多酚氧化酶检测试剂盒(PPO)说明书

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实验四、多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质

实验四、多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质(总3页)-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除实验四、马铃薯块茎多酚氧化酶（PPO）活性测定及酶学性质一、实验目的1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。

2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。

二、实验原理马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。

酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。

其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。

多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等．是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶．普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。

植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，使组织形成褐变．以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。

研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。

因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。

多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在410nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值的变化确定PPO的酶活大小。

多酚氧化酶?邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2?O2——————→邻醌＋H2O?三、试验材料、试剂及试验用品1．材料：马铃薯块茎。

2．仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶3．试剂：0.1mmol/L 磷酸缓冲液（pH=7.0）；0.01mol/L邻苯二酚；0.1mol/L 磷酸氢二钠；0.1mol/L磷酸二氢钠；10mmol/L柠檬酸；10mmol/L抗坏血酸；10mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）；10mmol/L亚硫酸钠四、实验方法：1.多酚氧化酶的提取取0.5g马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（pH7.0）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在４℃下离心（8000r/min）5min，取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。

多酚氧化酶的活性测定的报告

朴东日：多酚氧化酶活性的测定。

一、试验目的本试验的目的在于掌握多酚氧化酶活性测定的一般原理及操作技术。

二、试验原理酚氧化酶（PPO）催化各种酚与O2氧化为醌。

本实验是采用邻苯二酚为底物，在0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液PH6.0的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。

三、试验材料、试剂及试验用品材料：李子样本80个（按照80个预算药品）李子处理：果实发育早期、果实发育中期、果实发育后期、发育中期果实用1-MCP处理、发育中期果实用乙烯处理。

药品：预冷的磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）２０ｍＬ１ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）邻苯二酚４ｍＬ磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）四、实验方法：1.ＰＰＯ的提取取１ｇ李子果肉样品，冰浴研磨，加入预冷的磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）２０ｍＬ，在４℃下离心（４２００ｒ／ｍｉｎ）１０ｍｉｎ，取上清液为蜜柚果肉ＰＰＯ酶提取液。

2.ＰＰＯ活性测定采用比色法测定。

将１ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）邻苯二酚加入４ｍＬ磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）中，加入１ｍＬ酶液，立即于波长４２０ｎｍ下测定吸光度的变化，每隔２０ｓ记录１次，共记录３ｍｉｎ。

以不加酶提取液的反应液做对照，以每分钟吸光度变化０．０１为１个ＰＰＯ酶活性单位。

3.最后作吸光度A与反应时间的关系曲线图，依据曲线最初直线段的斜率(ΔA/t)计算PPO活力。

(注意空白为：2.5 mL缓冲液和0.5 mL 0.01 mol/L邻苯二酚溶液)一个酶活力单位定义为：以每分钟每毫升增加吸光值0.001的酶量为一个酶活力单位U。

4.多酚氧化酶酶活的计算公式：E=M×60/V (式1)式中：M—每秒钟增加的吸光值V—粗酶液的体积/mL。

多酚氧化酶活性的测定

三、实验材料、仪器与试剂 1.材料：马铃薯； 2.仪器：恒温水浴、分光光度计、试管等； 3.试剂： 0.5%邻苯二酚溶液、0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液（PH6.0）。
四、实验方法： 1.设计样品（自购）的不同贮藏条件，提前贮藏样品以进行测定。 2.酶液的制备：称取样品5.0g，用预冷蒸馏水研磨匀浆，定容至 100ml，在18-20℃下浸提30分钟，中间摇动数次，过滤备用。 3.测定：（1）对照：在含有6mLpH6.0的0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液试管中加入1mL0.5%邻苯二酚溶液，在30℃恒温水浴中预热后加入1mL灭酶后的酶液，2mL蒸馏水，以此调零。（2）样品测定：在含有6mLpH6.0的0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液试管中加入1mL0.5%邻苯二酚溶液，在30℃恒温水浴中预热后加入1mL酶液， 2mL蒸馏水，反应5分钟，加热灭酶以终止反应，以5000r/min离心10分钟，取上清液备用。在 410nm下测定吸光度。
五、实验结果记录及分析：以每分钟A410变化0.01为一个多酚氧化酶活性单位（u）
A V 410 T 多酚氧化酶活性 [ u /g （ m ） in ] W V 0 . 01 t S
式中：A410：反应时间内吸光度的变化， W：样品鲜重g， t：反应时间min，本次实验为5min， VT：提取酶液总体积ml， Vs：测定时取用酶液体积ml。
实验五多酚氧化酶活性的测定
Hale Waihona Puke 一、实验目的：通过实验掌握测定多酚氧化酶活性的方法及原理，理解诸如：果实受伤、组织变褐的原因等。
二、原理与方法多酚氧化酶（PPO）催化各种酚与O2氧化为醌。本实验是采用邻苯二酚为底物，在0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液PH6.0的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD 值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。

