克隆载体及其主要功能
第三章 克隆载体的特征及类型
质粒
质粒DNA的分离纯化
氯化铯密度梯度离心法： 用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加CsCl和溴乙锭 超速离心过夜 在紫外灯下吸取cccDNA 稀释沉淀cccDNA RNAs ocDNA L-DNA proteins
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
pGEM-3Z： 多拷贝 装有多克隆位点（MCS） 正选择颜色标记 lacZ’ 装有两个噬菌体的强启动子 用于外源基因的高效表达
ori Apr
pGEM-3E 2743 bp lacZ’
PT7
MCS
PSP6
注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合 酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如： E.coli BL21（DE3）等
质粒
质粒的基本特征
质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制 控制复制引物与模板的结合
RNA II
3’ 5’
复制方向
5’ 3’
ori
RNA I
rop
（+） Rop
E.coli ColE1 plasmid
RNAII是复制的正向调节分子，RNAI是复制的负调节物
质粒
质粒的基本特征
在重组的 pGEM3Z载体中 加入相应的RNA 聚合酶，可以 发生外源基因 转录。
质粒
质粒DNA的分离纯化
实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA： 氯化铯密度梯度离心法
质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染
沸水浴法
质粒DNA纯度底、快速、操作简便
碱溶法 质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间
拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，
载体的构建
基因工程所用的克隆载体常称之为分子克隆载体（molecular cloning vector），它是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞的DNA分子。
如果打一个十分浅显的比喻，分子克隆载体犹如航天技术中的运载火箭，外源DNA分子就如火箭上搭载的卫星，宿主细胞则如外部深邃的空间。
分子克隆载体的主要功能就是将外源基因携带入宿主细胞，并在宿主细胞中进行DNA扩增和使外源基因得以高效表达。
在这一点上又与火箭不一样，因为火箭在运载卫星的过程中分级脱落和烧毁。
尽管克隆载体是由DNA分子所构成，但与宿主细胞的染色体DNA分子相比，它们一般都比较小。
比如常用的质粒载体多数都在10 kb以下，而常用的噬菌体载体，一般都在20 kb 左右。
我们知道，大肠杆菌的染色体DNA是4200kb。
正是由于克隆载体的分子量比较小，在操作过程中不会造成载体DNA分子的断裂，而大分子的DNA容易在操作中发生断裂。
克隆载体的基本结构和功能在短短的20年间，用于不同生物和不同目的的分子克隆载体至少也有好几千种，那么它们应该有些什么样的基本结构呢？经过仔细分析发现，所有的分子克隆载体都具备了以下3个最基本的结构：1）至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制；2）至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入；3）至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA 分子是否进入宿主细胞。
既然说每一个载体至少应有一个复制起点，一个克隆位点和一个标记基因，那么一个载体可否有多个复制起点，多个克隆位点和多个标记基因呢？答案是肯定的。
不过，我们还是先看看载体中的三个基本结构克隆载体的复制起点由于DNA的复制是始于复制起点的，因此只要一个DNA分子有了复制起点，那么这个DNA分子就可以自主复制。
如果一个分子克隆载体有了复制起点，那么该载体就可以在某种生物的细胞中自主复制，因此这个载体就可以多拷贝地存在于某种细胞内。
多拷贝DNA有两个好处：一是可以用于大量制备克隆载体DNA分子，以利于外源基因的克隆，这样可大大减少工作量；二是如果载体中插入了外源基因，那么外源基因的拷贝数也就大量增加了，这就有利于大量地表达外源基因，从而获得大量的基因表达产物，这也正是基因工程的目的之一。
实验室克隆技术解析
实验室克隆技术解析实验室克隆技术是一种重要的生物技术手段，它可以通过复制和重组DNA分子，实现对生物体的复制和改造。
