医学分子生物学实验报告

医学分子生物学实验报告

日期：2012-04-14

医学分子生物学实验报告

一、实验名称：

1、质粒的提取

2、质粒DNA的限制性内切酶酶切

3、DNA琼脂糖凝胶电泳

二、实验目的：

1、掌握碱裂解法分离质粒DNA的基本原理和操作要点

2、了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法

3、学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术

三、实验原理：

质粒是一种染色体外能够稳定遗传的因子，具有双链共价闭环结构的DNA分子。是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。

碱裂解法利用宿主菌巨大线状染色体DNA与相对较小的闭环双链质粒DNA的结构的差异来提取质粒DNA。碱变性DNA时，线状基因组DNA变性充分而质粒DNA处于拓扑缠绕的自然状态而不能彼此分开。当去除变性条件时（酸中和），质粒DNA迅速准确配置重新形成完全天然超螺旋状分子，而难于复性的长链线状的基因组DNA则与破裂的细胞壁、细菌蛋白相互缠绕成大型复合物，被SDS包盖，当K+取代Na+时这些复合物会从溶液中沉淀下来，附在细胞碎片上一起被离心除去。

质粒检测：(1)电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型；（2）吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之间，说明质粒质量较好，1.8为最佳，低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染。

Ⅱ型酶识别的DNA序列一般含有4～6个核苷酸。有的在识别顺序的对称轴上对双链DNA 同时切割产生平末端；有的在识别顺序的双侧末端DNA双链产生粘性末端。Ⅱ型限制性内切酶需要Mg2+激活，大部分Ⅱ型酶所识别的序列具有反向对称的结构，或称为回文结构。质粒DNA通常都具有一个或多个限制性内切酶酶切识别序列，可被相应限制性内切酶切出相应数量的切口，从而产生相应数量的酶切片断。本实验采用的EcoRⅠ和Hind的识别序列和酶切位点分别为

GAATTC 和AAGCTT

CTTAAG TTCGAA

DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。

核酸为两性分子，在pH3.5时，整个分子带正电； pH8左右时，整个分子带负电。

在碱性环境下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，把这些核酸分

子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小，可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。共价闭环超螺旋DNA ＞直线DNA＞开环的双链环状DNA。

四、实验步骤：

(一)质粒的提取：

1、取2.0mL菌液（老师已配好）加入2.0ml的dorf管中；

2、将dorf管放进离心机用5000 r/min、离心5min，弃上清，收集菌体；

3、加入200uL溶液I+5uLRNA酶悬浮菌体（充分混匀），冰上静置5min ；

4、加入400uL溶液II（轻轻混匀），室温静置5min让裂解菌体；

5、加入300uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置5min使质粒DNA复性；

6、在4℃条件下，10000 r/min，离心10min，取700μL（注不要吸到沉淀物）上清到一新管；

7、加700μL的氯仿：异戊醇［V:V＝24:1］（混匀），冰上静置5min；

8、在4℃条件下，10000 r/min，离心10min，取500μL（注不要吸到沉淀物）上清到一新管；

9、加入1.0mL无水乙醇（充分混匀），在-20℃条件下放置20min；

10、在4℃条件下，10000 r/min，离心10min ，弃上清；

11、向沉淀物中加入500μL70%乙醇，将沉淀悬起；

12、在4℃条件下，5000 r/min离心5min，弃上清（用软纸将管内乙醇吸干）即可。（二）酶切：

取实验一中提取的质粒，向其中加入10μL灭菌的双蒸水使其充分溶解，测定其dsDNA浓度。然后按下表进行操作：

实验组对照组(不做）

Buffer 4 0

EcolⅠ 3 0

Hind Ⅲ 3 0

质粒x x

ddH2O 10-x 20-x

总体积20 20

充分混匀后于37℃保温2-3h。（注最终反应体系中质粒浓度至少达到1.2μg/μL）

由测量数据计算得：X=7

（三）DNA的琼脂糖凝胶电泳:

1、制胶—— 1.0 ％琼脂糖凝胶 (50ml)（老师已制好）

2、凝胶板的制备——用微量加样器小心加入2－3μlEB（老师已制好）

3、点样——样品20μl，与4μl溴酚兰混匀( DNA maker 3μl 加入10μl水与4μl溴酚兰混匀)

4、电泳——稳压 80v，DNA向阳极移动, 大约50-60min

5、观察和拍照——在254nm紫外灯下观察

五、实验数据和结果：

六、注意事项：

1、质粒提取过程必需缓和，不能剧烈振荡。

2、操作过程避免污染，反应体系中各试剂用量准确。

3、EB是一种诱变剂，操作时必须戴塑料或乳胶手套!

4、操作过程避免污染，反应体系中各试剂用量准确。

七、思考题：

1.琼脂糖凝胶电泳的适用范围？

答：电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。

2.影响琼脂糖凝胶电泳的因素有哪些？

答：DNA的分子大小、琼脂糖浓度、DNA的分子构象、电源电压、嵌入燃料的存在、离子强度影响。

3.影响限制性酶切的因素有哪些？

答：DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。

4.结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率？

答：（1）提高DNA的浓度，尽量将其中的蛋白质除尽；（2）因为不同限制性内切酶对NaCl 浓度的要求不同，可以先用要求低盐缓冲液的限制性内切酶消化DNA，然后补足适量的NaCl，再用要求高盐缓冲液的限制酶消化；（3）要有适宜的温度，一般在37度左右；（4）DNA分子构型对核酸内切限制酶的活性有很大影响，如消化超螺旋的DNA比消化线性DNA用酶量要高出许多倍，可以改变DNA的构象，使其简单化。

5.限制性内切酶在基因工程中有什么作用？

答：一是限制性核酸内切酶可以切割目的基因和载体，以便于连接之后导入载体；其二是检测过程的方法是很多的，其中之一就是酶切法，简而言之就是选用适当的酶进行酶切，电泳后观察酶切片段数量和大小，与预计的是否相符就可初步判断受体中有无目的基因，选择不同的酶多做几次，还可初步判断目的基因在操作过程中有无突变。

6.实验（一）中溶液1、2、3各起什么作用？

答：溶液I作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活；

溶液II作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性；