一种多酚氧化酶(PPO)抑制剂及其制备方法和应用[发明专利]

专利名称：一种多酚氧化酶（PPO）抑制剂及其制备方法和应用
专利类型：发明专利
发明人：张青叶,齐晓娟,刘梦苑
申请号：CN201810606714.5
申请日：20180613
公开号：CN108623505A
公开日：
20181009
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种多酚氧化酶(PPO)抑制剂，所述抑制剂为N‑取代苯基‑取代酰肼氨基硫脲类化合物；该多酚氧化酶(PPO)抑制剂的制备方法为：在100mL的单口圆底烧瓶中依次加入1mmol 取代异硫酸氰酯和1mmol取代酰肼，再加入15mL无水乙醇溶解，室温下反应约2‑6h，反应结束后，进行抽滤，得到的固体用无水乙醇重结晶，30℃真空干燥得到目标化合物。

本发明制备的化合物对多酚氧化酶(PPO)具有较高抑制活性，可以作为抗氧化剂的有效成份，应用前景广阔。

申请人：华中农业大学
地址：430070 湖北省武汉市洪山区狮子山街1号
国籍：CN
代理机构：武汉宇晨专利事务所
代理人：王敏锋
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PPO测定

实验11、多酚氧化酶（PPO）活性的测定《果蔬采后生理生化实验指导》曹建康姜微波赵玉梅编著一、原理多酚氧化酶（PPO）是一种以铜为辅基的酶，能催化多种简单酚类物质氧化形成醌类化合物，醌类化合物进一步聚合形成呈褐色、棕色或黑色的聚合物。

在后熟衰老过程或在采后的贮藏加工过程中，果蔬出现的组织褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。

多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化形成的产物在420 nm 处有最大光吸收峰。

因此可利用比色法测定多酚氧化酶的活性。

二、仪器设备1、研钵2、高速冷冻离心机3、分光光度计4、计时器5、移液器6、离心管7、试管8、容量瓶（100 mL 、1000 mL）三、试剂1、0.1 mol·L—1 、pH 5.5乙酸—乙酸钠缓冲液母液A（200 mmol·L—1 醋酸溶液）：量取11.55 mL 冰醋酸，加蒸馏水稀释至1000 mL 。

母液B（200 mmol·L—1 醋酸钠溶液）：称取16.4 g 无水醋酸钠（或称取27.2 g 三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、定容至1000 mL 。

取68 mL 母液A和432 mL 母液B混合后，调节pH至5.5，加蒸馏水稀释至1000 mL 。

2、提取缓冲液（含1 mmol PEG、4% PVPP、和1% Triton X—100）称取340 mg PEG 6000（聚乙二醇6000）、4 g PVPP（聚乙烯吡咯烷酮），取1 mL Triton X—100，用0.1 mol·L—1 、pH 5.5乙酸—乙酸钠缓冲液溶解、稀释至100 mL 。

3、50 mmol·L—1 邻苯二酚溶液称取275 mg 邻苯二酚，用0.1 mol·L—1、pH 5.5乙酸—乙酸钠缓冲液溶解、稀释至50 mL 。

四、实验步骤1、酶液制备：称取5.0 g 样品，置于研钵中，加入6.0 mL 提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，再用10 mL 分次清洗研钵，用抽滤法进行粗滤，使用液相纯化膜进行精滤，即得到酶提取液，低温保存备用。

多酚氧化酶（PPO）活性检测试剂盒说明书

多酚氧化酶（PPO）活性检测试剂盒说明书微量法货号：BC0195规格：100T/48S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系本公司工作人员。

试剂名称规格保存条件提取液液体100mL×1瓶4℃保存粉剂粉剂×1瓶4℃保存试剂一液体20mL×1瓶4℃保存试剂二液体5mL×1瓶4℃保存溶液的配制：1、提取液：临用前将粉剂一倒入提取液中，溶液为悬浊液，使用前需摇匀。

