起的细胞凋亡,减少细胞特定营养成分的消耗,提高细胞密度和目的蛋白产量[42,43],这对于细胞大规模培养具有重大意义.但Bcl 22等抑制基因对细胞的这种保护作用依赖于它的高水平表达,因此,需要寻求在低表达水平便可达到目的的更强的细胞凋亡抑制基因.在动物细胞大规模培养条件下,细胞凋亡/死亡多是在营养成分耗尽、有毒代谢产物增多时发生,因此一种“细胞静止”过程可以有效降低营养成分的消耗和有毒代谢产物的产生,提高CH O 细胞的目的蛋白产率[44],其方法就是向CH O 细胞中导入p21、p27基因,使细胞周期中G l 期延长(细胞静止).经过如此改造后,细胞活力正常,外源基因表达蛋白量提高,并使产品成本降低,产量提高,遗传稳定性增加[45].612 选择合适的细胞培养工艺流加培养(Fed -batch )和灌流培养(Pefusion )是动物细胞培养工艺中最常用的两种操作方式.另外可供选择的方式还有批式-反复流加(Batch-refeeding ).虽然许多较老的病毒生产工艺采用批式操作(Batch ),新的病毒疫苗生产已采用改良的生产形式,如批式-反复流加或灌流培养工艺.流加培养工艺的基础是用搅拌生物反应器,营养物的添加主要考虑减少代谢废物的积累和营养的均衡,维持一个高细胞密度和高产物浓度.相对于流加培养,灌注培养的主要优点是连续灌注的培养基可以提供充分的营养成分,并带走代谢产物;同时,细胞保留在反应器中,可以达到很高的细胞密度.与其他方法相比,灌注培76第3期吴方丽,等:动物细胞大规模培养技术研究进展86仲恺农业技术学院学报第18卷养的产率可以提高一个数量级,并可以大大降低劳动力成本[46].灌注培养主要分为悬浮灌注培养和床层灌注培养两大类.悬浮灌注培养是在普通悬浮培养的基础上,加上一个细胞分离器而成,其中以微载体悬浮培养加旋转过滤分离器最为常见;床层灌注培养则把细胞直接保留于床层,不需要分离器,其中以堆积床和大孔载体培养的应用较广泛[46].流加悬浮培养与灌流悬浮培养在操作形式上并无明显不同,两种操作形式的选择完全取决于每个产品潜在的细胞生长活力与相关产物的稳定性,以及产品的最高产量需求和质量要求.7 存在问题711 无血清培养基适用范围窄目前应用的无血清培养基表现为细胞的适用谱极窄,细胞在无血清培养基中更易受某些机械因素和化学因素的影响,培养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便.因此无血清、无蛋白、可高温消毒,且适合于多种不同细胞生长的全能型培养基是未来研制无血清培养基的方向.712 固定化培养技术及微载体需进一步探索目前虽然对各种固定化载体某一方面的性能进行了一些改进,但总体上还不能很好地同时满足操作简便、系统稳定、经济适用、生物相容性好以及对细胞的机械保护等诸多要求.因而研制新型的固定化载体以满足上述要求,是动物细胞固定化培养技术继续发展的一个主要方向.在细胞的固定化培养过程中,往往忽略了载体对细胞的生物学作用.即只注意了载体对细胞的机械保护而忽略了载体对细胞代谢过程的影响和调控.尝试研制具有一定生物学功能的细胞固定化载体,是载体研究中一个全新的领域.结合当今最新的纳米技术,可以在载体表面附着一些生物功能性分子,对培养过程进行一定的调节;同时通过不同的生物以及选择不同的加入时间,可望实现培养过程的阶段性调控.但是目前有关这方面的研究仍主要集中在对无机膜的修饰和对无机分子的研究,而有关生物大分子的应用仍处在尚未开发的阶段[47].713 生物反应器装置及生产工艺仍需改进目前动物细胞大规模培养中所应用的生物反应器皆有其独特的优点,但同时也存在一定的不理想因素.低或无剪切力,同时还能在线监控的生物反应器是以后研究的重点.另外,动物细胞培养系统在利用新技术、新工艺的同时,还不能协调细胞及其环境与新技术应用的关系.在目前的技术条件下,对这一关系的协调仍旧处于摸索阶段,尚缺乏足够的理论指导.8 展望经过几十年来的研究与实践,目前虽然动物细胞大规模培养技术还存在不少问题,但较之几十年前已是质的飞跃.随着这一技术的进一步发展,人们还将不断努力,研制更理想的生物反应器,以获得高密度、高活力的细胞;开发新的无血清培养基,使细胞的生长状态更好,生物制品更安全;建立细胞培养与产物分离的涡合系统,充分利用培养液,以降低生产成本等,从而使动物细胞培养技术在生物制品制备和基因工程等领域得到更广泛的应用.