嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结
G筛选稳定表达细胞系经验总结图文稿
G筛选稳定表达细胞系经验总结Company number【1089WT-1898YT-1W8CB-9UUT-92108】G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染,从G418浓度确定到最后的单化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况,和大家分享.没有总结好的地方,大家补充。
筛选之前确定G418浓度:1、由于每种细胞对G418的敏感性不同,而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同,一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物,两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因,它表达的蛋白能够分解新霉素G418。
在进行转染时细胞膜受到影响,抗生素可能对细胞产生较大影响,加上G418有杀菌作用,所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大,一般筛选时汇合度不宜超过50%4,G418的活性不尽相同,所以在筛选之前,一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下:将细胞稀释到1000个细胞/ml,在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选,选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验:3x106个细胞电转后,分别接种1/4000,1/1000,1/300细胞到24孔板中,48h后加药筛选,此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后,观察1/4000孔内有两三个,按比例1/300孔内应该有几十个,事实上,它们几乎全死光了,只有几个。
加药时间和维持浓度1,由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早;但是也不能太晚,因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大,增值较慢,时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没,最终导致筛选不出阳性,一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
嘌呤霉素筛选细胞原理
嘌呤霉素筛选细胞原理
嘌呤霉素是一种广泛用于细胞生物学研究的抗生素,它通过特异性地抑制蛋白
质合成而对细胞产生影响。
嘌呤霉素筛选细胞原理主要是利用其对细胞的影响来筛选出对嘌呤霉素敏感或耐药的细胞株,从而为进一步研究细胞的生物学特性提供重要的工具和方法。
嘌呤霉素的作用机制是通过与细胞内的核糖体结合,阻止蛋白质的合成。
在细
胞中,核糖体是蛋白质合成的重要场所,而嘌呤霉素的结合会引起核糖体的功能受损,从而影响细胞的正常生物学活动。
因此,对嘌呤霉素敏感的细胞在其作用下会出现生长受抑制甚至死亡的现象,而对嘌呤霉素耐药的细胞则能够继续生长并繁殖。
在进行嘌呤霉素筛选细胞的实验中,首先需要将待筛选的细胞种植在含有嘌呤
霉素的培养基中,然后观察细胞的生长情况。
对于对嘌呤霉素敏感的细胞,其生长将受到明显的抑制,甚至会出现细胞死亡的现象;而对于对嘌呤霉素耐药的细胞,则会继续生长并形成细胞克隆。
通过这种方式,可以筛选出对嘌呤霉素敏感或耐药的细胞株,为后续的细胞生物学研究提供了重要的实验材料。
嘌呤霉素筛选细胞的原理不仅在细胞生物学研究中具有重要意义,同时也在药
物筛选和耐药机制研究中发挥着重要作用。
通过对细胞对嘌呤霉素的敏感性进行评估,可以为药物研发提供重要参考,同时也有助于深入了解细胞对抗生素的耐药机制,为临床治疗提供理论基础。
总的来说,嘌呤霉素筛选细胞的原理是基于其对细胞的特异性影响,通过观察
细胞在其作用下的生长情况来筛选出对嘌呤霉素敏感或耐药的细胞株。
这一原理不仅在细胞生物学研究中具有重要意义,同时也在药物研发和耐药机制研究中发挥着重要作用,为进一步的科学研究和临床治疗提供了重要的实验基础和理论支持。
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结嘌呤霉素杀灭曲线的确定(shRNA稳定转染细胞株,仅作参考)(1)24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板,铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。
细胞孵育过夜;(2)准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基(如0-15μg/mL,至少5个梯度);(3)细胞孵育过夜后加入筛选培养基,孵育细胞;(4)约2-3天更换新鲜的筛选培养基;(5)每日监测细胞观察存活细胞比例。
嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。
(6)最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。
嘌呤霉素筛选稳定转染细胞(1)day 0:24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板,孵育过夜;(2)制备筛选培养基:含有最佳筛选浓度嘌呤霉素(由杀灭曲线确定)的新鲜培养基;(3)day 1:筛选第一天,去除旧的培养基,加入一定量MOI的病毒颗粒;(加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。
)(4)病毒转导后约6-8h,再添加1ml完全培养基(血清和双抗,如果已经使用双抗。
)到细胞内,然后孵育过夜;(5)病毒转导后48h,使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。
孵育。
(6)约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基;(7)每天检测细胞并观察活细胞生长比例,以及turboGFP表达的水平及所占比例。
在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。
嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。
注:病毒的MOI越高,每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。
在做嘌呤霉素筛选时,需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。
调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞,但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。
储存方法和稳定性:嘌呤霉素稳定性高,可以常温运输,收到产品后4℃存放;嘌呤霉素在室温条件下可存放3个月,4℃条件下保质期一年。
稳定株嘌呤霉素使用
使用过表达抗性慢病毒如何制备稳定细胞系?