产品说明：PPO（EC1.10.3.1）是一种广泛存在于植物体内的含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化产生醌，从而引起褐化，与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。

PPO能够催化邻苯二酚产生邻苯二醌，后者在410nm有特征光吸收。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20%，超声3秒，间隔10秒，重复30次）；8000g4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

2、称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。

8000g4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）：直接检测。

二、测定步骤1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至410nm，蒸馏水调零。

2、样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）试剂名称（μL）测定管对照管试剂一200200试剂二5050样本50煮沸的样本5037℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）中准确水浴10min后，迅速放入沸水中加热10min。

充分混匀，5000g，常温离心10min，收集上清，取200μL至微量玻璃比色皿或96孔板中，410nm处检测测定管和对照管吸光度，计算ΔA=A测定-A对照。

多酚氧化酶(PPO)的分离提取

多酚氧化酶（PPO）的分离提取一、原理与目的多酚氧化酶是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶，植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，是组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。

醌类物质对微生物有毒害作用，所以伤口醌类物质出现是植物防止伤口感染的愈伤反应，因而受伤组织一般这种酶的活性就会提高。

多酚氧化酶也可与细胞内其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。

PPO的存在是水果、蔬菜褐变及营养丧失的主要原因之一。

PPO氧化内源的酚类物质生成邻醌，邻醌再相互聚合成醌或蛋白质、氨基酸等作用生成高分子络合物而导致褐色素的生成，色素分子量愈高，颜色愈暗。

多酚氧化酶活性高低也是马铃薯解除休眠的指标之一。

本实验将采用马铃薯为主要材料，通过组织细胞破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液。

通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关仪器设备的操作使用，以及蛋白质的提取、分离的系统技术。

二、材料与试剂（1）马铃薯（大约每小组100-200g）（2）试剂：0.03M磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮)配制时配×10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M 巯基乙醇，0.001MEDTA，0.005MgCL2）配置时配（3）实验器械与仪器设备：试管与试管架；烧杯、玻璃搅棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆器；pH计和pH试纸；GL-20C高速冷冻离心机；DL-7A大容量低速冷冻离心机三、操作步骤1：粗酶提取：水果肉组织按1：1（W/V）比例与003M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%聚乙烯吡咯烷酮）混合，匀浆4层后纱布过滤，滤液以6000rpm 离心10min，弃除沉淀获得酶提取液。

PPO酶测定

红三叶品种：岷山、春茵、瑞德、巫溪、炫丽、巫溪、磷酸缓冲液 0.05mol/L 磷酸氢二钠 3.28g 磷酸二氢钠0.27g 1000ml容量瓶 PH=7.8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液0.1mol/L 磷酸氢二钠 0.87g、柠檬酸二甲0.23g邻苯二酚0.2mol/L----0.3 mol/L 2.20g于100ml容量瓶ＰＰＯ酶测定PPO常用的测定方法有比色法[1]和氧电极法PPO活性测定方法较多,有减压法、耗氧电极法、分光光度法、精密计时测定法、高效液相色谱法等。

Lamk in和M cCaig提出以邻苯二酚为底物测定小麦PPO活性较为敏感、稳定,而且操作简便,费用低,适用于大规模检测PPO活性测定参照Coseteng速率法[6]并加以改进：取0.10mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH6.2)2.6mL,分别与0.20mol/L邻苯二酚（底物）0.3mL混合,28℃水浴中预热5min,加入0.1mLPPO提取液, 立即用生化自动分析仪在420nm处测定OD值。

每隔10s读取一次OD值。

以每mL酶液在1min内引起吸光值增加0.001所需的量为一个酶活性单位(以unit/min表示)。

以上测定均重复3次。

一、原理与方法PPO催化各种酚与O2氧化为醌。

本实验是采用邻苯二酚为底物，在0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液PH5.8的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。

其方法是：在含有4mlPH5.8的0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液试管中加入0.05ml0.05M邻苯二酚溶液，在30℃恒温水浴中预热后加入0.05ml酶液，反应5分钟，在分光光度计410nm处读取吸光值。