参考文献:[1] VOIGE A,ZI M L F.Hybridoma cell growth and anti2neuroblas ona m onoclonal antibody production in spinner fleeks using a protein2freemedium with microcarrier[J].J Biotechnol,1999,68(2-3):213-226.[2] SI NAC ANE M S,DRAPE AU D,ADAMS ON S K.Adaptation of mammalian cells to growth in serum free media[J].M ol Biotechnol,2000,15(3):249.[3] 徐 冰.大规模哺乳动物细胞培养[J].国外医学:预防、诊断、治疗用生物制品分册,1997,20(5):212.[4] 忻亚娟,朱家鸿.动物细胞培养技术的进展[J].浙江预防医学,2001,(14):48-50.[5] 邓继先,杨 琴,程 萱,等.用于生产rK uEPO的无血清培养基的研究[J].军事医学科学院院刊,1997,2l(4):244-250.[6] 陈昭烈.动物细胞培养过程中的凋亡[J ].生物工程进展,1998,18(6):17-20.[7] 邹寿长,李干祥,杨葆生,等.大规模动物细胞培养技术研究进展[J ].生命科学研究,2001,5(2):102-108.[8] ZH AO LIE C ,DIRKL ,K AI I J.High 2ensity culture of recombinant Chinese hamster overay cells producing prothrombin in protein 2freemedium[J ].Biotechnology Letters ,2001,23(10):767-770.[9] LI U C M ,H ONG L N.Development of a shaking bioreactor system for animal cell cultures [J ].Biochemical Engineering Journal ,2001,7(2):121-125.[10] G OUT AM S ,A LOKB ,S ATY ABROT O S.M odeling of the oxygen trans fer characteristics of a ‘see 2saw ’bioreactor[J ].Chemical En 2gineering &T echnology ,2001,24(1):97-101.[11] 谭昌耀.用哺乳动物生产人用治疗制剂的发展与改进[J ].国外医学:预防、诊断、治疗用生物制品分册,2001,24(1):11-14.[12] H AUT B ,AM OR H B ,C OU LON L ,et al .Hydrodynamics and mass trans fer in a C ouette -T aylor bioreactor for the culture of animalcells[J ].Chemical Engineering Science ,2003,58:777-784.[13] K AME N A A ,T OM R L ,C ARON A W ,et al .Culture of insect cells in a helical ribbon im peller bioreactor[J ].Biotechnology andBioengineering ,1991,38(6):619-723.[14] SHI Y,RG U D D Y,PERFORM ANCE S H.Per formance of mammalian cell culturebioreactor with a new im peller design [J ].Biotechnology and Bioengineering ,1992,40(2):260-264.