步骤1,使用目的过表达gene-3xFLAG-IRES-puromycin慢病毒先在96孔板感染中目的细胞,可以设置3个左右不同的MOI组,待感染2-3天后,加入puromycin抗性药物进行筛选;(我们在293T细胞中puromycin维持药物浓度在5 μg/ml,2天即可杀死目的细胞;目的细胞的药物作用浓度可以参考该数值进行摸索)。
实验过程中必须设置空细胞的加药组,以确保药物的有效性。
步骤2,对具有抗药的混淆细胞感染株进行消化,稀释,然后分散在96孔板中,确保平均每孔细胞数量1个左右。
使用带有puromycin药物的培养基正常维持细胞,然后逐步放大,获得抗性稳定细胞系;
补充说明:对照病毒是GFP-3xFLAG-IRES-puromycin双标慢病毒,是带有荧光和抗性的,筛选对照稳定株的方法同步骤1和步骤2.
1。
稳定细胞株筛选药物浓度确定方法
稳定细胞株筛选药物浓度确定方法
在使用G418、潮霉素B或嘌呤霉素筛选稳定细胞系细胞之前,需要先通过梯度实验确定适合该类细胞的最佳药物浓度。
对于一些常见的细胞系,通常可以在资料中找到推荐的药物浓度。
例如Hela细胞用400 μg/ml的G41或1 μg/ml的嘌呤霉素进行稳定细胞株筛选。
用G418或潮霉素B,选用在5天左右出现细胞大批死亡,2周全部死亡的浓度作为筛选浓度。
对于嘌呤霉素,通常采用在3-4天杀死全部细胞的浓度。
不同批次的药物活性有一定差异。
因此在使用新批次药物时,需要重新测定最佳浓度。
筛选抗生素的推荐使用浓度(μg/ml)
抗生素工作范围筛选浓度维持用量
G418 50-800 400-500 100
Hygromycin 50-800 200 100
Puromycin 0.25-2 0.5-10 0.25
1、在加入筛选药物前一天将细胞以50%密度接种到6孔板。
第二天在培养基中按G418(0,50,1000,200,400,800μg/ml)或者嘌呤霉素(0,1,2.5,5,7.5,10μg/ml)加入。
2、用G418筛选处理5-10天。
每2天观察细胞一次。
每4天跟换新的有抗生素的培养基(如果有必要可以更换得更勤)。
直到得到最佳浓度。
3、用嘌呤霉素处理4-7天。
每2天跟换新的有抗生素的培养基。
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结嘌呤霉素杀灭曲线的确定(shRNA稳定转染细胞株,仅作参考)(1)24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板,铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。
细胞孵育过夜;(2)准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基(如0-15μg/mL,至少5个梯度);(3)细胞孵育过夜后加入筛选培养基,孵育细胞;(4)约2-3天更换新鲜的筛选培养基;(5)每日监测细胞观察存活细胞比例。
嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。
(6)最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。
嘌呤霉素筛选稳定转染细胞(1)day 0:24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板,孵育过夜;(2)制备筛选培养基:含有最佳筛选浓度嘌呤霉素(由杀灭曲线确定)的新鲜培养基;(3)day 1:筛选第一天,去除旧的培养基,加入一定量MOI的病毒颗粒;(加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。
)(4)病毒转导后约6-8h,再添加1ml完全培养基(血清和双抗,如果已经使用双抗。
)到细胞内,然后孵育过夜;(5)病毒转导后48h,使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。
孵育。
(6)约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基;(7)每天检测细胞并观察活细胞生长比例,以及turboGFP表达的水平及所占比例。
在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。
嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。
注:病毒的MOI越高,每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。
在做嘌呤霉素筛选时,需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。
调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞,但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。
储存方法和稳定性:嘌呤霉素稳定性高,可以常温运输,收到产品后4℃存放;嘌呤霉素在室温条件下可存放3个月,4℃条件下保质期一年。
嘌呤霉素筛选浓度 (2)
未知驱动探索,专注成就专业
嘌呤霉素筛选浓度
嘌呤霉素(Puromycin)是一种常用的抗生素,可用于筛选经过质粒转染的细胞中是否有成功表达了融合蛋白或其他感兴趣的基因。
嘌呤霉素的浓度应根据具体实验的需求和细胞的特性来进行确定。
一般来说,嘌呤霉素的浓度可以在0.5-10 μg/ml范围内进行筛选。
初始筛选通常使用较高浓度(如2-10 μg/ml),以确保只有成功表达了目标基因的细胞能够存活下来。
随后,可以逐渐降低嘌呤霉素的浓度,以获得高达100%的筛选效率。
在实验过程中,可以通过处理并荧光显微镜观察细胞的存活情况,或者进行细胞增殖和生存率的测定,从而确定最佳的嘌呤霉素筛选浓度。
实验者也可以参考文献或嘌呤霉素的使用说明来选择适当的浓度。
1。
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结一、引言简述稳定表达细胞系的重要性和应用领域阐明嘌呤霉素筛选法的原理和优势二、研究背景介绍稳定表达细胞系在生物制药、基因功能研究等领域的作用阐述嘌呤霉素筛选法在细胞系构建中的应用背景三、实验材料与方法详细列出实验所需的细胞株、质粒、嘌呤霉素等材料描述实验的基本流程,包括细胞转染、筛选、扩增等步骤四、嘌呤霉素筛选原理解释嘌呤霉素的作用机制和如何用于筛选稳定表达细胞阐述筛选过程中细胞的选择压力和适应性变化五、实验操作步骤详细描述实验的具体操作步骤,包括细胞培养、转染、筛选等提供实验操作中的注意事项和常见问题解决方案六、筛选效率与稳定性分析通过实验数据展示筛选效率,包括细胞存活率、表达水平等分析细胞系的稳定性,包括长期培养后的表达水平变化七、优化策略与改进措施根据实验结果提出优化筛选条件的建议描述改进措施,如提高转染效率、调整筛选压力等八、实验结果展示实验中获得的稳定表达细胞系的数据和图像分析实验结果,包括成功构建的细胞系数量、表达效率等九、案例研究选取几个典型的案例,详细描述筛选过程和结果分析案例成功或失败的原因,提供经验教训十、问题与挑战列出在筛选过程中遇到的主要问题和挑战分析问题产生的原因,提出解决方案十一、经验总结总结在嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系过程中积累的经验强调实验操作的准确性、条件控制的重要性十二、未来展望根据当前研究趋势,预测稳定表达细胞系构建的未来发展方向提出未来研究中可能采用的新方法和技术十三、结语强调稳定表达细胞系在生物医学研究中的应用价值表达对参与实验的团队成员的感谢十四、参考文献列出实验过程中参考的文献资料十五、附录附上实验操作的详细步骤、实验数据、图表等。
