实验八 丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用
实验2 琥珀酸脱氢酶的作用及竞争性抑制的观察
实验2 琥珀酸脱氢酶的作用及竞争性抑制的观察（一）原理琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环中的一个重要的酶，测定细胞中有无这种酶可以初步鉴定三羧酸循环途径是否存在。
琥珀酸脱氢酶可使其底物脱氢，产生的氢可通过一系列传递体最后递给氧而生成水。
在缺氧的情况下，若有适当的受氢体也可显示出脱氢酶的作用。
如心肌中的琥珀酸脱氢酶在缺氧的情况下，可使琥珀酸脱氢生成延胡索酸，脱下之氢可将蓝色的甲烯蓝还原成无色的甲烯白。
这样，便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用。
琥珀酸+ 甲烯蓝琥珀酸脱氢酶延胡索酸+ 甲烯白无氧条件丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它能与琥珀酸竞争而和琥珀酸脱氢酶结合。
若琥珀酸脱氢酶已与丙二酸结合，则不能再催化琥珀酸脱氢，这种现象称为竞争性抑制。
如相对地增加琥珀酸的浓度，则可减轻丙二酸的抑制作用。
（二）试剂1．1.5%琥珀酸钠溶液：称取琥珀酸钠1.5g，用蒸馏水溶解并稀释至100ml。
如无琥珀酸钠可用琥珀酸配成水溶液后，以氢氧化钠溶液中和至pH7~8。
2．1%丙二酸钠溶液：称取丙二酸钠1g，用蒸馏水溶解并稀释至100ml。
3．0.02%甲烯蓝溶液。
4．1/15mol/LNa2HPO4溶液：取Na2HPO4 · 2H2O 11.8g，用蒸馏水溶解并稀释至1 000ml。
5．液体石蜡。
（三）操作1．猪心脏制备液：称取新鲜猪心1.5~2.0g放组织捣碎机中，加入等体积的石英砂及1/15mol/LNa2HPO4溶液3~4ml，捣碎成浆，再加入6~7ml1/15mol/LNa2HPO4溶液，放置1小时，不时摇动，离心取上清液备用。
2．取4支试管，编号并按下表操作：试管心脏制备液 1.5%琥珀酸钠溶液1%丙二酸钠溶液蒸馏水0.02%甲烯蓝溶液（滴）（滴）（滴）（滴）（滴）1 5 5 －10 22 5 5 －10 2（先煮沸）3 5 5 5 5 24 5 10 5 5 23．各管溶液混匀后，每管各加液体石蜡一薄层（约5~10滴）。
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制[原理]肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶，能催化琥珀酸脱氢转变成延胡索酸。
反应中生成的FADH2可使蓝色的甲烯蓝还原为无色的甲烯白(还原型甲烯蓝)。
丙二酸与琥珀酸的分子结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂，故能与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶的活性中心。
丙二酸与琥珀酸脱氢酶结合后，酶活性受到抑制，则不能再催化琥珀酸的脱氢反应。
抑制程度的大小，随抑制剂与底物两者浓度的比例而定。
本实验以甲烯蓝为受氢体，在隔绝空气的条件下，通过甲烯蓝的褪色程度来判断琥珀酸脱氢酶的活性，并籍此观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶活性的抑制作用。
CH2COOHCH2 COOH FAD MB•2H（甲烯白）琥珀酸琥珀酸脱氢酶CHCOOHHOOCCH FADH2MB（甲烯蓝）延胡索酸[试剂]1．0.2mol/L琥珀酸: 取琥珀酸钠(MW:270.14)27克加水至500ml。
2．0.02mol/L琥珀酸: 取1液稀释10倍。
3．0.2mol/L丙二酸: 取丙二酸钠(MW:166.05)16.7克加水至500ml。
4．0.02mol/L丙二酸: 取3液稀释10倍。
5．1/15mol/L pH7.4磷酸盐缓冲: 1/15mol/LNa2HPO4溶液80.8ml与1/15mol/LKH2PO419.2ml 混合即成。
（1）1/15mol/LNa2HPO4溶液: 取Na2HPO4.12H2O （MW：358.14）23.876 克, 加水至1000ml。
（2）1/15mol/LKH2PO4溶液:取KH2PO4（MW：136.09）1.814克,加水至200ml.6．0.02％甲烯蓝溶液7．液体石蜡[主要器材]1．新鲜猪心2．玻璃研钵3．漏斗4．手术剪5．棉花6．恒温水浴箱[操作步骤]1．心肌提取液的制备取新鲜猪心约6g，用蒸馏水清洗后剪成碎块，置于研钵中，加入适量净沙，研磨成糜状。
再加1/15mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液12ml，研成糊状，用棉花过滤，滤液即为猪心提取液。
2011-10-10竞争性抑制
反应前
反应后
摇动后
3. 实验记录和结果分析
试管编号 1 2
1:10
3
1:1
4
10.1
5
-
6
-
[I]/[S] 褪色时间
0:1
分析实验结果！ 分析实验结果！
四、分析