本文将对实验室克隆技术进行详细解析，包括克隆的原理、方法和应用。
一、克隆的原理实验室克隆技术的原理是基于DNA的复制和重组。
DNA是生物体遗传信息的载体，通过复制和重组DNA分子，可以实现对生物体的复制和改造。
克隆的原理主要包括以下几个步骤：1. DNA提取：从目标生物体中提取DNA分子，通常使用化学方法或者机械方法进行提取。
2. DNA复制：将提取到的DNA分子进行复制，通常使用聚合酶链式反应（PCR）或者细菌的DNA复制机制进行复制。
3. DNA重组：将复制得到的DNA分子与载体DNA进行重组，通常使用质粒或者病毒作为载体。
4. 转化：将重组后的DNA分子导入到宿主细胞中，使其表达目标基因。
二、克隆的方法实验室克隆技术有多种方法，常用的方法包括限制性内切酶切割、DNA 连接、转化和筛选等。
1. 限制性内切酶切割：限制性内切酶是一种能够识别特定DNA序列并切割DNA分子的酶，通过限制性内切酶的作用，可以将DNA分子切割成特定的片段。
2. DNA连接：将切割得到的DNA片段与载体DNA进行连接，通常使用DNA连接酶进行连接。
3. 转化：将连接后的DNA分子导入到宿主细胞中，使其表达目标基因。
转化的方法有多种，包括化学法、电穿孔法和冷冻法等。
4. 筛选：通过筛选方法，筛选出含有目标基因的克隆体。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选和PCR筛选等。
三、克隆的应用实验室克隆技术在生物学研究和生物工程领域有着广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：1. 基因功能研究：通过克隆技术，可以将目标基因导入到宿主细胞中，研究其在生物体中的功能和作用机制。
2. 基因工程：通过克隆技术，可以将外源基因导入到宿主细胞中，使其表达目标蛋白质，用于生物制药和农业改良等领域。
3. 基因治疗：通过克隆技术，可以将正常基因导入到患者的细胞中，修复或替代异常基因，用于治疗遗传性疾病。
第三章 基因克隆载体
（2）中间质粒克隆载体 T-DNA的部分序列插入大肠杆菌质粒载体而构建。 共整合克隆载体系统（T-DNA同源序列、bom 位点） 双元克隆载体系统——微型Ti质粒
（四）乳酸杆菌质粒克隆载体（略）
乳酸杆菌：G+，非致病，益菌生，用于食品和饮料。 质粒宿主范围广泛：可用于其它G+菌及大肠杆菌。 构建： 乳酸杆菌本身对km、Ap抗性较强。 标记基因： 选用lacZ，如有pLJ1复制启始位点的
一、质粒适于载体构建的性质
１、组成与构型 质粒(plasmid)是染色体外裸 露的双链DNA分子（细菌、真 菌、蓝藻、绿藻）
l-DNA 构型： oc-DNA
２、分子大小： 100～102 kb
３、复制 特点：在宿主细胞内进行单向复制。 质粒和宿主细胞双重遗传系统控制复制强度： 拷贝数（细胞内质粒与染色体数量之比值） （１）每种质粒在其宿主细胞内的拷贝数相对稳 定。
BR：两位主要构建者 322：实验编号
ColE1 松驰型 ，筛选系统复杂。衍生的pMB1 为出发质粒（松弛型复制起始位点，但缺较好 的选择标记基因和克隆位点）。
pSC101（最早用于DNA克隆的载体），严紧 型，含有Tcr 基因。
构建过程(出发质粒：pMB1)
R1（沙门氏菌中分离） 变异 R1drd19
这是Ti质粒用于遗传转化的理论依据。
用野生型Ti质粒获得的转基因植物细胞 只能分裂，不能分化为植株，故不能直接选 育转基因植物。
（2）Vir区
位于T-DNA区上游，其表达产物可激活TDNA的转移，显示致瘤性。
（3）Con区
含有农杆菌之间接合转移有关的基因（tra)， 可受宿主产生的冠瘿碱活化，使Ti质粒在细菌 间转移，也即接合转移基因编码区。
(整理)克隆载体与表达载体
一部分：概念解析二部分：问题解答克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
DNA分子克隆技术(也称基因克隆技术)
DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）：在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。
其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。
载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。
主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。
载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。
质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。