G418筛选稳定表达细胞系经验总结
G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染,从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。
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筛选之前确定G418浓度:1、由于每种细胞对G418的敏感性不同,而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同,一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物,两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因,它表达的蛋白能够分解新霉素G418。
在进行转染时细胞膜受到影响,抗生素可能对细胞产生较大影响,加上G418有杀菌作用,所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大,一般筛选时汇合度不宜超过50%4,G418的活性不尽相同,所以在筛选之前,一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下:将细胞稀释到1000个细胞/ml,在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选,选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验:3x106个细胞电转后,分别接种1/4000,1/1000,1/300细胞到24孔板中,48h后加药筛选,此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后,观察1/4000孔内有两三个克隆,按比例1/300孔内应该有几十个克隆,事实上,它们几乎全死光了,只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1,由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早;但是也不能太晚,因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大,增值较慢,时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没,最终导致筛选不出阳性克隆,一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降,所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
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G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染,从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方,大家补充。
筛选之前确定G418浓度:1、由于每种细胞对G418的敏感性不同,而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同,一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物,两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因,它表达的蛋白能够分解新霉素G418。
在进行转染时细胞膜受到影响,抗生素可能对细胞产生较大影响,加上G418有杀菌作用,所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大,一般筛选时汇合度不宜超过50%4,G418的活性不尽相同,所以在筛选之前,一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下:将细胞稀释到1000个细胞/ml,在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选,选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验:3x106个细胞电转后,分别接种1/4000,1/1000,1/300细胞到24孔板中,48h后加药筛选,此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后,观察1/4000孔内有两三个克隆,按比例1/300孔内应该有几十个克隆,事实上,它们几乎全死光了,只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1,由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早;但是也不能太晚,因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大,增值较慢,时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没,最终导致筛选不出阳性克隆,一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降,所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
筛选稳定表达细胞系经验总结
G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染,从G418 浓度确定到最后的单克隆化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方,大家补充。
筛选之前确定G418 浓度:1、由于每种细胞对G418 的敏感性不同,而且不同的厂家生产的G418 有效成分的比重不同,一般1g 的粉剂中有效的G418 含量大约为。
