北山楂和大果山楂的活性成分及其抗氧化与抗增殖活性研究

北山楂和大果山楂的活性成分及其抗氧化与抗增殖活性研究水果富含生物活性物质,日常饮食中适当增加水果的摄入可一定程度上降低各种慢性疾病发生的机率。北山楂(蔷薇科山楂属)是一种具有良好药用价值的水果,含有多种活性成分,是优良的健康食品原料。

大果山楂(蔷薇科苹果属)是我国南方的一种药食两用水果,也是重要的食品加工原料。本文综合比较了北山楂和大果山楂的活性物质组成、胞内抗氧化活性与抑制癌细胞增殖活性。

以抑制癌细胞增殖活性为导向,采用半制备液相色谱法对最优品种提取物进行分离纯化,鉴定了关键的活性物质成分,并采用蛋白印迹分析等生物学方法揭示了相关的作用机制。具体研究结果如下:比较了同时期采摘的北山楂(山楂、大金星和山里红)新鲜果肉的游离态和结合态多酚和黄酮含量,结果发现北山楂果肉的多酚和黄酮类化合物主要以游离态形式存在。

山里红提取物的总酚(58.43 mg GAE/g fruit,DW)和总黄酮含量(68.29 mg CE/g fruit,DW)显著高于其他两个品种。北山楂果肉中含有大量的原花青素类和三萜酸类化合物,其中原花青素B2和表儿茶素是最主要的原花青素化合物,而熊果酸是最主要的三萜酸类化合物。

北山楂提取物具有很强的抗氧化活性,其中山里红的氧自由基吸收能力(ORAC值901.1μmol TE/g DW)、过氧自由基清除能力(PSC值390.2μmol VCE/g DW)和胞内抗氧化活性(CAA值789.9和1185μmol of QE/100 g DW)均高于山楂和大金星品种。原花青素类化合物是北山楂果肉提取物清除自由基的主要活性物质。

比较了4个品种大果山楂的游离态和结合态多酚类化合物组成及其抗氧化

活性。实验结果表明大果山楂果肉的多酚和黄酮类化合物主要以游离态形式存在。

河源小果提取物的总酚含量最高(101.9 mg GAE/g fruit,DW),信宜山楂提取物的总黄酮含量最高(85.35 mg CE/g fruit,DW)。绿原酸、根皮素-2’-木糖苷、根皮苷和熊果酸是游离态提取物的主要化学成分:其中荔浦梨木山品种的绿原酸的含量最高(1841 mg/100g fruit,DW);根皮素-2’-木糖苷和根皮苷主要存在于信宜山楂品种(2206和635.7 mg/100g fruit,DW);河源小果品种中熊果酸的含量最高(495.6 mg/100g fruit,DW)。

大果山楂提取物均具有很好的抗氧化活性,其中信宜山楂游离态提取物的胞内抗氧化活性(CAA值为1097和1832μmol of QE/100 g DW)显著高于其他三个品种。在ORAC分析中,绿原酸和根皮素糖苷类化合物是大果山楂提取物的主要抗氧化活性成分;在CAA分析中,大果山楂的胞内抗氧化活性主要来自槲皮素、木樨草素、绿原酸和熊果酸。

信宜山楂游离态提取物能够明显减少ABAP诱导HepG2细胞产生的氧化应激,其可能机制为:清除胞内自由基;提高细胞内SOD、GSH-Px和CAT等抗氧化酶活性,降低细胞内ROS水平。综合比较大果山楂和北山楂的总酚含量,结果发现大果山楂的总酚含量(70.7~101.9mg GAE/g fruit,DW)显著高于北山楂(48.68~58.43 mg GAE/g fruit,DW)。

大果山楂和北山楂均含有绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、表儿茶素、熊果酸、齐墩果酸、山楂酸和科罗索酸,这些相同的成分可能是大果山楂和北山楂具有相同功效的主要原因。综合比较大果山楂和北山楂的抗氧化活性,发现北山楂游离态提取物的ORAC值均显著高于大果山楂提取物;山里红提取物的PSC值显著高于大果山楂提取物;而信宜山楂和河源大果游离态提取物的CAA值均显著高于北山

楂的提取物(包括PBS wash处理和no PBS wash处理)。

北山楂和大果山楂游离态提取物均能显著抑制人肝癌细胞(HepG2)、人乳腺癌细胞(MCF-7和MDA-MB-231)和人宫颈癌细胞(Siha)的增殖,其中北山楂和大果山楂中抗增殖活性最好的提取物分别来自山里红和信宜山楂游离态提取物。以活性为导向,分别采用半制备液相色谱纯化鉴定山里红和信宜山楂游离态提取物中的主要抗增殖活性成分。

结果表明富含三萜酸的组分S9(山里红)和组分X10(信宜山楂)的抗增殖活性均显著高于其他组分。因此,三萜酸类化合物是北山楂和大果山楂的抑制癌细胞增殖的主要活性成分。

组分S9和X10能显著上调癌细胞中p21,下调PCNA、CDK4和CyclinD1蛋白的表达,调节细胞周期,抑制癌细胞增殖。组分S9和X10均能显著诱导癌细胞凋亡,并呈剂量依赖性。

其可能的凋亡机制是通过激活癌细胞中caspase-9和caspase-8,进而激活caspase-3,通过细胞内线粒体途径和表面死亡受体途径诱导凋亡。鉴定了山里红组分S9和信宜山楂X10中的主要抗肿瘤活性成分为熊果酸。

综合探讨不同浓度(无毒性浓度范围内)熊果酸作用不同时间对MDA-MB-231细胞周期和凋亡相关蛋白的影响。结果表明熊果酸通过上调p21蛋白表达,下调CDK4、Cyclin D1和PCNA的蛋白表达,调节细胞周期,抑制癌细胞增殖;熊果酸可通过上调Bax和下调Bcl-2的表达水平,增加Bax/Bcl-2的比值,激活caspase-9和caspase-3,诱导癌细胞凋亡。

熊果酸调节细胞周期和诱导凋亡均具有剂量和时间依赖性。有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路与细胞周期和凋亡密切相关。

结果表明,熊果酸可下调细胞中TNF受体相关因子2(TRAF2)蛋白表达,上调p-p53、p-p38 MAPK、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)、c-Jun以及磷酸化凋亡信号调节激酶(p-ASK1)蛋白表达。采用p38 MAPK和JNK特异性抑制剂分别作用细胞,结果显示熊果酸可通过激活p38 MAPK和JNK通路抑制乳腺癌细胞

MDA-MB-231增殖。

以上结果表明,熊果酸可通过调节p38MAPK和JNK信号通路,激活p53,进而调节细胞周期,诱导细胞凋亡。