1、酶提取液中有没有琥珀酸脱氢酶活性？ 酶提取液中有没有琥珀酸脱氢酶活性？ 2、各管的褪色情况有何区别？为什么？ 各管的褪色情况有何区别？为什么？ 3、丙二酸对琥珀酸脱氢酶抑制作用的类型 及其特点是什么？如何证明的？ 及其特点是什么？如何证明的？ 4、本实验5、6号试管的作用是什么？ 本实验5 号试管的作用是什么？
五、注意事项
加试剂时看清底物与抑制剂的浓度 加试剂时看清底物与抑制剂的浓度。 看清底物与抑制剂的浓度。 随时观察记录各管褪色时间。 随时观察记录各管褪色时间。 各管褪色时间 37℃水浴保温过程中不能振摇试管， 37℃水浴保温过程中不能振摇试管，避 水浴保温过程中不能振摇试管 免甲烯白重新氧化变蓝。 免甲烯白重新氧化变蓝。 实验结束后一定洗净试管内的液体石蜡 实验结束后一定洗净试管内的液体石蜡
三、实验材料与仪器
1. 动物：大白鼠 动物： 2. 材料：匀浆器或玻璃研钵、恒温水浴箱 材料：匀浆器或玻璃研钵、 3.试剂： 0.2mol/L琥珀酸溶液 3.试剂 0.2mol/L琥珀酸溶液 试剂： 0.02mol/L琥珀酸溶液 0.02mol/L琥珀酸溶液 0.2mol/L丙二酸溶液 0.2mol/L丙二酸溶液 0.02mol/L丙二酸溶液 0.02mol/L丙二酸溶液 1/15mol/L磷酸缓冲液 pH7.4） 1/15mol/L磷酸缓冲液（pH7.4） 磷酸缓冲液（ 0.02%甲烯蓝 0.02%甲烯蓝 液体石蜡
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
实验三琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
一实验目的
了解琥珀酸脱氢酶的作用及酶促反应中竞争抑制。
二实验原理
肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶，能催化琥珀酸脱氢氧化生成延胡索酸，脱下的一对氢原子由FAD接受，生成FADH2。
本实验在无氧条件下采用甲烯蓝为受氢体（蓝色），接受FADH2传递的氢原子，使甲烯蓝受氢还原成甲烯白（无色），以指示酶的活性。
丙二酸与琥珀酸的结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。
在该酶促反应中设置不同含量的底物，并加入等量的丙二酸，观察甲烯蓝颜色消退的速度，判断琥珀酸脱氢酶的活性及丙二酸对酶活性的抑制程度。
三药品器材试管、滴管、高速组织捣碎机、恒温水浴箱、组织等。
1.0.1mol/L磷酸盐缓冲液（Ph7.4）取0.1mol/L磷酸氢二钠溶液81ml和0.1mol/L
磷酸二氢钠19ml混合即成。
2. 1.5％琥珀酸钠溶液。
3.1％丙二酸钠溶液。
4.0.02％甲烯蓝溶液。
5.液体石蜡。
6.肌肉匀浆取新鲜的动物肌肉组织适量，用组织剪将其剪碎，加入pH
7.4磷酸盐
缓冲液，置于高速组织捣碎机中加工成约20％的肌匀浆。
四实验方法取四支试管，编号，按下表操作：
中保温，在15～20分钟内观察各管各管的颜色变化，做好记录。
五思考题
1结合本实验说明竞争性抑制的特点。
2结合实验原理说明各管颜色变化的原因。
实验5 琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
生物化学实验之－－
实验五 琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
山东师范大学生命科学学院
【实验目的】
了解丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制 作用。
【实验原理】
由于丙二酸与琥珀酸结构相似，可以竞争性 地抑制琥珀酸脱氢酶对于琥珀酸的脱氢作用。 在生物体内，肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶， 能催化琥珀酸脱氢转变成延胡索酸，同时放出大 量能量供肌体利用。
【思考题】
1. 为什么酶液的提取要在冰浴中进行？ 2. 各管中美蓝的褪色情况有何不同？为什么？
氧化型（蓝色）
【器材与试剂】
（一）器材 1. 恒温水浴锅 3. 研钵 5. 试管架 7. 漏斗 9. 脱脂棉 2. 手术剪 4. 试管 6. 刻度吸管 8. 小白鼠的肌肉 10. 吸水纸
（二）试剂 1. 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4） 2. 0.02mol/L丙二酸钠溶液 3. 0.02mol/L琥珀酸钠溶液 4. 0.01%美蓝溶液 5. 生理盐水 6. 液体石蜡
—
1 2 5
1
— 2 5
—
1 2 5
3. 将各试管摇匀，倾斜试管，沿管壁滴加 液体石蜡5滴，盖在液面，以隔绝空气。置于 370C水浴中保温，随时观察各管中美蓝的褪色 情况，并记录时间，解释结果。
【要点提示】
1. 提取酶液需在冰浴中进行，以防酶失活。 2. 实验过程中，需快速加入试剂，摇匀后迅 速加入液体石蜡。 3. 加液体石蜡的目的是为了使反应液与空气 隔绝，因此加液体石蜡时需斜执试管，沿管壁 加入，不要产生气泡。 4. 加完液体石蜡后，在观察结果的过程中， 不要摇动试管，以免溶液与空气接触而使美蓝 重新氧化变蓝。