最常用的质粒是pBR322。
基因库的建造含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。
其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA 的连接；（4）包装和接种。
cDNA库的建造是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。
cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。
特异基因的筛选常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。
核酸序列测定DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。
克隆载体
青霉素抗性检测、蓝白斑筛选(重组表型检测标记)
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三个显著区别：
1. 分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有更 高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）
2. 含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα，可利 用-互补原理进行蓝白筛选
3. 多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构成
第一节 载体简介 第二节 克隆载体* 第三节 人工染色体载体 第四节 表达载体
概念：携带目的基因进入宿主细胞进行复制、扩增和 表达的工具称载体（Vector）;即用于克隆、运载和转移目的基 因并能自我复制的DNA分子
一个DNA片段只有与合适的载体DNA连接构成重组 DNA后，才能高效地进入宿主细胞，并在其中复制、扩增
3. 加入选择性标记：通过质粒间的重组使质粒携带合适标 记，常用的有抗生素抗性标记。如：氨苄青霉素抗性标 记、四环素抗性标记、卡那霉素抗性标记等
4. 安全性能改造：不能随便转移，以免污染环境 5. 改造或增加基因表达的调控序列：比如加入强启动子
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11
4363bp
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Ampr
3. 加装选择标记
如加入lacZ’ 使受体细胞在裂解之后形成蓝色透明圈
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B. λ噬菌体载体分类
1. 插入型载体: 仅有一个可供外源DNA插入的克隆位点，如λgt系列 只能插入较小的外源DNA片段（小于10kb）
cos
cos
LA
RA
EcoRI
2. 替换型载体：具有两个对应的酶切克隆位点
噬菌体还有一大优点，即使它的DNA丢失25％仍不失活， 这部分丢失的空档正好可以装载外源DNA
基因工程考试重点
第一章1.基因工程：通过工具酶，在体外将目的基因、基因片段或其他DNA元件进行切割，与适当的载体进行连接和重组，导入相应的受体细胞，并使外源基因进行复制和表达，定向改造受体生物性状或获得表达产物。
2.一个克隆：从一个亲本细胞增殖而来的细胞群体。
3．1997年转基因番茄上市，俗称“百日鲜”。
4．DNA的组成：五碳糖，即脱氧核糖；磷酸基团；4种含氮碱基。
5．RNA聚合酶：核心酶和σ因子。
转录终止子：依赖ρ因子，不依赖ρ因子。
6．起始密码：AUG终止密码：UAA,UAG,UGA7.亚克隆：初始克隆中的外源DNA片段往往较长，含有许多目的基因以外的DNA片段，在诸如表达、序列分析和突变等操作中不便进行，因此必须将目的基因所对应的小段DNA 找出来，这个过程就叫亚克隆。
8．原核生物基因组成：启动区，SD区，基因区，转录终止子和终止因子；真核生物基因组成：转录启动区，基因区，转录终止子。
结构基因：转录启动区，核糖体识别区，编码区，转录终止区。
第二章1.限制作用实际就是限制酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。
2.甲基化是常见的修饰。
宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。
3.命名：依次取宿主属名第一字母、种名头两个字母、菌株号、序号（罗马字）。