2、G418 是新霉素的类似物,两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418 对细菌和真核细胞都起作用。
neo 就是编码3 ‘磷酸转移酶的基因,它表达的蛋白能够分解新霉素G418 。
在进行转染时细胞膜受到影响,抗生素可能对细胞产生较大影响,加上G418 有杀菌作用,所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418 筛选结果的影响很大,一般筛选时汇合度不宜超过50%4 ,G418 的活性不尽相同,所以在筛选之前,一定要确定G418 的最佳筛选浓度。
具体如下:将细胞稀释到1000 个细胞/ml ,在100ug/ml~1mg/ml 的G418 浓度范围内进行筛选,选择出在10~14 天内使细胞全部死亡的最低G418 浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验:3x10 6个细胞电转后,分别接种1/4000 ,1/1000 ,1/300 细胞到24孔板中,48h 后加药筛选,此时1/300 细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000 孔内应有4% 的汇合度。
筛选9 天后,观察1/4000 孔内有两三个克隆,按比例1/300 孔内应该有几十个克隆,事实上,它们几乎全死光了,只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1,由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早;但是也不能太晚,因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大,增值较慢,时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没,最终导致筛选不出阳性克隆,一般要在转染之后才开24 小时始加G418 筛选。
嘌呤霉素(Puromycin)筛选稳定细胞株的步骤及方法
嘌呤霉素(Puromycin)筛选稳定细胞株的步骤及方法Puromycin 是来源于Streptomyces alboniger 的一种氨基核苷类抗生素,中文名为嘌呤霉素,常用于筛选能够表达pac 基因(puror)的细胞。
pac 基因表达嘌呤霉素N-乙酰转移酶(Puromycin N-acetyl-tranferase),如果该基因表达,就会对嘌呤霉素产生抗性,这一特性目前普遍应用于筛选表达pac 基因的哺乳动物稳定细胞株。
目前,很多商业化的慢病毒载体都携带pac 基因(一般在质粒图谱上标记为puror),可以利用嘌呤霉素的筛选,得到特定基因稳定表达的细胞株。
嘌呤霉素也可以用来筛选表达pac 基因的大肠杆菌菌株、酵母菌株等。
Puromycin 不仅能用于稳定细胞株的筛选,也用于稳定细胞株的维持。
Puromycin 的作用特点是快速作用于细胞,一般2 天内可以杀死99%的不表达pac 基因的细胞。
本产品浓度为10mg/ml,已过滤除菌,可以直接用于细胞培养。
使用说明:一、推荐工作浓度:推荐的作用于哺乳动物细胞的嘌呤霉素浓度一般为1-10μg/ml,但最佳工作浓度需要通过剂量反应曲线来确定。
二、嘌呤霉素剂量反应曲线的确定( 以shRNA )转染或者慢病毒感染为例)::嘌呤霉素的有效筛选浓度与细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢及细胞所处细胞周期等因素相关。
为了筛选到稳定表达的shRNA或感染病毒的细胞株,确定杀死未转染/感染细胞的最低浓度嘌呤霉素非常重要。
对于初次使用的细胞,一般需要通过实验来确定适合自身实验体系的剂量反应曲线(dose-response curve or kill curve)。
1、第一天:24 孔板中以5~8×10 4 cells/孔的密度接种细胞,接种够量的孔以便进行后续的剂量梯度实验。
细胞培养箱内培养过夜。
2、第二天:在培养过夜后的细胞中更换新鲜配制的筛选培养基,该筛选培养基为含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基(如0、1、2.5、5、7.5、10μg/ml 等),更换培养基后在细胞培养箱中继续培养。
(完整版)G418筛选稳定表达细胞系经验总结
(完整版)G418筛选稳定表达细胞系经验总结G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染,从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。
有⾃⼰的体会也有其他战友遇到的情况, 和⼤家分享. 没有总结好的地⽅,⼤家补充。
筛选之前确定G418浓度:1、由于每种细胞对G418的敏感性不同,⽽且不同的⼚家⽣产的G418有效成分的⽐重不同,⼀般1g的粉剂中有效的G418含量⼤约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物,两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋⽩质的合成⽽杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞⽆作⽤⽽G418对细菌和真核细胞都起作⽤。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因,它表达的蛋⽩能够分解新霉素G418。
在进⾏转染时细胞膜受到影响,抗⽣素可能对细胞产⽣较⼤影响,加上G418有杀菌作⽤,所以有⼈主张转转染时不加其它抗⽣素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很⼤,⼀般筛选时汇合度不宜超过50%4,G418的活性不尽相同,所以在筛选之前,⼀定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下:将细胞稀释到1000个细胞/ml,在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进⾏筛选,选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进⾏下⼀步的筛选试验。
⼀个具体试验:3x106个细胞电转后,分别接种1/4000,1/1000,1/300细胞到24孔板中,48h后加药筛选,此时1/300细胞孔内⼤约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后,观察1/4000孔内有两三个克隆,按⽐例1/300孔内应该有⼏⼗个克隆,事实上,它们⼏乎全死光了,只有⼏个克隆。
加药时间和维持浓度1,由于基因转染到细胞内之后要⼀段时间才能表达出蛋⽩质。