琥珀酸脱氢酶作用及竞争抑制的观察
1.琥珀酸脱氢酶作用及竞争抑制的观察2.紫外分光法测定核酸含量本实验分组为15组，如果为16组，相应材料要增加。
需要的试剂配制方法注意事项1.5%琥珀酸钠溶液7.5g琥珀酸钠→500ml→15小瓶没有琥珀酸钠则用琥珀酸代替后用NaOH调和至PH7.01%丙二酸钠5g丙二酸钠→500ml→15小瓶没有丙二酸钠则用丙二酸代替后用NaOH调和至PH7.00.02%甲稀蓝0.1g甲稀蓝→500ml→15小瓶（棕色瓶）甲稀蓝别名亚甲酰蓝1/15mol/L Na2HPO4 23.6g Na2HPO4 →2000ml→15大瓶石蜡油可以不用分装每个房间在水浴锅前放1个核酸称一定量的小牛胸腺DNA融入0.1%的NaOH5-50ug/mL浓度羊的心脏切碎成小块大约2g左右提前购买，将皮、脂肪处理掉分割后放在冰箱里石英砂均匀的撒在上面注：每三个人一组，分为15组。
如果人数多可以适当多分几瓶试剂。
所需仪器所需数量40ml试剂瓶4560ml试剂瓶15试管4x152x15 共90个移液管（优先10ml的本次用5ml移液管）15研钵15种类数量心脏提取液151.5%琥珀酸钠151%丙二酸钠150.02%甲稀蓝15蒸馏水15液体石蜡 2胶头滴管共77个紫外吸收法测定核酸含量1、实验目的：1.掌握紫外吸收法测定核酸含量的原理2.掌握利用紫外线分光度计测定核酸含量二、实验原理：DNA和RNA都有吸收紫外线的性质，最大吸收峰在260nm波长处紫外线吸收是嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（－C＝C一C＝C 一），能够强烈吸收250~280nm 波长的紫外光。
等书上112页三、实验试剂与器材DNA样品紫外分光光度计四、实验步骤1.取DNA样品5ml，于紫外分光光度计上测定260nm与280nm处的OD值按下式按下式计算核酸浓度计算核酸浓度 DNA的质量浓度(mg/l)=OD260nm/0.020xL x稀释倍数计算核酸纯度=OD260nm/OD280nm2.取DNA样品5ml，沸水浴中加热5min于紫外分光光度计上，测260nm处的OD值比较DNA前后吸光度OD的差异。
探究“琥珀酸脱氢酶的作用及其抑制”实验操作过程的再设计
［］ ２ 查锡 良， 周春燕． ０ ８ 生物化学 （ ７版 ） 北京 ： 民卫生 出版 ２０． 第 ． 人
社
［］ ３ 贾弘裎． ０５ 生物化学． ２０ ． 北京 ： 人民卫生出版社 ， ９ １ ８ ［］ ４ 杨光彩 ， 肖应庆 ， 方振伟．０ １ 生物化学 实验指导． ２０ ． 广州 ： 华南 理
工 大 学 出 版 社 ，６ ９
室外拿小盆盛 雪 以备用 ， 避免 了 因冰块 和试 管接 触面
积减少所造成 对酶 活性 的影 响 ， 这样 不 但能 提高 学生 对 实验操作 的兴趣 ， 而且增 强他们的求 知欲 ； 实验时 ④ 取心、 、 肝 骨骼肌 由原来 的 ５ 减少到 ３ ， ｇ ｇ制备 的酶液足
一
丙 二酸是琥珀酸脱 氢酶 的竞 争性 抑制 剂 ， 如果有 丙 二酸存在时 ， 酶 的活 性受 到抑 制 。丙 二酸 与琥 珀 此
酸 脱氢酶 的亲和力 远大 于琥 珀酸本 身 对它 的亲和 力 ，
因此 抑制作 用很 强 ｌ 。心 肌 、 、 骼肌 等 组织 细胞 － ５ Ｊ 肝 骨
中的琥 珀酸脱 氢酶 ， 能催化琥 珀酸脱氢 生成延胡索 酸 ， 脱 下的 ２ Ｈ由辅基 Ｆ Ｄ接受还 原成 Ｆ Ｄ ２ 然后依 次 Ａ ＡＨ ， 通 过泛醌 、 细胞 色 素体 系将 ２ 传 递 给 氧生 成 水 ［］ Ｈ ６。 实验 中用 甲烯蓝 （ Ｂ 为受 氢体 。在 隔绝 空 气 的条 Ｍ ） 件下脱下 的氢被蓝色的 甲烯蓝 接受 还原成无色 的 甲烯
用［ 。 引
３ 结 果 与 分 析
１ 号管在 ３ ℃恒温 时颜 色消 退最 快 ， 明酶 的活 ７ 说 性最强 ； ５号管 同样在 ３ ￣恒 温但加 的是煮沸后 的酶 ， ７Ｃ 颜 色不变 ， 说明酶没有 活性 ； ２号管 由于含 有丙二 酸抑 制剂 ， 以褪色 比 １ 管慢 ； 所 号 ３号管 由于没有加 入琥 珀 酸脱氢酶 ， 颜色不变 ； 管褪色速度 介 于 １ 和 ２号 ４号 号 管之间 ， 为反应液 中含有丙二酸抑制 剂 ， 并且 在抑制 剂浓度相 同的条件 下 ， 管底 物 浓度 比 ２号 管 增 大 ４号
实验十 琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
实验十琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制一、实验目的1、掌握竞争性抑制概念及作用机理。
2、了解在无氧情况下观察脱氢酶作用的简单方法。
二、实验原理存在于心肌、骨骼肌、肝脏等组织中琥珀酸脱氨酸，能使琥珀酸脱氢而成延胡索酸，脱下氢可使甲烯蓝退色，还原为甲稀白。
反应如下：草酸、丙二酸等在结构上与琥珀酸相似，可与琥珀酸竞争与琥珀酸脱氢酸的活性中心结合。
若酶已与丙二酸等结合，则不能再与琥珀酸结合而使之脱氢，产生抑制作用，且抑制程度取决于琥珀酸与抑制剂在反应体系中浓度的相对比例，所以这种抑制是竞争性抑制。