[15] CHE N Zhaolie ,PIRKLutkemeyer ,K AI Iding.High -density culture of recombinant Chinese hamster ovary cells producing prothrom 2bin in protein -free medium[J ].Biotechnology Letters ,2001,23:767-770.[16] 李学梅,林建平,刘 娥,等.固定化米根酶发酵制L 2乳酸[J ].菌物系统,1998,17(4):318-326.[17] MEISS NER P ,SCHRODER B ,HERFURTH C ,et al .Development of a fixed bed bioreactor for the expansion of human hematopoieticprogenitor cell[J ].Cytotechnology ,1999,30:227-234.[18] 谭文松,陆 健,张元兴.气升式生物反应器在杂交瘤细胞培养中的应用[J ].生物工程学报,1996,12(4):477-481.[19] K ONG D ,C ARDAK S ,CHE N M ,et al .High cell density and productivity culture of Chinese hamster ovary cells in a fluidized bedbioreactor[J ].Cytotechnology ,1999,29:215-220.[20] M ARY A I C ,JU LI O A L ,RIC ARDO J G.S olving design equations for a hollow fiber bioreactor with arbitrary kinetics[J ].ChemicalEngineering Journal ,2001(84):445-461.[21] VI NCE NZ A C ,STEFANO C ,G ABRIE LE I.A theoretical analysis of transport phenomena in a hollow fiber membrane bioreactor withimm obilized biocatalyst[J ].Journal of membrane Science ,2002,206:217-241.[22] FREE D LE ,VUN JAK 2N ovakovic G.M icrogravity tissue engineering[J ].In vitro Cellular and Development Biology ,1997,33:381-387.[23] 胡 江,陶祖莱.组织工程研究进展[J ].生物医学工程学杂志,2000,17(1):75-80.[24] 万 超,杨庆铭,邓廉天,等.MSCs 2PG A 兔复合物在RCCS 中的成骨潜能[J ].上海第二医科大学学报,2002,22(5):403-407.[25] 何 川,邓廉天,周来生,等.RCCS 中犬成骨细胞nBG C 复合物联合培养的实验研究[J ].上海第二医科大学学报,2003,23(4):301-304.[26] VUN JAK N ovakovic G,M ARTI N I ,OBRADOVIC B ,et al .Bioreact or cultivationconditions m odulate the com position and mechanicalproperties of tissue 2engineering cartilage[J ].J Orthop Res ,1999,17(1):130-138.[27] SCHW ARZ R P ,G OODWI N T J ,W O LF D A.Cell culture for threedimensional m odeling in rotating wall vessels :an application insimulated microgravity[J ].J T issue Culture Methods ,1992,14:51-58.