所以筛选不能太早;但是也不能太晚,因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较⼤,增值较慢,时间长了就会被没有外源基因转⼊的细胞所淹没,最终导致筛选不出阳性克隆,⼀般要在转染24⼩时之后才开始加G418筛选。
筛选稳定表达细胞系经验总结
G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染,从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方,大家补充。
筛选之前确定G418浓度:1、由于每种细胞对G418的敏感性不同,而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同,一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为。
2、G418是新霉素的类似物,两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因,它表达的蛋白能够分解新霉素G418。
在进行转染时细胞膜受到影响,抗生素可能对细胞产生较大影响,加上G418有杀菌作用,所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大,一般筛选时汇合度不宜超过50%4,G418的活性不尽相同,所以在筛选之前,一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下:将细胞稀释到1000个细胞/ml,在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选,选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验:3x106个细胞电转后,分别接种1/4000,1/1000,1/300细胞到24孔板中,48h后加药筛选,此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后,观察1/4000孔内有两三个克隆,按比例1/300孔内应该有几十个克隆,事实上,它们几乎全死光了,只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1,由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早;但是也不能太晚,因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大,增值较慢,时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没,最终导致筛选不出阳性克隆,一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降,所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
(完整版)G418筛选稳定表达细胞系经验总结
G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染,从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方,大家补充。
筛选之前确定G418浓度:1、由于每种细胞对G418的敏感性不同,而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同,一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物,两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因,它表达的蛋白能够分解新霉素G418。
在进行转染时细胞膜受到影响,抗生素可能对细胞产生较大影响,加上G418有杀菌作用,所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大,一般筛选时汇合度不宜超过50%4,G418的活性不尽相同,所以在筛选之前,一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下:将细胞稀释到1000个细胞/ml,在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选,选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验:3x106个细胞电转后,分别接种1/4000,1/1000,1/300细胞到24孔板中,48h后加药筛选,此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后,观察1/4000孔内有两三个克隆,按比例1/300孔内应该有几十个克隆,事实上,它们几乎全死光了,只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1,由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早;但是也不能太晚,因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大,增值较慢,时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没,最终导致筛选不出阳性克隆,一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降,所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结电子教案
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结嘌呤霉素杀灭曲线的确定(shRNA稳定转染细胞株,仅作参考)(1)24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板,铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。
细胞孵育过夜;(2)准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基(如0-15μg/mL,至少5个梯度);(3)细胞孵育过夜后加入筛选培养基,孵育细胞;(4)约2-3天更换新鲜的筛选培养基;(5)每日监测细胞观察存活细胞比例。
嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。
(6)最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。
嘌呤霉素筛选稳定转染细胞(1)day 0:24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板,孵育过夜;(2)制备筛选培养基:含有最佳筛选浓度嘌呤霉素(由杀灭曲线确定)的新鲜培养基;(3)day 1:筛选第一天,去除旧的培养基,加入一定量MOI的病毒颗粒;(加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。