本实验通过观察在由不同浓度的琥珀酸与丙二酸组成的反应体系中使等量甲稀蓝退色反应时间，从而验证丙二酸对琥珀酸的竞争性抑制作用。
这样，便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用。
三、实验仪器、材料和试剂1、仪器：恒温水浴锅，研钵或组织匀浆机2、材料和试剂（1）新鲜兔肝（2）0.10mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）：0.1mol/L NaH2PO4 19 ml 加0.1mol/L Na2HPO4 81ml。
（3）0.093 mol/L琥珀酸钠溶液：取琥珀酸钠1.5g溶于100 ml蒸馏水中。
（4）0.10 mol/L丙二酸钠溶液：取丙二酸钠1.5g溶于100 ml蒸馏水中。
（5）0.02%甲稀蓝溶液。
（6）液体石蜡。
四、实验操作新鲜兔肝立即剪碎，放于组织匀浆机中研碎，加入pH7.4的0.10 mol/L磷酸盐缓冲液，制备成200 g/L的肝匀浆液备用。
取五支试管分别编号，按下表配制反应体系：将各管溶液混匀后加一薄层液体石蜡后静置（此时不可摇动!），观察各管中的颜色变化，并记录各管颜色完全变化的时间。
思考题:1、抑制的分类及其特点？2、本实验中液体石蜡起什么作用? 本实验需在无氧条件下进行,可加一层液体石蜡以隔绝空气。
3、各管中的反应体系配好后为什么不能再摇动?4、制备肝浆时用磷酸缓冲液，可否换用蒸馏水，为什么？。
实验十六、丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用
实验十六:丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用【实验名称】：丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用09救援一班第三大组李岚宇2009222336室温：25℃（一）实验目的：1、学习和掌握竞争性抑制作用的特点。
2、观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用。
（二）实验原理：化学结构与酶作用的底物结构相似的物质，可与底物竞争结合酶的活性中心，使酶的活性降低甚至丧失，这种抑制作用称为竞争性抑制作用。
琥珀酸脱氢酶是机体内参与三羧酸循环的一种重要的脱氢酶，其辅基为FAD，如心肌中的琥珀酸脱氢酶在缺氧的情况下，可使琥珀酸脱氢生成延胡索酸，脱下之氢可将蓝色的甲烯蓝还原成无色的甲烯白。
这样，便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用。
丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它能与琥珀酸竞争而和琥珀酸脱氢酶结合。
若琥珀酸脱氢酶已与丙二酸结合，则不能再催化琥珀酸脱氢，这种现象称为竞争性抑制。
如相对地增加琥珀酸的浓度，则可减轻丙二酸的抑制作用。
（三）实验材料与仪器：1器材大白鼠、手术剪、镊子、磁盘、匀浆器、量筒、烧杯、纱布、滤纸、试管及试管架、恒温水箱、电热水浴锅2试剂0.2mol/L琥珀酸溶液、0.02mol/L琥珀酸溶液、0.2mol/L丙二酸溶液、0.02mol/L 丙二酸溶液、1/15mol/L磷酸缓冲液、0.02％甲烯蓝、液体石蜡。
（四）实验步骤:1、酶提取液的制备：去大白鼠的肝脏、心脏、肾脏，用冷水洗3次，加入1/15mol/L磷酸缓冲液pH 在7.4。
在匀浆器中进行匀浆，然后用纱布过滤，用干净的烧杯收集过滤的备用。
2、取试管6支，编号，在按图步骤操作，酶提取液（ml）磷酸缓冲液（ml）0.2mol/L琥珀酸（滴）0.02mol/L琥珀酸（滴）0.2mol/L丙二酸溶液（滴）0.02mol/L丙二酸溶液（滴）蒸馏水（滴）甲烯蓝（滴）褪色时间（分钟）试管1 2 - 8 - - - 8 3 3分33秒试管2 2 - 8 - - 8 - 3 5分30秒试管3 2 - 8 - 8 - - 3 6分04秒试管4 2 - - 8 8 - - 3 7分28秒试管5 - 2 8 - - - 8 3 无限大试管6 2 - 8 - - - 8 3 无限大试管6，在酶提取液先在100℃的水浴加热煮沸5min。
琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制报告
琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
一、实验原理
在化学结构上与底物类似的抑制剂，能与底物竞争酶分子的活性中心，从而抑制酶的活性。
抑制程度随抑制剂浓度的改变而改变。
如果底物浓度不变，酶活性的抑制程度随抑制剂浓度的增加而增加。
反之，如抑制剂浓度不变，则酶活性随底物浓度增加而逐渐回复，这种类型的抑制称竞争性抑制。
琥珀酸脱氢酶是一种含铁的黄酶，它可以催化琥珀酸脱氢酶，生成延胡索酸，在有氧的情况下，脱下的氢经呼吸链的传递，与氧化合成水。
肝中含有丰富的琥珀酸脱氢酶，体外实验在隔绝空气的情况下，琥珀酸脱下的氢可被人工受氢体一甲烯蓝接受还原成甲烯白。
因此我们可以用甲烯蓝被还原褪色的速度和程度，来了解不同底物浓度，不同抑制剂浓度时酶活性的改变。
二、实验步骤与结果