4限制与修饰系统的比较Ⅱ （所占比例最大）Ⅰ Ⅲ酶分子内切酶与甲基化酶三亚基双功能酶二亚基双功能酶分子不在一起识别位点 4-6bp, 大多数为二分非对称 5-7bp 非对称回文对称结构切割位点在识别位点中或无特异性，至少在在识别位点下游 24-26bp 靠近识别位点识别位点外 1000bp限制反应与分开的反应互斥同时竞争甲基化反应限制作用是否是是否需用 ATP5.识别序列(大都为回文对称序列) 识别的长度一般为4-8个碱基，6个为常见。
EcoRⅠ G↓AATTC Hind Ⅲ A↓AGCTT BamHⅠG↓GA TCC6.同裂酶：识别相同序列的限制酶称为同裂酶，但它们的切割位点可能不同。
第三章 基因克隆载体
基因克隆载体(gene cloning vector): 能承 载外源基因，将其带 入受体细胞得以稳定 维持的DNA 分子。
克隆载体的功能
运送外源基因高效转入受体细胞。 为外源基因提供复制能力或整合能力。 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
克隆载体具备的条件：
载体越小越好。 >10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。
② 双抗菌素抗性选择标记
插入失活，分两次先后选择：
没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。
插入失活筛选法
pBR322质粒载体的筛选
③ 高拷贝数
氯霉素扩增之后，每个细胞可达 1000~3000copy
OC
SC
L
1.1.2 质粒的分类
1）根据质粒自身传递的性质分为： 接合型质粒 能自我转移
非接合型质粒 不能自我转移
接合型质粒
又叫自我转移型质粒。
除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有
一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。 如：F质粒（性质粒、或F因子）： 能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先 不存在该质粒的受体菌中。
简称phage 。
蛋白质外壳内包裹着 DNA（双链、单链、 线性、环状等）。
2 噬菌体载体
2.1 噬菌体的一般特性 2.2 λ噬菌体载体的构建 2.3 λ噬菌体载体的类型
2.1 噬菌体的一般特性
类型：
大多数呈带尾部的20面型，相当一部分为线
状体型。
核酸：
核酸多数为DNA，少量为RNA，如烟草花
基因克隆主要载体系统
SV40病毒
SV40病毒，环状DNA，外壳蛋白由VP1、VP2、VP3 构成。 受纳细胞（permissive cell， 也称允许细胞 ）： 能使细胞裂解释放感染性病毒颗粒。 非受纳细胞（non permissive cell）：不产生 感染性病毒颗粒，但能整合到细胞染色体中产生 癌变。 基因结构:
3 、载体的共同特征（或应具备的条 件）：
①自主复制
②易于扩增分离纯化
③有单一酶切位点（多克隆位点） 单一酶切位点：一种酶在一个载体上只有一个酶切 位点 多克隆位点：一个载体上的某一个区域含有多个单 一酶切位点 ④有选择标记基因 ⑤表达载体还应有表达调控元件（启动子、增强子、 终止子,SD序列） ⑥具有较好的安全性，避免基因的非控制扩散
5.其他载体
（1）酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome, YAC） （2）细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BAC） （3）动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒、 腺病毒相关病毒、逆转录病毒）
三 真核细胞的克隆载体
二、植物表达载体
多数植物表达载体是质粒载体
最经典的植物表达载体是pBI121
植物表达载体与克隆质粒载体一样, 可以 克隆基因, 但还具备表达所克隆的基因的 特性
(15kb)
三、动物细胞基因克隆的载体
㈠SV40病毒 ㈡SV40病毒载体
(1)取代型重组病毒载体 ①晚期区段取代载体 ②早期区段取代载体 (2)重组的病毒-质粒载体
附加体型载体（YEP）
YEP型载体一般由大肠杆菌质粒、2µm质粒以及酵母染色 体的选择标记构成。 2µm质粒含有自主复制起始区（Ori）和STB区,STB序列 能够使质粒在供体细胞中维持稳定。利用2µm质粒，人们 已经构建出许多YEP型载体。 YEP型载体PYF92就是由酵母的2µm质粒、pBR322质粒 和酵母的His3+(组氨酸)基因构成的。 YEP型载体对酵母具有很高的转化活性，一般为103-105 转化子/微克DNA。比YRP型载体更稳定，拷贝数也高 （25-100个/细胞），是基因克隆中的常用载体。
质粒载体种类
质粒载体种类
质粒载体种类繁多，可以根据其功能和用途进行分类。
以下是一些常见的质粒载体类型：
1. 克隆载体：这种类型的质粒主要用于克隆和扩增DNA片段。
