生理指标的测定-SOD-MDA-CAT-POD-叶绿素

生理指标的测定

测定不同时期野生大豆和栽培大豆的游离脯氨酸、丙二醛、过氧化物酶、叶绿素的含量。测定方法如下：

采样：分别在盐处理后，第2天、第7天和第12天，采叶片测量生理指标。

采摘的叶片标准为：成龄、无病虫害、无缺失、鲜绿的叶片。

丙二醛含量的测定（采用双波长硫代巴比妥酸法）

材料提取：称取0.25g左右大豆叶片，加入0.5% TCA 3mL，研磨后所得匀浆3000rpm离心10min。取上清液2mL，加0.5%TBA（称取TBA0.5g溶于0.5% TCA 溶液，并用其定容至100mL）2mL，混合后在100℃水浴上煮沸30min，冷却后再离心一次。

样品测定：分别测定上清液在450nm、532nm、600nm处的吸光值，并按公式算出MDA的浓度，再算出单位鲜重组织中MDA含量（μmol·g-1）。

结果计算：

M=C×V/W×1000M为MDA含量（μmol·g-1）；C为MDA浓度（μmol·L-1）；V为提取液体积（mL）；W为样品重量（g）。

游离脯氨酸含量的测定（采用酸性茚三酮法）

样品提取：称取鲜样0.5g左右，放入研钵中，加入80%的乙醇3mL研成匀浆，移入具塞试管中，并用80%的乙醇冲洗研钵，匀浆与洗液合并总量为10mL，加盖后沸水浴煮沸10min，再加活性炭粉末0.25g，振荡过滤（用80%乙醇冲洗滤纸与残渣3次），滤液于80～85℃水浴上蒸去乙醇，残渣用蒸馏水洗济并定容至100mL供测定之用。

样品测定：取具塞刻度试管2只，各加入上述过滤样液2mL、冰醋酸2mL、茚三酮试剂2mL，摇匀后加盖，于沸水浴中煮沸10～15min，冷却后于515nm下比色，记录消光值。

结果计算：A=C×V/WA为样品脯氨酸含量（μg·g-1）；C为从标准曲线上查得脯氨酸浓度（μg·ml-1）；V为样品稀释体积（ml）；W为样品重量（g）。

过氧化物酶活性的测定（采用愈创木酚比色法）

酶液制备：称取大豆叶片0.3g，加入适量的pH7.0的磷酸缓冲液（准确称取0.156g NaH2PO4·2H2O，溶解后定容至100mL，即为A液；准确称取0.35g Na2HPO4·12H2O，溶解后定容至100mL，即为B液。取A液39mL和B液61mL 混匀，即为10mmol·L-1pH7.0的磷酸缓冲液。）充分研磨至无粗纤维为止，分装在小离心管中，再用pH7.0的磷酸缓冲液洗净研钵，洗液一并转入小离心管中，10000rpm离心20min，上清液即为酶提取液。

酶活性测定：取试管11支，一支为对照管，另外10支为测定管，按下表加入

试剂，配成POD反应体系。摇匀，放入34℃水浴中保温3min后，加入50μL 三氯乙酸，摇匀，以对照管作用液为空白，在470nm波长下比色，读取OD值。

结果计算：过氧化物酶活性单位（U）定义为1g鲜样1min内470nm处吸光值升高1个单位所需的酶量。过氧化物酶活性=OD470/（W×t）×V1/V2式中：OD470为470nm下的OD值；W为样品重（g）；t为反应时间（min）；V1为提取时酶液体积（mL）；V2为反应时酶液体积（mL）。

叶绿素含量的测定（采用721-分光光度计法）

叶绿素在盐处理后第12天测量

色素提取：称取新鲜叶片0.1g放入研钵中，加入5mL80%丙酮研磨成匀浆，倒入小离心管中，加盖，3000rpm离心5min。上清液即为光合色素提取液。

比色测定：取小试管，取提取液2mL加80%丙酮4mL稀释摇匀，分别于663nm、645nm下比色，记录OD值。

结果计算：A=C×V／W×1000C=20.3OD645+8.04OD663

式中：A为色素含量（mg·g-1）；C为色素浓度（mg·L-1）；V为色素溶液总体积（mL）；W为叶片重量（g）。

酶液的制备及活性测定

SOD粗酶液制备

4℃下，按每g（鲜重）材料加入10mL 50mmol·L-1磷酸缓冲液（pH7.8，含0.1mmol·L-1 EDTA，4%聚乙烯吡咯烷酮PVPP），匀浆，用尼龙布过滤，滤液于12 000r/min离心20min，上清液为酶粗提液，用于测定SOD、CAT活性及MDA 含量。

POD粗酶液制备

4℃下，按每0.5g（鲜重）材料加5mL 0.1 mol·L-1Tris-HCl缓冲液（pH8.5），研钵中研磨成匀浆，以4 000rPmin离心15min，取上清液，即为酶的粗提液。

各项生理生化指标的测定

SOD活性测定采用SOD测试盒，本试剂盒采用黄嘌呤氧化酶法；（SOD测试盒为南京建成生物工程研究所生产，愈创木酚、高锰酸钾、三氯乙酸、硫代巴比妥酸等均为国产分析纯）

POD活性测定采用愈创木酚法，以每分钟内OD470nm变化0.01为一个过氧化物酶活性单位（U）；CAT活性测定采用高锰酸钾滴定法；MDA含量测定采用硫代巴比妥酸（TBA）法。