2.将上述各试管摇匀，于夜面上加液体石蜡10滴，放37℃水浴中保温，随时比较，观察
各试管颜色变化。
3.结果
经观察，各个试管的褪色时间顺序为：1>4>2>3
三、结论
底物浓度、抑制剂浓度影响了酶的竞争性。
实验五琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
实验五琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制【实验目的】1、掌握竞争性抑制概念及作用机理。
2、了解在无氧情况下观察脱氢酶作用的简单方法。
【实验原理】存在于心肌、骨骼肌、肝脏等组织中琥珀酸脱氨酸，能使琥珀酸脱氢而成延胡索酸，脱下氢可使甲烯蓝退色，还原为甲稀白。
反应如下：草酸、丙二酸等在结构上与琥珀酸相似，可与琥珀酸竞争与琥珀酸脱氢酸的活性中心结合。
若酶已与丙二酸等结合，则不能再与琥珀酸结合而使之脱氢，产生抑制作用，且抑制程度取决于琥珀酸与抑制剂在反应体系中浓度的相对比例，所以这种抑制是竞争性抑制。
本实验通过观察在由不同浓度的琥珀酸与丙二酸组成的反应体系中使等量甲稀蓝退色反应时间，从而验证丙二酸对琥珀酸的竞争性抑制作用。
【实验用品】1、试剂（1）0.10mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）:0.1mol/L NaH2PO419ml 加0.1mol/LNa2HPO481ml。
（2）0.093mol/L琥珀酸钠溶液：取琥珀酸钠1.5g溶于100ml蒸馏水中。
（3）0.10mol/L丙二酸钠溶液：取丙二酸钠1.5g溶于100ml蒸馏水中。
（4）0.02%甲稀蓝溶液。
（5）液体石蜡。
2、器具（1）0.10mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）：0.1mol/L NaH2PO419ml加0.1mol/LNa2HPO481ml。
（2）0.93mol/L琥珀酸钠溶液：取琥珀酸钠1.5g溶于100ml蒸馏水中。
（3）0.10mol/L丙二酸钠溶液：取丙二酸钠1.5g溶于100ml蒸馏水中。
（4）0.02%甲烯蓝溶液。
（5）液体石蜡。
2、器具（1）恒温水浴箱（2）研钵或组织匀浆机【实验操作】新鲜免肝立即剪碎，放于组织匀浆机中研碎，加入pH7.4的0.10mol/L磷酸盐缓冲液，制备成200g/L的肝匀将各管溶液混匀后加一薄层液体石蜡后静置（此时不可摇动!），观察各管中的颜色变化，并记录各管颜色完全变化的时间。
【思考题】1、抑制的分类及其特点？2、本实验中液体石蜡起什么作用?3、各管中的反应体系配好后为什么不能再摇动?4、制备肝浆时用磷酸缓冲液，可否换用蒸馏水，为什么？。
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
三、实验步骤：
标准管法测定酶活性：
1、取干燥试管4支，标号 测定管 对照管 标准管 空白管
2、依次加入试剂，混匀，37℃保温 3、呈色反应后，520nm比色测OD值
P77页
四、结果：
谷丙转氨酶活性单位/mL鼠肝匀浆=
五、注意事项：
1 、保温温度和时间要精确，即谷丙转氨酶发挥 催化作用环境要一致。
2. 试剂滴加时，看清剂量，滴加液体石蜡时沿 着管壁倾斜加入。
3. 观察结果时不能振摇试管！避免甲烯白重新 氧化变蓝。
（Page 76） 实 验
二十二
改良Mohum法测定
鼠肝谷-丙转氨酶活性
一、实验目的
了解谷－丙转氨酶活性测定 的原理及测定方法。
二、实验原理：
丙氨酸+α-酮戊二酸
GPT
谷氨酸+丙酮酸 2、4-二硝基苯肼
4、本实验以甲烯蓝为受氢体，在隔离空气条件下，以甲烯 蓝褪色程度来观察、判断丙二酸对琥珀酸脱氢酶活性的抑制 作用。
三、操作步骤：
1、酶提取液的制备
1g 兔肌肉(剪碎)＋海砂少许 +2mL 1/15 mol /L磷酸盐缓冲液（研磨成糊状）,然后再分 两次加10mL 1/15 mol /L磷酸盐缓冲液(混匀)。
2 、掌握概念：酶活性单位 3、 微量移液器的使用
分光光度计的使用
1、打开分光光度计，预热20-30min。 2、调节旋钮至需要的光波长。 3、检查拉杆是否在分光光度计的休息状态。
T档 拉杆0档
调T100% ： 空白管
T档 拉杆1档
调T 0% ：
A档 拉杆2、3、4档 测吸光度： 标准管，测定管
休息状态：拉杆1档
竞争性抑制作用
抑制程度 取决于抑制剂 和底物对酶的 相对亲和力以 及抑制剂和底 物浓度比。
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
实验五琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制【实验目的】1、掌握竞争性抑制概念及作用机理。
2、了解在无氧情况下观察脱氢酶作用的简单方法。
【实验原理】存在于心肌、骨骼肌、肝脏等组织中琥珀酸脱氨酸，能使琥珀酸脱氢而成延胡索酸，脱下氢可使甲烯蓝退色，还原为甲稀白。
反应如下：草酸、丙二酸等在结构上与琥珀酸相似，可与琥珀酸竞争与琥珀酸脱氢酸的活性中心结合。
若酶已与丙二酸等结合，则不能再与琥珀酸结合而使之脱氢，产生抑制作用，且抑制程度取决于琥珀酸与抑制剂在反应体系中浓度的相对比例，所以这种抑制是竞争性抑制。