它们通常具有易于克隆的限制性酶切位点，以及细菌选择标记和多克隆位点。
2. 表达载体：表达载体用于在宿主细胞中表达目的基因。
这些载体包含可调控的启动子和终止子，以及选择标记和目的基因的克隆位点。
3. 干扰基因表达载体：这种载体主要用于抑制目标基因的表达。
它们通常包含干扰RNA（RNAi）的序列，以沉默特定基因的表达。
4. 病毒载体：病毒载体可以利用病毒的特性来传递遗传物质。
它们可以携带治疗性基因或用于基因编辑，并通过感染宿主细胞来传递这些基因。
此外，还可以根据质粒的拷贝数、复制起始区、选择标记基因区、多克隆位点等特征对质粒载体进行进一步分类。
克隆载体的名词解释
克隆载体的名词解释克隆载体是分子生物学实验中常用的工具，用于携带并负载外源DNA片段，以实现基因克隆和基因工程。
克隆载体可由天然或人工合成的DNA构建而成，广泛用于基础研究、基因表达、基因治疗等领域。
本文将从克隆载体的定义、组成结构、常见类型以及应用等方面对其进行解释。
一、克隆载体的定义克隆载体是指用于将目标外源DNA导入到宿主细胞或有机体中，并在其中进行自主复制、表达和传递的DNA分子。
克隆载体具有一系列特定的序列和功能元件，包括起始子、终止子、选择标记、荧光蛋白等，以确保成功实现目标DNA的克隆和表达。
二、克隆载体的组成结构克隆载体通常由一个或多个元件组成，包括DNA序列、选择标记、表达载体以及复制起源，具体结构如下：1. DNA序列：克隆载体内含有目标外源DNA的序列，其大小和类型因实验需求而异。
DNA序列通常具有特定的限制性内切酶切位点，以便于将外源DNA片段定向插入到载体中的特定位置。
2. 选择标记：为了筛选成功克隆和转入宿主细胞的载体，克隆载体通常携带有选择标记基因，如抗生素抗性基因或荧光蛋白基因。
这些标记基因在宿主细胞中可以提供对抗生素的耐药性或特定荧光表达，从而方便筛选出含有目标外源DNA的成功克隆载体。
3. 表达载体：对于需要进行表达的克隆载体，其内部还包含有启动子、终止子以及表达宿主基因的相关元件。
这些元件协同作用，使得克隆载体能够在宿主细胞中进行基因的转录和翻译，从而实现目标基因的表达。
4. 复制起源：为了保证克隆载体能够在宿主细胞中独立复制，克隆载体通常还含有复制起源序列。
复制起源序列可以与宿主细胞的复制系统相互配合，使得克隆载体能够被复制并遗传到下一代细胞中。
三、克隆载体的常见类型克隆载体具有多种类型，根据其应用和特性的不同，常见的克隆载体包括质粒、噬菌体、合成DNA以及病毒载体等。
1. 质粒（Plasmid）：质粒是环状的双链DNA分子，常见于细菌和真核生物中。
质粒通常具有小分子大小（约1-10 kb），较容易复制和操纵。
基因克隆载体
克隆载体的DNA分子必须具备的条 件
作为载体应该具备以下基本条件： 1.具有对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）
2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位 点，较高的遗传稳定性; 3.具有较小的分子量，易于操作，具有较高的外源 DNA的载装能力 4.在非必需区具有多种单一的限制酶酶切位点； 5.外源DNA插入后不影响载体在受体细胞中进行自 我复制;
低拷贝的质粒，每个寄主细胞中仅含有1-3份拷 贝
松弛型复制控制的质粒 stringent plasmid
高拷贝的质粒，每个寄主细胞中含有10-60 份拷贝
质粒复制控制的分子模型
目前公认的用于阐释质粒DNA复制控制 机理的分子模型有两种：
其一是抑制蛋白质稀释模型(inhibitor dilutionmodel)。
(2)自体阻遏蛋白质模型
在抑制蛋白质稀释模型提出若干年之后， L.Sompayrac和O.Maaloe也提出了另外 一种解释质粒DNA复制机理的自体阻遏蛋 白质模型,这个模型对质粒DNA复制控制机 理的一种解释是，质粒DNA的复制是由一 种叫做起始蛋白质Rep引发的。这种蛋白 质是质粒DNA复制启动作用的限速因子， 它的浓度决定着每个细胞每个世代之质粒 分子的最终复制总数。
Relaxed circle Linearized form Super-coiled form
质粒的类型：按分子特性分成接合型和非接合 型，接合型的质粒，又叫自我转移的质粒，带 有自主复制所必须的遗传信息之外，还带有一 套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
按表型特性分成F质粒、R质粒、Col质粒。
从理论上讲，任何DNA分子均可以物理渗 透的方式进入生物细胞中，但这种频率极低， 以至于在常规的实验中难以检测到。某些种类 的载体DNA分子本身具有高效转入受体细胞 的特殊生物学效应，因此由外源基因与载体拼 接所形成的DNA重组分子传入受体细胞的机 率比外源DNA片段单独转化提高几个数量级.