在上述条件下，以A410读数，以每分钟增加0.01O.D.值定义为一个酶活性单位（U）。

二、仪器与试剂（1）样品：多酚氧化酶粗酶液硫酸铵沉淀组分DE-52洗脱组分葡聚糖凝胶洗脱组分（2）底物：邻苯二酚：O.01M邻苯二酚溶液（3）反应体系：0.2M邻酸二氢钠－0.1M柠檬酸缓冲液PH5.8（4）器皿与仪器：试管、恒温水浴等分光光度计三、酶蛋白的比活性比活性＝酶活单位（U）/mg蛋白质四、实验结果与分析1. Sephadex G-200的洗脱组分的相对浓度（OD590）和相对酶活（OD410）结果列表试管号蛋白质浓度PPO酶活试管号蛋白质浓度PPO酶活空白0 0 3 0.16 0.09粗酶液0.20 0.14 4 0.03 0.031 0.00 0.01 5 0.03 0.012 0.13 0.09 6 0.02 0.02分析:2和3试管中含绝大部分所需蛋白,保存进行下一步纯化。

多酚氧化酶的实验报告

1. 了解多酚氧化酶的活性测定原理及方法。

2. 掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的操作技术。

3. 通过实验，分析影响多酚氧化酶活性的因素。

二、实验原理多酚氧化酶（PPO）是一种含铜的氧化酶，广泛存在于植物组织中。

在适宜的条件下，PPO催化酚类物质氧化形成醌类物质，使植物组织发生褐变。

本实验采用分光光度法测定多酚氧化酶活性，以邻苯二酚为底物，通过测定反应过程中吸光度的变化来计算酶活性。

三、实验材料与试剂1. 材料：新鲜马铃薯、0.1mol/L邻苯二酚溶液、pH6.8磷酸盐缓冲液、NaF溶液、5%三氯乙酸溶液、硫脲、0.01mol/L间苯二酚、蒸馏水。

2. 仪器：分光光度计、匀浆机、离心机、恒温水浴、移液器、试管等。

四、实验步骤1. 酶液的制备：取新鲜马铃薯150g，洗净后切块，加入150mL NaF溶液，匀浆后用四层纱布过滤。

取滤液50mL，于3500r/min离心5-10min，取上清液。

2. 酶活性测定：取3支试管，分别编号为A、B、C。

向A、B、C三管中加入0.1mol/L邻苯二酚溶液1mL、pH6.8磷酸盐缓冲液2mL，向A、B管中加入酶液0.5mL，C管不加。

将三管置于恒温水浴中，在反应时间分别为0、10、20、30、40、50min时，取出A、B、C三管，分别加入5%三氯乙酸溶液1mL，摇匀后于410nm波长处测定吸光度。

3. 数据处理：以邻苯二酚为标准曲线，计算酶活性。

五、结果与分析1. 标准曲线的绘制：以邻苯二酚浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 酶活性计算：根据标准曲线，计算不同反应时间下的酶活性。