本实验通过观察在由不同浓度的琥珀酸与丙二酸组成的反应体系中使等量甲稀蓝退色反应时间，从而验证丙二酸对琥珀酸的竞争性抑制作用。
【实验用品】1、试剂（1）0.10mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）:0.1mol/L NaH2PO419ml 加 0.1mol/LNa2HPO481ml。
（2）0.093mol/L琥珀酸钠溶液：取琥珀酸钠1.5g溶于100ml蒸馏水中。
（3）0.10mol/L丙二酸钠溶液：取丙二酸钠1.5g溶于100ml蒸馏水中。
（4）0.02%甲稀蓝溶液。
（5）液体石蜡。
2、器具（1）0.10mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）：0.1mol/L NaH2PO419ml加0.1mol/LNa2HPO481ml。
（2）0.93mol/L琥珀酸钠溶液：取琥珀酸钠1.5g溶于100ml蒸馏水中。
（3）0.10mol/L丙二酸钠溶液：取丙二酸钠1.5g溶于100ml蒸馏水中。
（4）0.02%甲烯蓝溶液。
（5）液体石蜡。
2、器具（1）恒温水浴箱（2）研钵或组织匀浆机【实验操作】新鲜免肝立即剪碎，放于组织匀浆机中研碎，加入pH7.4的0.10mol/L磷酸盐缓冲液，1—1ml2ml1ml3滴2 1.5ml0.5ml1ml1ml3滴31ml1ml2ml—3滴42ml—1ml1ml3滴51ml1ml1ml1ml3滴将各管溶液混匀后加一薄层液体石蜡后静置（此时不可摇动!），观察各管中的颜色变化，并记录各管颜色完全变化的时间。
酶的竞争性抑制作用 共21页
琥 珀 酸
亚 甲 蓝 （ 蓝 色 ）
COOH
CH
+
CH
COOH
MB2H
延 胡 索 酸 还 原 性 亚 甲 蓝 （ 无 色 ）
丙二酸与琥珀酸分子结构相似，能竞争 性抑制琥珀酸脱氢酶。通过观察在由不 同浓度的琥珀酸与丙二酸组成的反应体 系中使等量亚甲蓝退色的程度，从而鉴 定丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用和 抑制程度。
五、实验方法
1、匀浆液的制备 新鲜家兔肝脏洗净表面血液，剪去筋膜，称重。
按20%的浓度加入pH 7.4的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液， 放于组织捣碎机中充分捣碎，过滤备用。 2、按表操作 配制琥珀酸脱氢酶的催化作用及其可逆性抑制反 应体系
试剂（滴）
1.5%ห้องสมุดไป่ตู้
1%
蒸馏水 肝匀浆液 0.02%
管号
琥珀酸钠 丙二酸钠
亚甲蓝
1
10
—
20
10
10
2
10
10
10
10
10
3
10
10
20
—
10
4
20
10
—
10
10
将各管混匀，加少量液体石蜡封盖液面，隔绝空气。然后把 各管置于37℃水浴箱中保温10-15分钟，随时观察各管的颜 色变化并记录结果。
管号
1234
七、注意事项
1、加试剂前一定要将试管清洗干净 2、加入液体石蜡后就不要再摇动试管。避免 空气中的氧接触反应溶液，使得还原型的甲 烯白重新氧化成蓝色 3、37℃水浴保温过程中，要注意随时观察各 试管的褪色情况
六、实验结果
管号
1234
实验三-丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用
实验三-丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用引言：琥珀酸脱氢酶（SDH）是一种重要的蛋白质，其在三羧酸循环中起着关键的作用。
SDH 能够催化琥珀酸脱氢反应，将琥珀酸氧化为富含能量的丙酮酸。
在人体中，SDH的异常通常会导致疾病的发生，如甲状腺疾病、糖尿病、肝脏疾病等。
因此，SDH的调节和控制是非常重要的。
在本实验中，我们将研究丙二酸对SDH的竞争性抑制作用，以期了解其在细胞代谢中的作用。
实验目的：2、了解SDH在细胞代谢中的作用。
实验原理：SDH是一种酸性蛋白质，其催化反应式为：琥珀酸+辅酶Q+OH-→丙酮酸+辅酶QH2。
SDH活性的测定一般采用酶联免疫吸附法（ELISA）。
在实验前，需要将SDH标准品稀释至一定浓度。
然后，将SDH标准品加入到孔板中，与不同浓度的丙二酸预先混合，测定SDH 的活性。
根据SDH催化反应的特点和丙二酸的特异性竞争性抑制作用，可确定丙二酸的浓度和SDH的活性之间的关系。
实验步骤：1、将SDH标准品稀释至一定浓度，取适量的SDH标准品分别加入到不同的孔板中。
2、根据实验需求，添加不同浓度的丙二酸到不同孔板中，混合均匀。
3、放置孔板至37℃恒温箱内，反应30分钟。
4、加入反应液至各个孔位中，搅拌均匀。
5、测定不同孔板的OD值。
6、据此根据SDH活性的公式，计算SDH活性值。
7、根据SDH活性值和丙二酸的浓度，确定丙二酸浓度与SDH活性之间的关系。
实验结果：见附件1。
讨论：通过实验，我们发现丙二酸对SDH的竞争性抑制作用比较显著。
丙二酸的浓度与SDH 的活性呈明显的负相关关系。
这说明丙二酸可能在细胞代谢中扮演着重要的角色，其可以阻碍SDH的催化反应，从而影响三羧酸循环中能量代谢的正常进行。