[28] QI NG 2Qing Q ,PAU L D ,PORT ONOVO S ,et al .Fabricatin ,characterization andevaluation of bioceramic hollow microspheres used asmicrocarriers for 32D bone tissue formation in rotating bioreactors[J ].Biomaterials ,1999,20:989-1001.[29] K ONST ANTI ONS J D ,LE ONARD J N ,TI M OTHYJ B ,et al .The simulated microgravity environment maintains key metabolic func 2tions and prom otes aggregation of primary porcine hepatocytes[J ].Biochimica et Biophysica Acta ,2001,1526:119-130.[30] GIRARD P ,JORDAN M ,TS AO M ,et al .Small 2scale bioreactor system for process development and optimization[J ].BiochemicalEngineering Journal ,2001,7:117-119.[31] VAN Wezel A L.G rowth of cell 2strains and Primery cells micro 2carriers in hom ogenecus culture[J ].Nature ,1967,216:64-65.[32] 王佃亮,肖成祖,陈昭烈,等.微载体高密度培养Vero 细胞研究[J ].生物工程学报,1996,12(2):164-170.[33] 张 立,严 春,范卫民,等.Vero 细胞的微载体培养[J ].华东理工大学学报,1998,24(6):659-663.[34] H U W S ,AUNI NS J rge 2scale mammalian cell culture[J ].Curr Opin Biotech ,1997,8:48-153.96第3期吴方丽,等:动物细胞大规模培养技术研究进展。
固定化细胞技术的研究进展
四川食品与发酵S ic h u a n Fo od a n d F e rm e n ta t io n固定化细胞技术的研究进展张磊,张烨,侯红萍(山西农业大学食品学院,山西 太谷 030801)摘要:本文介绍了固定化细胞的制备方法,综述了在固定化载体、影响固定化的因素的研究和发展进行了综述,并对固定化细胞技术的应用前景进行了简要论述。
关键词:细胞;固定化;载体中图分类号:TS20112 文献标识码:A 文章编号:1671-6892(2006)01-0005-03Devel opments I n Cells I m mobilizati on TechniqueZ HANG Lei,ZHANG Ye,HOU Hong-p ing(College of Food Science,Shanxi Agricultural U niversity,Taigu Shanxi 030801)Abstract:I n the paper,the p reparati on methods of i m mobilized cells are intr oduced,mean while the i m2 mobilizati on carrier and the fact ors which have effects on i m mobilized are ouervie wed.The app licati onf oregr ound of i m mobilized cells technol ogy are als o included in this article.Key words:Cell;i m mobilizati on;carrier 固定化细胞技术是20世纪70年代兴起的一种生物技术。
所谓固定化细胞技术是指用物理或化学的手段将游离细胞定位于限定的空间区域,并使其保持催化活性、反复使用的方法。
固定化细胞技术研究和进展
胞的最大比生长 ⟡ 倍。 μｍ 降解了 ２ 等 Ｂ ｏ ｋ ｈ ａ ｍ ｙ
