发酵种子制备与发酵机制

基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。
湿度
❖ 湿度低，孢子生长快； ❖ 湿度大，孢子生长慢
制备土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子时 发现，在含有少量水分的试管斜面培养基下 部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速 蒸发呈干瘪状，孢子稀少
通气与搅拌
❖ 足够的通气量，以保证菌种代谢正 常，提高种子的质量
➢ 应考虑与发酵培养基的主要成分相近。
pH
❖ 选择最适种子培养pH的原则是获得 最大比生长速率和适当的菌量
❖ 培养最后一级种子的培养基的pH应 接近于发酵培养基的pH，以便种子 能尽快适应新的环境
种龄与接种量
❖ （一）种龄
➢ 种子罐中培养的菌体从开始移入下一级种 子罐或发酵罐时的培养时间
➢ 种子培养期应取菌种的对数生长期为宜， 菌种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而 且会降低产量。
注意事项 ① 适合采用碳源限量而氮源丰富的培
养基 ② 培养温度多为37 ℃ ，少数为28
℃ ，培养时 间细菌菌体为1~2天， 产芽孢的细菌为5~10天
II.种子制备
概念：指将固体培养基上培养出的孢 子或菌体转入到液体培养基种培养， 使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。
摇瓶种子 ＋ 种子罐种子
1. 摇瓶种子制备
一是成本
二是驯化
例：柠檬酸发酵 （黑曲霉）
以蔗糖为原料
成分
斜面
麦芽汁 蔗糖
NH4NO3 K2HPO4 MgSO4.H2O KCl 琼脂
麦汁 2%
种子罐 发酵
2.5-5% 0.225% 0.03% 0.025%
20% 0.11%
0.025% 0.015%
薯干粉
成分
麦芽汁 薯干粉 (NH4)2SO4 琼脂
❖ 种子罐培养一获得足够的菌种数量，二 种子 罐的培养基接近发酵罐培养的醪液成分和培养 条件，使菌体适应发酵环境
❖ 种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制， 并减少由于多次转种而带来的染菌机会以及 减少因种子罐生长异常而造成的发酵波动
❖ 但考虑能否在一定时间内获得优质、足量的 种子以满足发酵的需求
一.发酵级数的确定
种子扩大的级数：制备种子需逐级扩 大培养的次数 级数愈少，愈利于简化工艺及控制， 并可减少种子罐污染杂菌的机会，减 少消毒及值班工作量，减少因种子罐 生长异常而造成的发酵波动。
一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时， 工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数
谷氨酸：三级发酵 （谷氨酸棒杆菌） 一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵
❖ 不产孢子的菌种，保藏基础上，在一定温度 下活化即可
两个过程：在固体培养基上生产大量 孢子的孢子制备过程和在液体培养基上 生产大量菌丝的种子制备过程
孢子的产生条件？
I. 孢子制备 （1）放线菌孢子的制备
A .工艺过程
母
子
菌
斜
斜
种
面
面
摇
种
发
瓶
子
酵
种
罐
罐
子
B. 注意事项
① 限制碳源(约1%)和氮源(不超过0.5%) ② 培养温度多为28 ℃ ，少数为37 ℃ ，培
二、青霉素生产的ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ子制备 制备过程
安培管 → 斜面孢子 → 大米孢子
→ 一级种子 → 二级种子
→ 发酵
1、斜面孢子 培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等 培养条件：25℃、7天, 注意湿度50%左右
培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细
2、大米孢子 培养基：大米及氮源（玉米浆） 培养条件：25℃、7天，控制湿度
生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次
2. 一级种子（摇瓶）
培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1%
培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32℃培 养12小时。
培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基
培养基
❖ 培养种子的目的：
➢ 扩大培养，增加细胞数量； ➢ 同时也必须培养出强壮、健康、活性
高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂 或菌丝快速生长。
种子培养基特点
❖ 有较完全和丰富的营养物质，糖分少，需充足 氮源和生长因子，无机氮源比例大； ➢ 各种营养物质的浓度不必太高； ➢ 供孢子用的种子培养基，可添加易被吸收利 用的碳源和氮源；
培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表 面积和氧的传质，营养适当（要求大米 的白点小）有利于孢子的生长。
大米孢子的要求：1粒米含1.4*106个孢子
3、一级种子 培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆
培养条件：27℃，40小时 接种量：200亿孢子/吨 目的：长菌体 4、二级种子 培养基：同上 培养条件：27℃、10-14小时 接种量：10%
斜面 麦汁
2%
种子罐 发酵
10% 22-28% 0.5%
种子制备过程举例
一、谷氨酸生产的种子制备 制备过程 斜面菌种 →一级种子培养 →二级种子培养