基因克隆技术的原理及应用
基因克隆技术的原理及应用1. 基因克隆技术的引言基因克隆技术是生物学领域中一项重要的实验技术，被广泛用于基础研究、生产应用、医学诊断等领域。
本文将介绍基因克隆技术的原理以及其在不同领域的应用。
2. 基因克隆技术的原理基因克隆技术是指将感兴趣的DNA片段从一个有机体中复制到另一个有机体的过程。
它主要包括DNA片段的获取、载体的选择、转化和筛选等步骤。
2.1 DNA片段的获取DNA片段可以通过多种方法进行获取，包括PCR、限制性内切酶切割、合成以及基因库筛选等。
其中，PCR是最常用的方法之一，通过酶连锁反应可以扩增目标DNA片段。
2.2 载体的选择克隆过程中需要选择一个合适的DNA载体来承载目标DNA片段。
常见的载体包括质粒、噬菌体和人工染色体等。
选择载体时需要考虑载体的大小、复制能力、表达能力等因素。
2.3 转化将目标DNA片段与选定的载体进行连接后，需要将复合物转化到宿主细胞中。
转化可以通过化学方法、电穿孔等方式实现。
转化后的细胞将能够持续地复制目标DNA片段。
2.4 筛选为了筛选出含有目标DNA片段的克隆体，可以利用选择性培养基、荧光标记、抗生素抗性等方法进行筛选。
筛选后的克隆体可以进一步进行纯化和验证。
3. 基因克隆技术的应用基因克隆技术在许多领域都得到了广泛的应用，下面将介绍其在基础研究、生产应用和医学诊断中的应用。
3.1 基础研究基因克隆技术在基础研究中起到了至关重要的作用。
通过克隆和研究特定基因，科学家可以深入了解基因的结构、功能以及相互作用关系。
这对于研究生物学基本原理、探索疾病机理等具有重要意义。
3.2 生产应用基因克隆技术在农业、药物生产和工业生产等领域都有广泛的应用。
例如，农业方面可以利用基因克隆技术改良作物品种，提高产量和抗病性；药物生产方面可以利用基因克隆技术大规模生产特定蛋白质，用于制造药物；工业方面可以利用基因克隆技术生产高效酶、清洁能源等。
3.3 医学诊断基因克隆技术在医学诊断中的应用也越来越广泛。
常用克隆载体
PAC ( P1-derived artificial chromosome, 插入片 段可达300kb)
本图所表数字是 以 EcoR I 位点中央计为0， 从顺时针方向计算，至各 酶切位点的 第一个碱基的 数。在圆的内 部所表示的 各限制酶是在 pBR322 DNA上只有一个酶 切位 点的酶，圆外所表示的各 酶是在pBR322 DNA上 有2个至3个的酶切位点的 酶，（）内的数是酶切位 点数
质粒载体pUC19
缺点：插入M13的外源DNA超过1000bp时就不稳定，在 噬菌体增殖时会出现缺失。
噬菌粒载体
由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型载体系列， 称为噬菌粒（phagemid）。
噬菌粒（phagemid）是带有丝状噬菌体复制起始点的 质粒。
pUC118/pUC119噬菌粒载体; pBluescript噬菌粒载体（最常用，M13载体在多克隆 位点的两侧引入了T7和T3两个噬菌体的启动子。）
常用的粘粒载体
用于在细菌中增殖真核DNA的粘粒载体 pJB8, c2RB, pcos1EMBL 用于转染哺乳动物细胞的粘粒载体 cos202/203，pWE15/16
粘粒的主要特征
（1）由质粒与组成的一种4-6kb的环状杂种DNA， 容易分离并可分离操作。既能像质粒一样在细菌 中繁殖，又能像一样在体外包装，并高效导入受 体细胞。
基因工程常用的克隆载体
克隆载体
目的基因进入细胞必须要有载体（vector） 的运载作用才能实现。
载体运载外源DNA至宿主细胞，是通过 载体自身DNA的核酸序列中插入了外源 DNA，再进入宿主细胞内进行的DNA复制， 在载体DNA复制时，外源DNA分子也获得 了复制（扩增）和表达。
克隆载体与表达载体介绍
（二）质粒载体的构建
天然质粒载体不易直接作为克隆载体，需要改造：
（1）选择合适的复制起始位点，松散型质粒复制起始位点； （2）加入合适的选择标记基因，主要有LacZ基因和抗生素抗性基因； （3）增加或减少酶切位点，组装多个单一的限制酶切位点即多克隆位点
（MCS); （4）缩短长度，通常重组DNA分子越小，转化效率越高。
（三）常用的质粒载体
1. pBR322质粒载体
2. pUC18和pUC19质粒载体
3. TA载体
二、噬菌体载体
（一） λ 噬菌体载体 1 λ 噬菌体的性质
λ噬菌体Βιβλιοθήκη 外壳蛋白 线性，全长48502bp
λDNA 5’端含12bp的黏性末端
2 λ 噬菌体的构建 构建λ 噬菌体的依据：
a.λ 噬菌体能够包装原λDNA长度的75%－105%的DNA片段 （36.4~51kb） b.有20kb的区域对λ噬菌体生长非必需。
该λ 噬菌体载体的最大装载容量为: 4.9+5.5+2.6+(51-48.5)=15.5kb
2.6kb
3 代表性λ 噬菌体
(1) 插入型载体
装载容量为：0-10.18kb
(2) 置换型噬菌体载体载体 克隆外源DNA片段范围为：9-23kb