１ ３
利用固定化混合微生物体系降解蒽醌 －２ －
磺酸钠（ ） ， 并与游离微生物体系进行了比较。结果表明 ≹ 当 Ｓ Ａ Ｓ
－ １ 稀释率 ０ 时，固定化细胞体系与游离细胞体系 Ｓ 的 ． ０ ０ ５ ｈ Ａ Ｓ － １ 最大降解率分别为 ８ 和５ ·Ｌ－１ ·ｈ 。 ９ ９ ｍ ｇ
－ １ － １ ·Ｌ ， 出水酚浓度小于 ０ ·Ｌ ， 与悬浮生物法（ 如活性 ｍ ｇ ． ５ ｍ ｇ
污泥法） 相比， 酚的容积负荷可提高 １ 倍以上， 污泥发生量可减 少９ ０ ％。 孙艳等
１ １
对一种耐酚菌种及其固定化细胞降解含酚废水
性能进行了比较研究， 结果表明， 固定化细胞的降解效果明显 高于游离细胞。 芳香族类化合物的降解 ４ ． １ ． ２ 等 Ｓ ｈ ｒ ｅ ｖ ｅ
１ ５
以Ｐ 无纺布混合载体包埋固定化优势菌种 Ｖ Ａ－
用于降解吡啶、 异吡啶和喹啉， 结果表明， 种难降解有机物经 ３
１ ２ ２
王新等 固定化细胞技术的研究与进展
年４ 月 ２ ０ ０ １
固定化细胞处理 ８ 后， 降解率均在 ９ ｈ ０ ％以上。 杀虫剂废水的研究 ４ ． ２固定化细胞处理农药、 陈敏等
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固定化动物细胞大规模培养技术研究进展
固定化动物细胞大规模培养技术研究进展石 凯1 熊晓辉1 许建生2(1南京工业大学制药与生命科学学院,南京,210009;2苏州农业职业技术学院,苏州,215008)摘 要 介绍了固定化动物细胞培养过程中主要的技术及其进展,包括吸附、包埋、中空纤维、微囊化等。
并在此基础上探讨了固定化动物细胞培养中尚存在的问题以及未来的发展方向。
关键词 固定化,动物细胞培养,吸附,微载体,包埋,中空纤维,微囊化中图分类号 Q 813.1+1 文献标识码 A 文章编号 1000-6613(2002)08-0556-04 固定化技术作为实现动物细胞大规模培养的重要途径,相对悬浮培养而言具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强、产物易于收集和分离纯化、对贴壁型和非贴壁型细胞都适用的优点,因此在动物细胞的大规模培养上得到越来越广泛的应用,相继出现了微载体、中空纤维及微囊化等多种固定化培养技术。
本文作者将结合动物细胞的培养特性,介绍目前动物细胞大规模培养中的固定化技术。
1 动物细胞的特点及生长特性动物细胞虽可像微生物细胞一样,在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养,但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比,有显著差别[1]:①动物细胞比微生物细胞大得多,无细胞壁,机械强度低,对剪切力敏感,适应环境能力差;②倍增时间长,生长缓慢,易受微生物污染,培养时须用抗生素;③培养过程需氧量少(氧传质系数k L a 大于10h -1即可满足每毫升107个细胞的生长);④培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在;⑤原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡;⑥代谢产物具有生物活性,生产成本高,但附加值也高。
动物细胞根据其在体外培养时对生长基质的依赖性差异,分为锚地依赖性和非锚地依赖性。
大多数分泌药用蛋白的动物细胞属于锚地依赖性细胞,即要有足够地支持细胞贴壁的表面,又要保持均匀悬浮状态。
固定化技术就是解决这两个问题的有效途径。
2 固定化培养方法在传统的固定化酶技术中,常采用戊二醛、聚丙烯酰胺、聚氨酯等作为固定化细胞载体。
动物细胞大规模培养技术
青 睐。 到各 大、 中城市建立绿色产品专卖店 、 连锁店 、 加盟店 ，
到各 大 超 市 开 设食 品 专 柜 、 销 区等 ， 产 品运 输 、 藏 中 实 专 在 储 行绿 色 冷 链 管 理 ， 保 产 品 的 绿 色 营 养 品 质 ， 进 产 品 的 营 确 促
６ 延伸产业链 。 ． ２ 推行产业化 随着人们生活水平的逐步提高 ， 绿色食品的市场竞争愈
原本 为圆形的细胞一经 贴壁就迅速铺展 ，然后开始有丝分