3. 影响酶活性的因素分析：通过实验，分析温度、pH、底物浓度、酶浓度等对酶活性的影响。

1. 成功掌握了分光光度法测定多酚氧化酶活性的原理及操作技术。

2. 通过实验，分析了影响多酚氧化酶活性的因素，为后续研究提供了依据。

七、实验讨论1. 在实验过程中，发现温度对酶活性有显著影响。

PPO化学品说明书

PPO化学品说明书
1、多酚氧化酶(PPO)试剂盒说明书绝大部分产品备有现货,一般情况下都能订货当日发货。

2、部分非常用产品,需提前1-2日预订,海外期货则需要提前3-6周预订。

3、部分产品价格会因货期、批次等因素发生变化,若有变动以订货当日*价格为准。

4、每日订单截止时间为16点整,部分城市可到17点整,因超过截止时间造成当日不能发货的将于次日安排发货。

5、请办理完货款后,将收据、底单等连同收货人的地址、姓名、电话等以传真、EMail、短信、电话等形式通知我们。

注意事项
①多酚氧化酶(PPO)试剂盒说明书加入试剂的顺序应一致,以保证所有反应板孔温育的时间一样。

②使用干净的塑料容器配置洗涤液。

③按照鸡血红蛋白(HB)ELISA检测试剂盒说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。

④底物A应挥发,避免长时间打开盖子。

底物B对光敏感,避免长时间暴露于光下。

避免用手接触,有毒。

实验完成后应立即读取OD值。

⑤洗涤酶标板时应充分拍干,不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。

⑥使用一次性的吸头以免交叉污染,吸取终止液和底物A、B液时,避免使用带金属部分的加样器。

⑦实验中不用的板条应立即放回包装袋中,密封保存,以免变质。

⑧试剂应按标签说明书储存,使用前恢复到室温。

稀稀过后的标准品应丢弃,不可保存。

⑨不用的其它试剂应包装好或盖好。

不同批号的试剂不要混用。

保质前使用。

多酚氧化酶实验报告

一、实验目的1. 理解多酚氧化酶（PPO）在植物组织中的作用及其活性测定的原理。

2. 掌握分光光度法测定PPO活性的操作技术。

3. 分析不同条件下PPO活性的变化，如pH值、温度等。

二、实验原理多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，广泛存在于植物组织中。

它能够催化酚类物质与氧气反应生成醌类物质，进而引起植物组织的褐变。

本实验采用分光光度法测定PPO的活性，通过测量反应体系在特定波长下的吸光度变化来反映酶的活性。

三、实验材料与试剂1. 实验材料：马铃薯、茶叶、茶叶提取物等。

2. 试剂：0.03M磷酸缓冲液（pH 6.0）、0.01mol/L邻苯二酚溶液、5%三氯乙酸溶液、0.01mol/L的间苯二酚溶液、0.01mol/L的NaF溶液、pH 6.8的磷酸盐缓冲液、硫脲等。

四、实验步骤1. 酶提取：取一定量的马铃薯或茶叶，加入适量磷酸缓冲液（pH 6.0），用匀浆机充分匀浆，过滤，收集滤液。

2. 酶活性测定：取适量酶液，加入0.01mol/L邻苯二酚溶液，在410nm波长下测定吸光度。

3. 酶活性计算：根据吸光度变化计算酶活性，公式如下：\[ 酶活性 = \frac{ΔA}{Δt} \times V_{底物} \]其中，ΔA为吸光度变化，Δt为反应时间，V_{底物}为底物体积。

4. 影响因素实验：分别考察pH值、温度、底物浓度等因素对PPO活性的影响。

五、实验结果与分析1. 酶活性测定：通过分光光度法测定，得到不同样品的酶活性数据，如表1所示。

表1 不同样品的酶活性| 样品 | 酶活性（U/mg） || -------- | -------------- || 马铃薯 | 1.23 || 茶叶 | 0.98 || 茶叶提取物 | 1.57 |从表1可以看出，茶叶提取物的酶活性最高，马铃薯次之，茶叶最低。

2. 影响因素实验：（1）pH值：在pH 4.0～7.0范围内，PPO活性随pH值升高而增加，在pH 6.0时达到最大值，随后逐渐下降。

实验四、多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质

实验四、多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质多酚氧化酶（Polyphenol oxidase, PPO）是一种广泛存在于植物、菌类和动物体内的酶，主要催化化学反应为将多酚氧化成醛或酮。

本实验旨在通过测定PPO的活性来了解酶的基本特性及其酶学性质。

一、实验材料1、经过离心沉淀的香蕉、苹果、洋葱原汁。

2、6%聚乙烯醇（PVA）溶液。

3、明胶溶液（1%）。

4、酚酞指示剂。

5、75mM bicine缓冲液（pH 8.5）。

6、0.05% 过氧化氢溶液。

7、1% 多巴胺溶液。

8、分光光度计。

二、实验原理多酚氧化酶是一种铜单子酶，催化剂的过程时首先将基质中的酚乙酸类化合物与氧气反应形成间醌，然后间醌的氧化、聚合，形成花青素、黑色素等产物。

本实验采用的基质是多巴胺（L-dopa），媒介是酚酞指示剂，测定体系的光学吸收度。

酶的活性按单位时间内反应的基质质量而计算。

三、实验步骤1、提取PPO将香蕉、苹果、洋葱各取50g，切碎，加入200ml 0.1M盐酸溶液，搅拌后放在4℃冷库20-30min，滤去上清液。

将残渣加入100ml冷水，搅拌，离心至沉淀物无明显色泽，取上清液后pH调节至8.5，保存于冷库。

2、测定PPO的活性（1）制备基质溶液：10mg多巴胺溶于2ml 0.1M的硫酸钠溶液中，用1M的NaOH溶液调节pH至8.5，加入12ml0.75M缓冲液，加水至50ml。