→发酵
1、斜面
培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%， pH 7.0-7.2
培养条件：32℃，生长18-24小时
培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细
原材料质量
❖ 原材料质量波动引起种子质量不稳定 ❖ 原材料质量波动的主要原因：无机离子
含量不同（微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+ 能刺激孢子的形成，磷含量太多或太少 也会影响孢子的质量）。
培养温度
❖ 温度过低，菌种生长发育缓慢 ❖ 温度过高会使菌丝过早自溶
在制备土霉素生产种子过程中，高于37℃培养时， 孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨
1。生产车间阶段种子培养物的 选择原则
在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。
菌丝体比孢子要有利： 缩短发酵时间 有利于获得好的发酵结果
目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应 首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所 以营养要比发酵培养基丰富。
在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于 发酵培养基，这有两个方面的原因:
种子的质量要求
菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于 Ⅲ—Ⅳ期
青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，1-4为年青期， 4-6期合成青霉素的能力最强
四.影响种子质量的因素
培养基，培养条件，种龄，接种量：
❖ 原材料质量 ❖ 培养温度 ❖ 湿度 ❖ 通气与搅拌
❖ 斜面冷藏时间 ❖ 培养基 ❖ pH
青霉素：三级发酵 一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵
发酵级数确定的依据
级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响
级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般2-4级。
在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面
发酵级数确定方法
菌种的性质(如菌种传代后的稳定性) 瓶中的孢子数，孢子发芽及菌丝繁殖速度 发酵罐中种子培养液的最低接种量 种子罐与发酵罐的容积比 生产规模 随工艺条件的改变作适当的调整
A. 孢子发芽或菌丝繁殖缓慢的菌种需将孢 子经摇瓶培养成菌丝后再进入种子罐， 摇瓶具有浓缩种子罐的作用，其培养基 配方和培养条件与种子罐相似。
B. 种子培养基营养应丰富完全，易被菌体 利用，浓度不宜过高
2 .种子罐种子制备
A. 孢子或摇瓶菌丝被接入体积较小的种子罐中，培养 后形成的大量菌丝，这种种子称为一级种子
种子扩培的目的
接种量的需要 菌种的驯化 缩短发酵时间、保证生产水平
优良种子应具备的条件/种子的 要求：
➢ 生长活力强，延迟期短；(接种后在发酵罐
中能迅速生长)
➢ 生理状态稳定； ➢ 浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量的要求； ➢ 无杂菌污染，保证纯种发酵； ➢ 适应性强，生产能力稳定
种子制备原理与技术：
B. 把一级种子转入发酵罐中发酵，称为二级发酵
❖ 种子扩大培养阶段
➢ 液体培养法：液体试管、三角瓶摇床 振荡或回旋式培养。
➢ 表面培养法：茄子瓶、克氏瓶或瓷盘 培养。
➢ 固体培养法：三角瓶、蘑菇瓶、克氏 瓶、培养皿等麸皮培养。
实验室阶段种子培养物选择的原则
A. 目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最 终的培养物可分为两类：
生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为
发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。
(一)实验室种子制备
❖ 无菌方式接保藏的菌种至斜面培养基上，成 熟后挑选正常菌落至试管斜面和摇瓶。
❖ 菌种产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖迅 速，可用固体培养基培养孢子
❖ 菌种产孢子能力不强或孢子发芽慢，可用摇 瓶液体培养法
❖ 搅拌可提高通气效果，促进生长繁 殖，过度搅拌导致培养液大量涌泡， 液膜表面的酶易氧化变性，泡沫过 多增加染菌机会，增加能耗。
❖ 丝状微生物不宜剧烈搅拌。
斜面冷藏时间
❖ 对孢子的生产能力有较大影响 ❖ 冷藏时间越长，生产能力下降越多
链霉素生产中，斜面孢子在6℃冷藏两 个月后的发酵单位比冷藏一个月的降低18％， 比冷藏3个月的降低35％。
二.种子质量的判断方法
❖ 通常检测的培养液中参数 ➢ pH是否在种子要求的范围之内 ➢ 糖、氨基氮、磷酸盐的含量 ➢ 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 ➢ 有无杂菌污染
❖ 其他参数，如接种前酶活、种子罐的溶氧和 尾气等
种子制备
❖ 步骤： ➢ 斜面培养基中活化； ➢ 扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培 养，完成实验室种子制备 ➢ 一级种子罐，制备生产用种子；视情况 确定扩大级数，完成生产车间种子制备； ➢ 种子转种至发酵罐
本章内容：
种子制备原理与技术 影响种子质量的因素 种子质量的控制措施 种子制备的放大原理与技术