裂 ， 很 快进 入 对 数 生 长期 。 般 数天 后 就 铺 满 培养 表 面 ， 并 一 并
新 。我国是疫苗产品 的最大使用国和最大生产 国， 但关键生 产工艺以及部分疫苗质量与 国际发达 国家存在较大差距 。 国 内大部分疫苗生产企业仍采用的转瓶 培养 动物细胞 ， 每个转
（ ） 细胞 繁 殖贴 壁后 不 易 消化 下 来 ， 的扩 大 比较 困难 ； １ 培养
进一步扩大 、 优化细胞培养环境 、 高产 品的产 出率与保证 提
其质量 ， 动物细胞大规模 培养技术 已成为各生产企业 发展 至
关 重 要 的环 节 。
近几年来 ，随着科学技术的发展和人们认识 的提高 ， 为
演愈烈 ， 所以不断完善质量管理体系 ， 研发绿色产品 ， 全力 打
销， 扩大产品在国内外市场 的知名度和 占有率。实施绿 色营 销奠定 良好的基础 。进一步提高企业 知名度增强品牌效应 、
专 论 与 综 述
动物细胞大 规模 培 养技术
朱庆 虎 秦 红 丽 陈 弘 ４刘 兰刚 ２ 二 勇 。 ， ， ， ， 康
（． １哈尔滨 兽 医研 究所 ， 哈尔滨 １ ０ ０ ；． ５ ０ １ ２武川县 农村 改水 办公室 。武 川 ３天津 市天农 大生物技 术发展 有 限公司 ，天津 ． ３００ ； ０ ４ ２ ０ １０ ； １ ７ ０
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固定化动物细胞大规模培养技术研究进展石 凯1 熊晓辉1 许建生2(1南京工业大学制药与生命科学学院,南京,210009;2苏州农业职业技术学院,苏州,215008)摘 要 介绍了固定化动物细胞培养过程中主要的技术及其进展,包括吸附、包埋、中空纤维、微囊化等。
并在此基础上探讨了固定化动物细胞培养中尚存在的问题以及未来的发展方向。
关键词 固定化,动物细胞培养,吸附,微载体,包埋,中空纤维,微囊化中图分类号 Q 813.1+1 文献标识码 A 文章编号 1000-6613(2002)08-0556-04 固定化技术作为实现动物细胞大规模培养的重要途径,相对悬浮培养而言具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强、产物易于收集和分离纯化、对贴壁型和非贴壁型细胞都适用的优点,因此在动物细胞的大规模培养上得到越来越广泛的应用,相继出现了微载体、中空纤维及微囊化等多种固定化培养技术。
本文作者将结合动物细胞的培养特性,介绍目前动物细胞大规模培养中的固定化技术。
1 动物细胞的特点及生长特性动物细胞虽可像微生物细胞一样,在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养,但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比,有显著差别[1]:①动物细胞比微生物细胞大得多,无细胞壁,机械强度低,对剪切力敏感,适应环境能力差;②倍增时间长,生长缓慢,易受微生物污染,培养时须用抗生素;③培养过程需氧量少(氧传质系数k L a 大于10h -1即可满足每毫升107个细胞的生长);④培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在;⑤原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡;⑥代谢产物具有生物活性,生产成本高,但附加值也高。
动物细胞根据其在体外培养时对生长基质的依赖性差异,分为锚地依赖性和非锚地依赖性。
大多数分泌药用蛋白的动物细胞属于锚地依赖性细胞,即要有足够地支持细胞贴壁的表面,又要保持均匀悬浮状态。
固定化技术就是解决这两个问题的有效途径。
2 固定化培养方法在传统的固定化酶技术中,常采用戊二醛、聚丙烯酰胺、聚氨酯等作为固定化细胞载体。
但在动物细胞培养中,培养细胞的目的不仅仅要求催化活力,更重要的是利用细胞来合成和分泌蛋白,因此如何保持细胞的活性显得尤为重要。
由于动物细胞的极度敏感性,上述这些固定化方法会对动物细胞产生毒性,另外多糖(如卡拉胶等)由于具有很高的离子强度也会对细胞产生毒害。
故在动物细胞培养中要考虑使用较温和的固定化方法,如吸附、包埋、中空纤维或胶囊化。