本实验结果表明，丙二酸具有竞争性抑制SDH的能力，说明丙二酸在细胞代谢中的作用非常重要。
这为进一步探讨丙二酸在细胞代谢中的作用提供了有价值的参考和思路。
实验十 琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
实验十琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制一、实验目的1、掌握竞争性抑制概念及作用机理。
2、了解在无氧情况下观察脱氢酶作用的简单方法。
二、实验原理存在于心肌、骨骼肌、肝脏等组织中琥珀酸脱氨酸，能使琥珀酸脱氢而成延胡索酸，脱下氢可使甲烯蓝退色，还原为甲稀白。
反应如下：草酸、丙二酸等在结构上与琥珀酸相似，可与琥珀酸竞争与琥珀酸脱氢酸的活性中心结合。
若酶已与丙二酸等结合，则不能再与琥珀酸结合而使之脱氢，产生抑制作用，且抑制程度取决于琥珀酸与抑制剂在反应体系中浓度的相对比例，所以这种抑制是竞争性抑制。
本实验通过观察在由不同浓度的琥珀酸与丙二酸组成的反应体系中使等量甲稀蓝退色反应时间，从而验证丙二酸对琥珀酸的竞争性抑制作用。
这样，便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用。
三、实验仪器、材料和试剂1、仪器：恒温水浴锅，研钵或组织匀浆机2、材料和试剂（1）新鲜兔肝（2） 0、10mol/L磷酸盐缓冲液（pH7、4）：0、1mol/L NaH2PO419 ml 加0、1mol/LNa2HPO481ml。
（3）0、093 mol/L琥珀酸钠溶液：取琥珀酸钠1、5g溶于100 ml蒸馏水中。
（4）0、10 mol/L丙二酸钠溶液：取丙二酸钠1、5g溶于100 ml蒸馏水中。
（5）0、02%甲稀蓝溶液。
（6）液体石蜡。
四、实验操作新鲜兔肝立即剪碎，放于组织匀浆机中研碎，加入pH7、4的0、10 mol/L磷酸盐缓冲液，制备成200 g/L的肝匀浆液备用。
取五支试管分别编号，按下表配制反应体系：试剂管号0、093 mol/l琥珀酸钠0、10 mol/l丙二酸钠0、10mol/l(pH7、4)磷酸缓冲液肝匀浆液0、02%甲烯蓝11ml2ml1ml3滴21、5ml0、5ml1ml1ml3滴31ml1ml2ml3滴42ml1ml1ml3滴51ml1ml1ml1ml3滴将各管溶液混匀后加一薄层液体石蜡后静置（此时不可摇动!），观察各管中的颜色变化，并记录各管颜色完全变化的时间。
实验八 丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用
实验八 丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用【目的】验证丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用。
【原理】琥珀酸在琥珀酸脱氢酶催化下脱氢生成延胡索酸，脱下的氢被受氢体接受。
本实验用亚甲蓝（MB ）作为受氢体，亚甲蓝接受琥珀酸脱下的氢由蓝色还原成无色的甲烯白（MBH 2）。
丙二酸与琥珀酸分子结构相似，能竞争性抑制琥珀酸脱氢酶。
通过观察亚甲蓝颜色消退的程度，可以判断丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制程度。
COOHCH CH +MBCOOH CH 2CH 2+MBH 2琥珀酸亚甲蓝（蓝色）延胡索酸还原性亚甲蓝（无色）琥珀酸脱氢酶【器材】试管及试管架、滴管、剪刀、研钵或20ml 匀浆器、电热恒温水浴箱。
【试剂】1. 0.1mol/L 磷酸缓冲液（PH7.4）取0.1mol/L Na 2HPO 4溶液19ml 和0.1mol/L NaH 2PO 4溶液81ml 混合即可。
2. 1.5% 琥珀酸钠溶液 3. 1% 丙二酸钠溶液 4. 0.02% 亚甲蓝溶液 5.液状石蜡 【操作】1. 取新鲜动物肌肉或肝5g 左右，放入研钵，用剪刀将组织剪碎，然后加入10ml 在冰箱中保存的PH7.4的磷酸缓冲液充分研磨均匀（或在匀浆器内进行匀浆，制备成20%匀浆液）。
2. 取4支试管，编号，按下表操作：表3-11 丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用加入物（滴） 1 2 3 4 匀浆10 10 －101.5%琥珀酸钠溶10 10 10 20液1%丙二酸钠溶液－10 10 10 蒸馏水20 10 20 －0.02%亚甲蓝溶液10 10 10 103. 各管混匀后，各加少量液状石蜡覆盖在液体上，置37℃水浴中保温，随时观察各管颜色变化，并记录各管亚甲蓝褪色时间。
【结果及分析】比较各管亚甲蓝褪色情况，并对实验结果进行分析。
【思考题】1. 什么是竞争性抑制作用，与非竞争性抑制作用有何不同。
2. 为什么要用石蜡油隔绝空气来进行实验？。
丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用按抑制类新艺术语
丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用按抑制类新艺术语
酯酶的抑制作用：二乙酰丙二酸的作用机制