)(4)病毒转导后约6-8h,再添加1ml完全培养基(血清和双抗,如果已经使用双抗。
)到细胞内,然后孵育过夜;(5)病毒转导后48h,使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。
孵育。
(6)约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基;(7)每天检测细胞并观察活细胞生长比例,以及turboGFP表达的水平及所占比例。
在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。
嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。
注:病毒的MOI越高,每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。
在做嘌呤霉素筛选时,需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。
调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞,但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。
储存方法和稳定性:嘌呤霉素稳定性高,可以常温运输,收到产品后4℃存放;嘌呤霉素在室温条件下可存放3个月,4℃条件下保质期一年。
G418筛选稳定表达细胞系经验总结
G418筛选稳定表达细胞系经验总结G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染,从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方,大家补充。
筛选之前确定G418浓度:1、由于每种细胞对G418的敏感性不同,而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同,一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物,两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因,它表达的蛋白能够分解新霉素G418。
在进行转染时细胞膜受到影响,抗生素可能对细胞产生较大影响,加上G418有杀菌作用,所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大,一般筛选时汇合度不宜超过50%4,G418的活性不尽相同,所以在筛选之前,一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下:将细胞稀释到1000个细胞/ml,在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选,选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
6个细胞电转后,分别接种1/4000,1/1000,1/300细胞到一个具体试验:3x1024孔板中,48h后加药筛选,此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后,观察1/4000孔内有两三个克隆,按比例1/300孔内应该有几十个克隆,事实上,它们几乎全死光了,只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1,由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早;但是也不能太晚,因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大,增值较慢,时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没,最终导致筛选不出阳性克隆,一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结嘌呤霉素杀灭曲线的确定(shRNA稳定转染细胞株,仅作参考)(1)24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板,铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。
细胞孵育过夜;(2)准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基(如0-15μg/mL,至少5个梯度);(3)细胞孵育过夜后加入筛选培养基,孵育细胞;(4)约2-3天更换新鲜的筛选培养基;(5)每日监测细胞观察存活细胞比例。
嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。
(6)最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。
嘌呤霉素筛选稳定转染细胞(1)day 0:24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板,孵育过夜;(2)制备筛选培养基:含有最佳筛选浓度嘌呤霉素(由杀灭曲线确定)的新鲜培养基;(3)day 1:筛选第一天,去除旧的培养基,加入一定量MOI的病毒颗粒;(加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。
)(4)病毒转导后约6-8h,再添加1ml完全培养基(血清和双抗,如果已经使用双抗。
)到细胞内,然后孵育过夜;(5)病毒转导后48h,使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。
孵育。
(6)约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基;(7)每天检测细胞并观察活细胞生长比例,以及turboGFP表达的水平及所占比例。
在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。
嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。
注:病毒的MOI越高,每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。
在做嘌呤霉素筛选时,需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。
调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞,但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。