2.1 吸附2.1.1 多孔陶瓷KC.Biologicals (USA )公司开发了一种完全自动化的细胞培养系统[2]。
该系统的核心是陶质矩形蜂窝状生物反应器。
反应器构型是一圆筒内装置有许多陶质矩形通道的蜂窝状圆柱体。
通道长30cm ,截面积是长方形,约为1mm 2,壁厚0.12mm ,可提供4.25m 2的生长表面积。
这种结构的生物反应器,既可用于培养悬浮生长的细胞,又可用于培养贴壁依赖性细胞。
该系统可以连续化生产蛋白质。
由于产物直接分泌到培养基中,给分离纯化带来方便。
而且细胞不用从培养基中分离,所以不必考虑梯度问题;当培养基高速循环时,可以保持相对恒定的营养物和氧浓度。
增加套数即可实现放大。
2.1.2 微载体微载体细胞培养法是一种用于培养锚地依赖性细胞的大规模培养技术,由Van Wezel [3]于1967年首创。
这种培养技术是在生物反应器内加入培养液和一种对细胞无毒害作用的材料支撑的颗粒(微载体),使细胞在微载体表面附着和生长,并通过不断搅拌使微载体保持悬浮状态。
培养液中大量的收稿日期 2001-12-07;修改稿日期 2002-03-05。
第一作者简介 石凯(1977—),男,硕士研究生。
电话025-*******-3716。
・655・ 2002年第21卷第8期 化 工 进 展CHEMICAL INDUSTR Y AND EN GIN EERIN G PRO GRESS微载体为细胞提供了极大的附着表面,1g微载体其比表面积可达6000cm2,从而可实现细胞的高密度培养[4]。
微载体的直径在60～250μm,由天然葡聚糖、凝胶或各种合成的聚合物组成,如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等[5～7]。
由这些材料及其改良型制成的微载体主要参考了细胞的粘附特性,在其表面带有大量电荷及其他生长基质物质,因而有利于细胞的粘附、铺展和增殖。
Van Wezel当时选用的是阴离子交换树脂Sephadex A50培养动物细胞,其后Van Hemert、Spier及Whiteside也相继作了培养仓鼠肾细胞(BH K21)等细胞及生产口蹄疫苗的报道[8]。
采用微载体培养具有以下优点:①比表面积大,单位体积培养液的细胞产率高;②采用均匀悬浮培养,无营养物或产物梯度;③可用简单显微镜观察微载体表面的生长情况;④细胞收获过程相对简单,劳动强度小;⑤培养基利用率高,占地面积小;⑥放大容易,国外已有公司以1000L规模培养人的二倍体细胞来生产β-干扰素。
但其缺点是搅拌桨及微珠间的碰撞易损伤细胞;接种密度高;微载体吸附力弱,不适合培养悬浮型细胞。
2.1.3 大孔微载体人们为了解决微载体培养系统中细胞易受机械损伤的缺陷以及能最大限度地扩大比表面积,开发了具有完全连通沟回的大孔微载体。
这一方法首先是在1985年由Verax公司开创的(Verax系列大孔加重胶原珠),其后出现了多种大孔微载体。
张孝兵等[9]将广泛使用的Verax流化床系统与常规传统大规模培养系统结果做了比较,发现Verax系统的细胞密度和体积产率比相应的常规培养高。
由于大孔微载体将细胞固定在孔内生长,因而与其他方法相比具有一系列优点:①比表面积大,是实心微载体的几倍甚至几十倍;②细胞在孔内生长,受到保护,剪切损伤小;③与包埋法相比,传质尤其是传氧效果好[10];④两种类型细胞都适用;⑤细胞三维生长,细胞密度是实心微载体的10倍以上,有的可达108个/mL[11];⑥适用于长期维持培养,例如Verax流化床培养系统能维持培养100多天,细胞生长情况依然良好;⑦微载体浓度高,实心载体在培养液中浓度增大到一定时,细胞密度反而下降;而大孔微载体在浓度较高时,表面碰撞增加,能促使细胞在孔内生长;⑧最适合于蛋白质生产和产物分泌。
因此有人预言,大孔微载体技术将成为动物细胞大规模培养的一种常用方式。
2.2 包埋将动物细胞包埋在各种多聚物多孔载体中而制成固定化动物细胞的方法称为包埋法。
此法步骤简便,条件温和,负荷量大,细胞泄露少。
因细胞嵌入在高聚物网格中而受到保护,细胞能抗机械剪切。
但该法也有一定缺点,如扩散限制,并非所有细胞都处于最佳营养物浓度。
包埋法一般适用于非锚地依赖型细胞的固定化。
多孔凝胶是最常用的载体,用于动物细胞固定化的凝胶主要有海藻酸钙、琼脂糖、血纤维蛋白等。