琥珀酸脱氢酶(EC 1.1.1.35)是酯酶系列中一种重要的蛋白酶，其主要作用是将脂肪酸酯(如甘油酯)和羧酸酯(如肌酸酯)脱氢，以合成其对应的醇和酸。
而二乙酰丙二酸(Ki)是一种具有重要抑制作用的有机酸，它能够有效抑制琥珀酸脱氢酶活力，从而减缓或阻止脂肪酸的脱氢作用。
二乙酰丙二酸的功效机理主要是因为它能够和蛋白质酶特异性结合，抑制酶的活性。
它能够和蛋白质酶中的硫氨基酸残基特异性结合，形成二酰丙二酸硫酰亚铁羧酸复合体，其大小与聚醚聚丙烯酰胺第1聚类似，这样就造成蛋白质酶活性位点的变化，达到抑制作用。
另外，由于二乙酰丙二酸具有很高的抑制效果，因此它也可以用于控制药物的渗透、吸收和分解，从而提高药物的疗效。
综上所述，可以得出结论，二乙酰丙二酸是一种可抑制琥珀酸脱氢酶的有效机制。
它可以通过特异性结合蛋白质酶中的硫氨基，形成二酰丙二酸硫酰亚铁羧酸复合体，从而抑制脂肪酸脱氢作用，有效提高药物的疗效，从而达到降低脂肪含量的目的。
丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争抑制作用PPT课件
• 学习掌握酶竞争性抑制的概念和特点
• 学习丙二酸对琥珀酸脱氢酶竞争性抑制 实验的设计思路和方法
第1页/共10页
二、实验原理
酶的竞争性抑制作用
抑制剂和底物结构相 似，可与底物竞争结合 酶的活性中心，阻碍酶 -底物复合物形成
抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力，以 及抑制剂与底物浓度的相对比例（[I]/[S]）
第2页/共10页
HOOC—CH2—CH2—COOH
丙二酸 HOOC—CH2—COO琥H珀 酸 脱 氢 酶
FAD
甲烯白MBH2 （无色）
HOOC—CH=CH—COOH FADH2
甲烯蓝MB （蓝色）
在无氧条件下以甲烯蓝褪色时间判断琥珀 酸脱氢酶活性高低，观察竞争性抑制作用
第3页/共10页
三、实验步骤
及其特点是什么？如何证明的？ 4、本实验中5号、6号试管的作用是什么？
第6页/共10页
五、注意事项
• 加试剂时看清底物与抑制剂的浓度。 • 注意随时观察记录各管褪色时间。 • 37℃水浴保温过程中，不能振摇试管，
避免甲烯白重新氧化变蓝。 • 实验结束后一定洗净试管内的液体石蜡。
第7页/共10页
第8页/共10页
1. 酶提取液的制备 处死大白鼠，分离出肌肉。 制备匀浆液。
２. 酶促反应及竞争性抑制作用 取试管6支，按表所列步骤操作。 加液体石蜡以隔绝空气37℃水浴保温 随时观察并记录各管褪色时间！！！
第4页/共10页
3. 实验记录和结果分析
试管编号
1 2 34 5
[I]/[S] 0:1 1:10 1:1 10.1 -
-
褪色时间
酶提取液中有没有琥珀酸脱氢酶活性？
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实验八 丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用
【目的】
验证丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用。
【原理】
琥珀酸在琥珀酸脱氢酶催化下脱氢生成延胡索酸，脱下的氢被受氢体接受。
本实验用亚甲蓝（MB ）作为受氢体，亚甲蓝接受琥珀酸脱下的氢由蓝色还原成无色的甲烯白（MBH 2）。
丙二酸与琥珀酸分子结构相似，能竞争性抑制琥珀酸脱氢酶。
通过观察亚甲蓝颜色消退的程度，可以判断丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制程度。
COOH
CH CH +
MB
COOH CH 2CH 2+
MBH 2
琥珀酸
亚甲蓝（蓝色）
延胡索酸
还原性亚甲蓝（无色）
琥珀酸脱氢酶
【器材】
试管及试管架、滴管、剪刀、研钵或20ml 匀浆器、电热恒温水浴箱。
【试剂】
1. 0.1mol/L 磷酸缓冲液（PH7.4）
取0.1mol/L Na 2HPO 4溶液19ml 和0.1mol/L NaH 2PO 4溶液81ml 混合即可。
2. 1.5% 琥珀酸钠溶液 3. 1% 丙二酸钠溶液 4. 0.02% 亚甲蓝溶液 5.液状石蜡 【操作】
1. 取新鲜动物肌肉或肝5g 左右，放入研钵，用剪刀将组织剪碎，然后加入10ml 在冰箱中保存的PH7.4的磷酸缓冲液充分研磨均匀（或在匀浆器内进行匀浆，制备成20%匀浆液）。
2. 取4支试管，编号，按下表操作：
表3-11 丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用
加入物（滴） 1 2 3 4 匀浆10 10 －10
1.5%琥珀酸钠溶
10 10 10 20
液
1%丙二酸钠溶液－10 10 10 蒸馏水20 10 20 －
0.02%亚甲蓝溶液10 10 10 10
3. 各管混匀后，各加少量液状石蜡覆盖在液体上，置37℃水浴中保温，随时观察各管颜色变化，并记录各管亚甲蓝褪色时间。
【结果及分析】
比较各管亚甲蓝褪色情况，并对实验结果进行分析。
【思考题】
1. 什么是竞争性抑制作用，与非竞争性抑制作用有何不同。
2. 为什么要用石蜡油隔绝空气来进行实验？。