储存方法和稳定性:嘌呤霉素稳定性高,可以常温运输,收到产品后4℃存放;嘌呤霉素在室温条件下可存放3个月,4℃条件下保质期一年。
细胞筛选一嘌呤霉素
细胞筛选一嘌呤霉素(一) 确定最优筛选浓度当用于筛选特定细胞的嘌呤霉素合适浓度未知时,需进行滴定,或制定针对那种细胞的嘌呤霉素杀菌曲线。
一般而言,嘌呤霉素浓度范围在2-10微克/毫升时是足以杀灭大多数未转染的哺乳动物细胞系。
1. 培养待转染(而不是转染后)的细胞。
(筛选的目的是杀灭未转染的细胞)2. 取对数生长期的细胞(一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时),用新鲜无抗无血清的培养基制成1.5×105 个/ml 的细胞悬液。
3. 向96孔培养板中加细胞悬液,每孔100微升(使每孔细胞数在1.5×104个),然后向每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量,培养箱中静置培养过夜。
(这样做是为了保证在固定细胞密度下确定最佳G418药物筛选浓度。
) 4. 第二天用嘌呤霉素浓度分别为0, 2, 4, 6, 8, 10微克/毫升的新鲜无抗无血清培养基溶液替换各孔中的旧的培养基。
(每个浓度可用两个复孔,相当于每个浓度测定三次)。
(注意:对于多数细胞种类而言,过量的嘌呤霉素能引起许多非必需的表型的反应。
) 5. 每日检查细胞活力,根据细胞活力,每三天( 即每隔两天)更换含嘌呤霉素的新鲜无抗无血清培养基溶液一次。
如细胞生长过快,可以缩短换液时间(每隔一天)。
6. 在正常的实验操作规程时,一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率和一般生存时间而定,大概需3到14天。
在所需时间之后,嘌呤霉素的导致所有细胞死亡的最小浓度就是应该用于该细胞和该实验的浓度。
最优浓度为在3-5天内杀死所有细胞的浓度。
(二) 转染细胞 1. 第一天:在60mm培养皿内种植细胞,细胞密度为能使第二天细胞融合能达到70%-80%的密度,CO2孵箱过夜培养。
2. 第二天:准备3ml无抗生素无血清培养基,加入Polybrene使其终浓度为8μg/ml。
将已经制备的病毒颗粒0.5 ml加至上述培养基,轻吹混匀。
去除60mm培养皿内的旧的培养基,加入含病毒培养基。
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嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结
嘌呤霉素杀灭曲线的确定(shRNA稳定转染细胞株,仅作参考)
(1)24孔板内以5~8x104?cells/孔的密度铺板,铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。
细胞孵育过夜;(2)准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基(如0-15μg/mL,至少5个梯度);
(3)细胞孵育过夜后加入筛选培养基,孵育细胞;
(4)约2-3天更换新鲜的筛选培养基;
(5)每日监测细胞观察存活细胞比例。
嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。
(6)最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。
嘌呤霉素筛选稳定转染细胞
(1)day0:24孔板内以5~8x104?cells/孔的密度铺板,孵育过夜;
(2)制备筛选培养基:含有最佳筛选浓度嘌呤霉素(由杀灭曲线确定)的新鲜培养基;
(3)day1:筛选第一天,去除旧的培养基,加入一定量MOI的病毒颗粒;(加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。
)
(4)病毒转导后约6-8h,再添加1ml完全培养基(血清和双抗,如果已经使用双抗。
)到细胞内,然后孵育过夜;
(5)病毒转导后48h,使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。
孵育。
(6)约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基;
(7)每天检测细胞并观察活细胞生长比例,以及turboGFP表达的水平及所占比例。
在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。
嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。
注:病毒的MOI越高,每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。
在做嘌呤霉素筛选时,需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。
调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞,但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。
储存方法和稳定性:
嘌呤霉素稳定性高,可以常温运输,收到产品后4℃存放;
嘌呤霉素在室温条件下可存放3个月,4℃条件下保质期一年。
为了达到最理想的稳定状态和最长的保质期,最好存放于-20°C,保质期为2年。
Starttoselectonpuromycin(2ug/mlfinalconcentration)3-4daysposttransfection.Massivecelldeathwillbeevi dentafter36-48hoursselectiononpuromycin.Dependentonthetransfectionefficiency,mosttransfectionwon' testablishsomepuromycin-resistantcoloniesexceptthattheretrovirus-producingcelllinesareusedforgener atingviralvector.Ifthefirstgenerationlentiviralvectorisusedinthetransfection,trytouseMo-MLVenvelopexpre ssingvector,ratherthanVSV/Gexpressingvectorforpackagingviralvectors.Thestablecolonies(trytopoolthe differentpuromycin-resistantcellcoloniestogehter,don'tmakesinglecolonyclone)willbeamplifiedafter10-14 daysselectiononpuromycin.。