2.2.1 海藻酸钙凝胶海藻酸钙凝胶包埋法是将动物细胞与一定量的海藻酸钠溶液混合均匀,然后滴到一定浓度的氯化钙溶液中形成直径约1mm内含动物细胞的海藻酸钙胶珠,分离洗涤后即可用于培养。
此法操作时条件温和,对活细胞损伤小。
但固定后机械强度不高。
为了大量制备海藻酸钙凝胶包埋的固定化细胞,国外已有专门的振动喷嘴设备可供使用[12]。
2.2.2 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶可用二相法制得。
将含有细胞的琼脂糖溶液分散到一个水不溶相中(如石蜡油),形成直径0.2mm凝胶珠珠,移去石蜡油后,细胞即可进行培养。
同海藻钙一样,琼脂糖更适于培养悬浮细胞。
尽管凝胶珠形成过程很复杂,目前放大体积不超过20L。
但琼脂糖凝胶无毒性,具有较大的空隙,可以允许大分子物质自由扩散,因此该法特别适用于蛋白产物的连续生产。
Mosbach等曾用琼脂糖包埋杂交瘤细胞L S21和淋巴细胞MLA144生产单克隆抗体和白细胞介素[13]。
2.2.3 血纤维蛋白将动物细胞与血纤维蛋白原混合,然后加入凝血酶。
凝血酶将血纤维蛋白原转化为不溶性的血纤维蛋白,将动物细胞固定在其中。
血纤维蛋白可以促进细胞贴壁,因此两种类型的细胞都适于培养。
而且基质高度多孔,允许大分子物质的自由扩散。
但机械强度差,对剪切力很敏感。
2.3 中空纤维中空纤维细胞培养技术是模拟细胞在体内生长的三维状态,利用一种人工的“毛细管”即中空纤维给培养的细胞提供物质代谢条件而建立的一种体外培养系统。
自从1972年Knazek等[14]首次报道该技术后,陆续已有许多关于用中空纤维系统培养・755・ 第8期 石凯等:固定化动物细胞大规模培养技术研究进展 动物细胞的研究工作。
典型的封闭式中空纤维反应器循环系统[15]如图1所示。
系统的核心装置是中空纤维反应器,里面封装了一束中空纤维将整个反应器内腔分为毛细管外空间(extracapillary space ,ECS )和内腔空间(lumen space ,LS )。
培养细胞接种到ECS 中,培养液和氧气灌注到纤维管中,依靠蠕动泵的推动在系统中循环,并通过扩散作用从LS 提供给细胞[16]。
图1 封闭式中空纤维反应器循环系统示意图这种柱状反应器的不足之处是营养供应和细胞代谢产物存在浓度梯度,因而细胞分布不均,培养贴壁细胞时不能扩展成单层。
为此,Feder 等[17]开发出将纤维管束横放的平板式浅床中空纤维反应器(flat -bed hollow fiber bioreactor )。
将若干层浅床组合在一个反应器中,床层深度相当于3～6层纤维管,为使培养液分布均匀,在床层两端安装了2μm 微孔的分布器。
中空纤维培养技术的优点是无剪切、高传质、营养成分的选择性渗入,使培养细胞和产物密度都可达到比较高的水平。
缺点是膜的污染和堵塞,观察困难,细胞生长或过量气体产生会破坏纤维[18]。
中空纤维培养技术的发展趋势是让细胞在管束外空间生长,以达到更高的细胞培养密度。
目前中空纤维反应器已进入工业化生产,主要用于培养杂交瘤细胞来生产单克隆抗体,如Bioresponse 和Invitron 公司利用这种反应器生产单克隆抗体[19]。
2.4 微囊化微囊化培养技术是20世纪70年代由Lin 和Sun 创建的一种大规模培养技术[20]。
其要点是:在无菌条件下将拟培养的细胞、生物活性物质及生长介质共同包裹在薄的半透膜中形成微囊,再将微囊放入培养系统内进行培养。
生长介质为1.4%海藻酸钠溶液,半透膜由多聚赖氨酸形成。
培养系统可采用搅拌式或气升式反应器系统。
微囊工艺已生产出以克计的单克隆抗体[21]。
实验证明,采用批式和连续灌注式培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体,在7～27d 微囊内抗体浓度可达1250～5300mg/L [22]。
利用微囊包裹具有特定功能的组织细胞,形成免疫隔离的人工细胞,以此植入疾病动物或病人体内。
由于微囊里外来的组织细胞分泌分子量小于11×104ku (u =(116605402±010000010)×10-27kg )的激素和介质等物质,可补充疾病体内缺乏的生理活性物质,从而达到治疗疾病的目的,并且不引起免疫排斥现象。