（2）制备酚酞指示剂溶液：2mg的酚酞溶于100ml的乙醇中，加水至1L，制成0.2%的酚酞溶液。

（3）测定反应系统：将基质溶液、酚酞指示剂溶液和一定量提取液混合，在25℃下恒温反应5min。

（4）实验对照：在上述条件下，仅加入基质溶液和酚酞指示剂溶液，无提取液作为实验对照。

（5）催化反应停止：加入0.5ml 的聚乙烯醇溶液。

（6）光度计测量：在650nm处上述反应体系产生的色素的吸光度。

4、结果计算将吸收度计算为1cm光程曲线的峰高比，用表格法计算多酚氧化酶活性反应速率以μmol/min为单位。

多酚氧化酶的测定

多酚氧化酶的测定试剂：1、0.02mol/l焦儿茶酚溶液：称0.22克焦儿茶酚溶于100毫升蒸馏水中，现用现配。

2、0.1mol/l碘酸钾：0.3567克碘酸钾溶于蒸馏水，定容至100毫升。

3、0.005mol/l碘液：碘化钾2.5克溶于200毫升蒸馏水中，加冰醋酸1毫升，再加0.1mol/l 碘酸钾12.5毫升，最后加蒸馏水定容至250毫升。

4、pH6.0磷酸缓冲液：87.7毫升A+12.3毫升B，用蒸馏水稀释至200毫升。

贮备液A：0.2mol/l磷酸二氢钠（27.6g NaH2PO4·H2O用蒸馏水配成1000ml）。

贮备液B：0.2mol/l磷酸氢二钠（53.65g Na2HPO4·7H2O或71.7g Na2HPO4·12H2O用蒸馏水配成1000毫升）5、其它：1%淀粉；10%偏磷酸；0.1%抗坏血酸（现用现配）方法：1、粗酶提取：称取新鲜样品2克，剪碎，置于研钵中，加入少量pH6.0磷酸缓冲液和少许石英砂，于冰浴中迅速研磨至匀浆，将全部材料用缓冲液冲洗入50毫升容量瓶中，并定容至刻度。

在18~20度下每隔3分钟摇动1次，共5次，然后再静置15~20分钟，其上清液即为粗酶提取液（可倾入干洁的三角瓶中备用）。

2、活性测定：取干洁50毫升三角瓶6只（编号），按照下表向各瓶中加入pH6.0磷酸缓冲液、0.1%抗坏血酸、0.02mol/l焦儿茶酚，并向③号瓶及⑥号瓶各加10%偏磷酸。

然后将三角瓶置于18~20度水浴或放在室温下使内外温度达到平衡之后，每隔1分钟向各瓶中依次加入酶液2毫升，全部加完后保温3分钟，再按原顺序仍然间隔1分钟向①、②、④、⑤号各瓶加入偏磷酸1毫升（注意：加完2号瓶后应间隔2分钟再加4号瓶），用于终止酶的活性。

最后向各瓶中加入1%淀粉溶液3滴作为指示剂，摇匀后用微量滴定管以0.005mol/l碘液滴定，当溶液呈现淡蓝色为止，记录碘液消耗量。

多酚氧化酶活性测定

五、实验报告：计算所测材料的PPO活性。选择A值变化均匀的三组数值求平均值。
四、实验步骤： 1．称取马铃薯0.5克，加入2.5mL pH 7.2磷酸缓冲液，少许 PVP，研磨匀浆，转移到离心管，再用2.5mL pH 7.2磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液。4℃ 5000rpm离心15分钟，上清液即为粗酶液。 2．在试管中，加入2.5mL pH 7.2磷酸缓冲液，1.5mL 儿茶酚以及1mL 粗酶液，空白调零以1mL磷酸缓冲液代替粗酶液。 3．A值测定：加入粗酶液后迅速混匀，立刻于525nm下测定反应体系的A值，每隔30秒记录一次，共记录5次。 4．计算酶活力。按下式计算 PPO活性＝U/min gFW A值增加0.001定义为一个酶活力单位。实验一ຫໍສະໝຸດ 多酚氧化酶（PPO）活性测定
末端氧化酶：处于生物氧化一系列反应的最末端，把电子传递给O2的酶。 1、细胞色素氧化酶 2、交替氧化酶 3、酚氧化酶: 分为单酚氧化酶和多酚氧化酶。 4、乙醇酸氧化酶 5、抗坏血酸氧化酶
一、实验目的：掌握测定多酚氧化酶活性的方法；了解多酚氧化酶的特性二、实验原理：多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化生成醌。醌有颜色，在525nm下有最大光吸收，通过分光光度法测定反应体系颜色变化可测定酶活性。三、器材与试剂 1、仪器：低温离心机、s22pc分光光度计 2、试剂：儿茶酚、pH 7.2磷酸缓冲液 3、材料：马铃薯

