毕赤酵母实验操作手册

毕赤酵母表达实验手册

大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。

大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵间题［1］。

与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的们对酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外宿主．1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得素和胰岛素已大量生产并在人群中广泛应用，但很大部分表达由实验室扩展到工业规模时，培养基数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降，而大多数外源基因的高效表达需要高拷贝数的量下降。同时，实验室用培养基复杂而昂贵，采用工业规模能够接受的培养基时，往往导致产量的酵母的局限，人们发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源

来发展最为迅速，应用也最为广泛，已利用此系统表达了一系列有重要生物学活性的蛋自质。毕赤用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点［1、2、3］；

⑴具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一。

⑵表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合。（即同源重组）

⑶菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。

⑷毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞 Pichia.pastoris基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统，具表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。利用AOX1，已高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素 C片段、基因工程抗体等多种外源基因，证实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜子扩目前美国FDA已能评价来自该系统的基因工程产品，最近来自该系统的Cephelon制剂已获得FDA 认为是安全的． Pichia.pastoris表达系统在生物工程领域将发挥越来越重要的作用，促进更多外高效表达，提供更为广泛的基因工程产品［2、3］。

近年来，Invitrogon公司开发了毕赤酵母表达系统的系列产品，短短几年已经有300多种外源有效表达，被认为是目前最有效的酵母表达系统。

毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。其中，GS115茵株具有＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点被ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓适用于一般的酵母转化方法。

Pichia.pastoris酵母菌体内无天然质粒，所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外合于染色体中以实现外源基因的表达［5］．包括启动子、外源基因克隆位点、终止序列、筛选标记穿梭质粒，先在大肠杆菌复制扩增，然后被导入宿主酵母细胞。为使产物分泌胞外，表达载体还需毕赤酵母表达系统有多种分泌型表达质粒，有许多蛋白在毕赤酵母得到了高效分泌表达。胞外白的N末端加上一段信号肽序列，引导重组蛋白进入分泌途径，可使蛋白蛋白质在分泌到胞外之后毕赤酵母对外源蛋白自身的信号序列识别能力差，在本试验中所使用pPICZαA质粒，其信号肽来

配因子（α-factor），能很好的达到以上的要求。并且作为新一代的毕赤酵母分泌表达质粒，它还具有Zeocin抗性标记基因，给我们筛选转化子的工作带来很大的便利［1、2］。

pPICZαA质粒是作为新一代的毕赤酵母分泌表达质粒，它的主要特点简介如下：

⑴具有强效可调控启动子AOX1（alcohol oxidase，醇氧化酶）；

⑵具有Zeocin抗性筛选标记基因，重组转化子可直接用Zeocin进行筛选，即在YPDZ平板上生长都有外源基因的整合，大大简化了重组转化酵母的筛选过程［5］。在操作过程中，Zeocin也可用pPICZαA的大肠杆菌转化子，不必另外使用Amp，经济而又简便；。

⑶在表达载体A0X1 5’端启动子序列下游，有供外源基因插入的多克隆位点，多克隆位点下游有列；

⑷分泌效率强的信号肽α-factor.

Invitrogen公司开发的毕赤酵母表达系统的系列产品作为目前被应用为最为广泛的酵母表达有：醇氧化酶可调控的强启动子，能高密度发酵，重组蛋白表达量高。外源基因整合在酵母基因组同时，高效分泌表达质粒能将外源蛋白表达后，进行翻译后加工处理，将外源蛋白分泌到细胞外，的活性，而且，有利于产物的纯化。

一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制

1．1 各种母液的配制

10*YNB （含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基） 4℃保存。34g酵母基础氮源+100g硫酸铵，溶于1000ml水中，过滤除菌。

500*B （0.02%生物素 Biotin） 4℃保存保存期为1年。20mg的生物素溶于100ml水100*H （0.4%Histidine 组氨酸） 4℃保存保存期为1年。400mg的L-组氨酸溶于100 50℃以促进溶解），过滤除菌。