核移植技术与动物克隆

第八章 核移植技术与动物 克隆
细胞核移植的构想最早由德国胚胎学家 Spemann提出，经过几十年的努力，细胞 Spemann提出，经过几十年的努力，细胞 核移植技术不断发展，尤其是哺乳动物体 细胞克隆动物“多莉”的诞生，使细胞核 移植技术得到更加广泛的关注，成为生命 科学研究的热点。利用核移植技术产生的 克隆动物可以用于药物生产、优良畜种的 培育和扩大、拯救濒危动物及治疗性克隆 的研究。
8.1 核移植技术 8.1.1 核移植技术的类型 根据细胞核移植对象的不同，可将核移 植技术分为: 植技术分为: 胚胎细胞核移植技术; 胚胎细胞核移植技术; 干细胞核移植技术; 干细胞核移植技术; 体细胞核移植技术等。
1．胚胎细胞核移植 胚胎细胞在分化程度上远比体细胞低， 早期胚胎细胞核具有发育的全能性 ，胚胎 干细胞体外培养寿命比胎儿细胞和成体细 胞要长。因此，以胚胎细胞作为核供体进 行核移植容易成功 ，胚胎干细胞是克隆哺 乳动物供核细胞最佳来源。
4．激活 卵母细胞受精后，会引起细胞质内Ca2+浓 卵母细胞受精后，会引起细胞质内Ca2+浓 度的上升和持续震荡， 度的上升和持续震荡，如果用人工的方法 引起细胞质内Ca2+浓度的上升和持续震荡 浓度的上升和持续震荡， 引起细胞质内Ca2+浓度的上升和持续震荡， 也能激活卵母细胞。 也能激活卵母细胞。 有电激活和化学试剂激活等方法。 有电激活和化学试剂激活等方法。
8.1.2 核移植技术的一般操作程序 核移植克隆哺乳动物的技术操作过程主 要包括： 细胞核移植的基本程序： MⅡ卵母细胞的去核、核供体的准备、细胞 周期的调控、细胞融合、卵母细胞的激活 和重构胚的培养。
图8.1 克隆羊“多莉”的 培育
1、供体细胞的准备 可以是胚胎细胞、ES 细胞、ES样细胞、胎儿成 可以是胚胎细胞、ES 细胞、ES样细胞、胎儿成 纤维细胞、未分化的PGCs或高度分化的成年动 纤维细胞、未分化的PGCs或高度分化的成年动 物体细胞。 1）、胚胎细胞作为核供体 从2细胞期到内细胞团的胚胎细胞都有发育全能性， 可以作为供体细胞。但重构胚的发育能力随供体 胚龄的增加而降低，在哺乳动物的胚胎移植中， 一般选择16-32细胞期的胚胎细胞作核供体效果最 一般选择16-32细胞期的胚胎细胞作核供体效果最 好。
3．细胞核移植 常用的核移植方法有两种，即胞质内注 射和透明带下注射。胞质内注射是用一个 外径5 8µm的注核针吸取供体核后直接注 外径5～8µm的注核针吸取供体核后直接注 射进卵母细胞胞质内的方法。透明带下注 射则是把供体细胞核注射在透明带与卵母 细胞之间的卵周隙中，核移植后用电刺激 进行细胞融合。
8.2 核移植技术的应用 8.2.1 核移植技术的应用 1．制备转基因克隆动物，进行生物药物生产 制备转基因克隆动物， 2．培育优良畜种，扩大良种种群 培育优良畜种， 3．开展稀有动物克隆，拯救濒危动物 开展稀有动物克隆， 4．与干细胞技术结合。开展治疗性克隆 与干细胞技术结合。 5．利用核移植技术，研究生物学的基本问题 利用核移植技术，
将卵母细胞切成两半，然后拿不含极
体的一半来进行核移植。 3）荧光引导去核法 用Hoechst33342对卵母细胞进行染色，然后 Hoechst33342对卵母细胞进行染色，然后 在荧光显微镜下确定其位置，然后去核。 4）微分干涉和极性显微镜法 对于含脂肪颗粒少的卵母细胞，可以在微分 干涉显微镜下观察到染色体，将其去除，而 对于含脂肪多的卵母细胞 ，可以在极性显微 镜法观察到纺锤体，然后去除。
6．胚胎移植 重组克隆胚胎移植的受体母畜要选择皮 毛颜色与供体品种不同、繁殖性能强、体 格稍大的当地品种，进行同期发情处理， 按常规方法移植代孕母畜(寄母) 按常规方法移植代孕母畜(寄母)的子宫中， 待其发育到产仔。