多酚氧化酶(PPO)检测

多酚氧化酶（PPO）检测
多酚氧化酶（Polyphenol oxidase, PPO），又称为儿茶酚氧化酶，是一类含铜的氧化还原酶，广泛存在于植物、真菌、昆虫的质体中，甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性。

多酚氧化酶在茶中的主要作用是催化儿茶素形成邻醍，进一步形成茶黄素等色素物质和香气成分等。

PPO的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。

在广义上，可分为三大类：单酚单氧化酶（酪氨酸酶tyrosinase）、双酚氧化酶（儿茶酚氧化酶catechol oxidse）和漆酶（laccase），现在所说的多酚氧化酶一般是儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。

迪信泰检测平台采用生化法，可高效、精准的检测多酚氧化酶的活性变化。

此外，我们还提供其他氧化应激类检测服务，以满足您的不同需求。

生化法测定多酚氧化酶样本要求：
1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。

周期：2~3周
项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：
1. 实验步骤（中英文）
2. 相关参数（中英文）
3. 图片
4. 原始数据
5. 多酚氧化酶含量/活性信息。

土壤多酚氧化酶(S-PPO)活性检测试剂盒说明书__可见分光光度法UPLC-MS-4002

可见分光光度法土壤多酚氧化酶（S-PPO）活性检测试剂盒说明书货号:UPLC-MS-4002规格:50T/48S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称规格保存条件试剂一粉剂×2瓶2-8℃保存试剂二液体10mL×1瓶2-8℃保存试剂三液体100mL×1瓶（自备）2-8℃保存标准液液体10mL×1瓶2-8℃保存溶液的配制：1、试剂一：临用前取1瓶加入15mL蒸馏水，用不完的试剂2-8℃保存2周；2、试剂三：自备乙醚；3、标准液：重铬酸钾溶液（5mmol/L），相当于0.2mg/mL紫色没食子素溶液。

产品说明：S-PPO主要来源于土壤微生物、植物根系分泌物及动植物残体分解释放，催化土壤中芳香族化合物氧化成醌，醌与土壤中蛋白质、氨基酸、糖类、矿物等物质反应生成有机质和色素，完成土壤芳香族化合物循环，用于土壤环境修复。

S-PPO能够催化邻苯三酚产生紫色没食子素，后者在430nm有特征光吸收。

Pyrogallol S-PPO Purple gallate(430nm)注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、乙醚（不允许快递）、30~50目筛、0.5mol/L HCl溶液、冰和蒸馏水。

操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）新鲜土样自然风干或37℃烘箱风干，过30~50目筛。

二、测定步骤1、可见分光光度计预热30min以上，调节波长至430nm，试剂三调零。

2、标准液稀释：用0.5mol/L HCl溶液将标准液稀释至0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125、0mg/mL。

试验中需标准品1000µL。

植物多酚氧化酶(PPO)酶联免疫分析

植物多酚氧化酶（PPO）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。

检测范围：96T0.1U/L – 4.0U/L使用目的：本试剂盒用于测定植物组织，细胞及其它相关样本中多酚氧化酶（PPO）含量。

实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物多酚氧化酶（PPO）水平。

用纯化的植物多酚氧化酶（PPO）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入植物多酚氧化酶（PPO），再与HRP 标记的多酚氧化酶（PPO）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的植物多酚氧化酶（PPO）呈正相关。

用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中植物多酚氧化酶（PPO）浓度。

试剂盒组成1 30倍浓缩洗涤液20ml×1瓶6ml×1瓶12孔×8条6ml×1瓶6ml×1瓶6ml×1/瓶789终止液6ml×1瓶0.5ml×1瓶1.5ml×1瓶1份2 酶标试剂标准品（8.0 U/L）标准品稀释液3 酶标包被板4 样品稀释液5 显色剂A液6 显色剂B液10 说明书11 封板膜12 密封袋2张1个标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。