细胞周期对细胞核移植胚胎的发育有重要 的影响，一般以未激活的去核卵母细胞为 受体时，以G1期核作供体为宜；当供体核 受体时，以G1期核作供体为宜；当供体核 细胞周期不同步化时，应采用激活的卵母 细胞为受体。
2．体细胞核移植 1997年，Wilmut在其同事 Campbell等 1997年，Wilmut在其同事 Campbell等 人研究的基础上，对细胞核移植技术进行 大胆改进，用乳腺细胞核作为核供体，移 植培育成功克隆绵羊“多莉”。Wilmut等 植培育成功克隆绵羊“多莉”。Wilmut等 建立的一整套绵羊体细胞核移植技术，如 恢复体细胞核全能性的“血清饥饿法”、 体细胞的传代阶段确定以及体细胞克隆后 代与亲本核供体间的 DNA微卫星分析技术， DNA微卫星分析技术， 后来成为进行同类研究普遍采用的基本技 术，并相继克隆出绵羊、牛、小鼠、山羊 等。
①血清饥饿法 ②接触抑制 ③APD 是哺乳动物DNA 聚合酶的可逆性抑 是哺乳动物DNA 制剂，可将细胞核停留在G1到 制剂，可将细胞核停留在G1到S期的过渡 阶段。 3）胚胎干细胞作核供体。 有发育全能性，二倍体，是动物克隆的理 备 有：去核受精卵 去核M 去核MⅡ期卵母细胞 卵母细胞的去核方法： 1） 盲吸法 在第一极体排出后不久，染色 体位于极体附近，用显微去核针吸去极体 附近的细胞质就可以除去细胞核。 2）半卵法
5）功能性去核法 用Hoechst33342染色，然后用紫外线照 Hoechst33342染色，然后用紫外线照 射核区，使核丧失功能。 6）离心去核法 7）化学试剂去核法 用Etoposkle和放线菌酮处理位于第一次减数 Etoposkle和放线菌酮处理位于第一次减数 分裂的卵母细胞，处理后，染色体结合紧 密，不容易分开，在卵母细胞排出第一极 体时，染色体复合体一起排出。
供体细胞和受体细胞的细胞周期对核移植 胚胎的发育率也有重要的影响。 细胞周期的调控方法： 1）细胞微管抑制剂Nocodazole可将供体细 ）细胞微管抑制剂Nocodazole可将供体细 胞核停留在M 期，去掉Nocodazole后，大 胞核停留在M 期，去掉Nocodazole后，大 部分细胞核会处于G1期。 部分细胞核会处于G1期。 2）体细胞作核供体 也需要细胞周期的调控
5．重组胚的体内或体外培养 经融合和激活的重组胚移入中间受体作 体内或体外培养，观察重组胚的发育率。 羊、牛、猪的核移植胚常采用体内培养方 法获得桑椹胚和囊胚。猪的核移植重组胚 移入同期化受体母猪输卵管内作体内培养7 移入同期化受体母猪输卵管内作体内培养7 d，发育为扩张囊胚。大鼠、小鼠和兔的核 移植胚多作体外培养，发育至桑椹胚或囊 胚。
8.2.2 核移植技术存在的问题 一是成功率低，只有1％～5 的较低水平，存在畸胎、 一是成功率低，只有1％～5％的较低水平，存在畸胎、 死胎、难产、新生动物死亡率高等一系列问题； 死胎、难产、新生动物死亡率高等一系列问题； 二是核移植的理论研究相对于技术研究而言较为滞 跟不上技术发展的步伐，需要与发育生物学、 后，跟不上技术发展的步伐，需要与发育生物学、细胞生 物学及分子遗传学等新兴学科的更深层次的理论工作的结 合； 三是体细胞克隆后代有可能出现老化现象， 三是体细胞克隆后代有可能出现老化现象，体细胞 分裂代数是有限的， 分裂代数是有限的，因此由体细胞得到的克隆动物的寿命 是否会受到体细胞分裂代数的影响，目前也不是很清楚； 是否会受到体细胞分裂代数的影响，目前也不是很清楚； 四是核移植的技术环节尚需不断完善， 四是核移植的技术环节尚需不断完善，克隆技术研 究本身需要与其他学科和技术进行更为广泛的渗透与融合。 究本身需要与其他学科和技术进行更为广泛的渗透与融合。