若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

4.0 U/L 2.0 U/L 1.0 U/L 0.5U/L 0.25U/L 5号标准品4号标准品3号标准品2号标准品1号标准品150µl的原倍标准品加入150µl标准品稀释液150µl的5号标准品加入150µl标准品稀释液150µl的4号标准品加入150µl标准品稀释液150µl的3号标准品加入150µl标准品稀释液150µl的2号标准品加入150µl标准品稀释液2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。

多酚氧化酶(PPO)检测试剂盒(邻苯二酚比色法)

多酚氧化酶(PPO)检测试剂盒(邻苯二酚比色法)产品简介：多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性，多酚氧化酶是一种蛋白体，在茶树生命活动和茶叶加工过程中参与一系列由酶促活动而引起的化学变化，故又被称为生物催化剂。

该酶属于细胞木质素合成途径中间的关键酶，研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量提高其品质提供依据。

Leagene 多酚氧化酶(PPO)检测试剂盒(邻苯二酚比色法)检测原理是以邻苯二酚作为底物，在酶促反应的最适条件下采用每隔一定时间测定产物生成量的方法，于分光光度计检测吸光度，以吸光度变化所需酶量进行计算。

该试剂盒主要用于植物组织的裂解液或匀浆液、血清等样品中内源性的多酚氧化酶活性，尤其适用于检测水果中多酚氧化酶活性。

该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

产品组成：自备材料：1、蒸馏水2、研钵或匀浆器3、离心管或试管4、低温离心机5、比色杯6、分光光度计操作步骤(仅供参考)：1、准备样品：①植物样品：取植物组织或水果中层果肉加入预冷的PPO Lysis buffer 研磨或匀浆，离心，留取上清液，冻存，用于多酚氧化酶的检测。

②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，编号名称TE042960T Storage试剂(A):PPO Lysis buffer 500ml 4℃试剂(B):PPO Assay buffer 25ml4℃避光使用说明书1份冻存，用于多酚氧化酶的检测。

③细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如有必要用PPO Lysis buffer进行适当匀浆，离心，取上清液，冻存，用于多酚氧化酶的检测。

④高活性样品：如果样品中含有较高活性的多酚氧化酶，可以使用PPO Lysis buffer进行恰当的稀释。

1多酚氧化酶（PPO）简介

1多酚氧化酶（PPO）简介多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中[1]，甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性。

多酚氧化酶最早在1895年被发现，直至1937年才被分离出来。

随着研究的深入,将其分为单酚单氧化酶[酪氨酸酶(tyrosinase),EC.1.14.18.1]、双酚氧化酶[儿茶酚氧化酶(catechol oxidase),EC.1.10.3.2]、漆酶(laccase,EC.1.10.3.1)[2]。

2多酚氧化酶的生理功能PPO能催化单元酚和二元酚等多元酚到联苯酚的羟基化以及羟基酚到醌的脱氢反应。

PPO定位于植物叶绿体的类囊体和其它类型质体的基质中，而植物体内PPO的底物存在于液泡中，且通常处于潜伏状态，因此，PPO与底物被区域化分开。

但当植物体内发生生理紊乱或组织受损时，PPO与底物的亚细胞区域化才被打破，PPO的底物被激活。

在PPO的作用下，底物与氧发生反应产生醌，醌在植物体内能发生自身聚合或与细胞内的氨基酸和蛋白质发生反应，产生黑色或褐色的沉积物，这是果蔬等农产品产生酶促褐变的主要原因，同时也是食品加工行业中影响产品的外观、风味、营养和加工性能的重要因素[3]。

另外，PPO 作为一种氧化还原酶还在光合作用中发挥作用。

如调节叶绿体中有害的光氧化反应速度，参与其中电子传递；PPO 还可促进伤口的愈合，也可增加植物对病原体的抗性。

如烟草对炭疽病、黄瓜对黑星病、苹果对轮纹病、棉苗对枯萎病菌、水稻对白叶枯病菌和细菌性条斑病以及番茄对小昆虫的抗性等。

PPO 的作用方式有：1．如番茄的具腺毛状体中含有大量 PPO，PPO 具有存在于表皮中、活化态和可溶性的特性，在毛状体介导的抗病过程中起作用。

2．通过醌共价调节亲核氨基酸形成抗营养机制，直接抵御昆虫和病原体。

3．醌的毒性直接发挥抗病作用。