（二） M13 噬菌体载体
1.M13噬菌体的增值
M13噬菌体是单链丝状噬菌体； 长6407bp， 507bp基因间隔区，含复制起始位点，同时可用于改造； M13 DNA在宿主细胞中以双链或单链形式存在，但释放到细胞外的 M13 噬菌体颗粒以单链形式存在。
2.M13噬菌体载体 1) 插入选择标记基因； 2) 组装合适的多克隆位点。
三、噬菌体-质粒杂合载体
基因工程第3章 基因克隆载体(1质粒载体)
诱导物：IPTG
• IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵 子的启动转录，使受体菌基因组中的 lacZ 的C端部分和载体的lacZ’肽都 表达。从而互补。 • 但载体MCS上插入外源DNA后，不能 产生肽！
lacZ的肽互补
• -肽（ lacZ’ 基因编码）：-半乳糖苷酶N端 的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。 • lacZ只有在4聚体的状态下才有功能。 • pUC质粒载体上的lacZ’ 编码的肽与这个缺 失突变的-半乳糖苷酶“互补”，使它能形 成4聚体，又能分解Xgal，产生蓝色物质。
• pBR322质粒是按照标准的质粒载体命 名法则命名的。
• “p”表示它是一种质粒； • “BR”则是分别取自该质粒的两位主 要构建者F．Bo1ivar和 R．L．Rodriguez姓氏的头一个字母， • “322'’系指实验室编号，以与其他质 粒载体如pBR325，pBR327， pBR328等相区别。
合适的启动子
• 真核生物基因在原核生物中表达，改 用原核生物或病毒（噬菌体）基因的 启动子。
• 原核生物基因在真核生物中表达，仍 用原核生物基因的启动子。 • 选用外界条件诱导的启动子。
(1) 质粒克隆载体pBR322
• pBR322是经人 工改造的一种较 为理想的大肠杆 菌质粒载体，应 用广泛。现在已 经被许多更优良 的新型克隆载体 所替代。 (P40)
• （1）分子量大，拷贝数低
• 第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子 长 9.1 kb。但只有一个EcoR I切点充当克隆位点， Tetr 作为筛选标志。
（2）筛选标志不理想
• ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1 （colicin E1）。 • colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形 成“噬菌斑”。 • 唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因 的内部。因此可通过插入失活筛选。但细 菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细 胞…….
克隆载体表达载体(课件)PPT课件
组成型表达载体是将基因整合到宿主细胞的染色体上，使基因在任何生长条件下都能稳定表达。这种 表达载体适用于需要持续稳定表达的基因。
组织特异性表达载体
总结词
在特定的组织或器官中，表达载体才能 启动基因的表达。
VS
详细描述
组织特异性表达载体是将基因与特定的组 织或器官相关的调控序列结合，使基因只 在特定的组织或器官中表达。这种表达载 体适用于需要组织特异性表达的基因。
05
克隆载体和表达载体的未来发展
克隆载体和表达载体的新技术和新方法
基因编辑技术
利用CRISPR-Cas9等基因编辑技术，实现对克隆载体和表达载体的精确修饰，提高基 因治疗的效率和安全性。
人工染色体技术
开发人工染色体技术，实现对大型基因组的克隆和表达，为遗传病研究和治疗提供新的 工具。
克隆载体和表达载体的新应用和新领域
04
克隆载体和表达载体的应用
克隆载体在基因工程中的应用
基因克隆
克隆载体可以将目的基因插入到质粒 或病毒载体中，实现基因的复制和扩 增，为基因工程提供大量目的基因。
基因保存
基因突变
通过将目的基因插入到克隆载体中， 进行定点突变或随机突变，研究基因 功能和蛋白质活性。
克隆载体可以保存和传递目的基因， 为基因工程提供长期稳定的基因来源。
01
02
03
基因治疗
利用克隆载体和表达载体， 开发新型基因治疗策略， 针对遗传性疾病、肿瘤等 进行有效治疗。
生物制药
通过克隆载体和表达载体， 实现高效、大规模的蛋白 质药物生产，推动生物制 药产业的发展。
农业育种
利用克隆载体和表达载体， 培育抗逆、抗病、高产的 农作物新品种，提高农业 生产效益。
克隆载体与表达载体
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
)其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体与表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322与pUC的质粒复制起点与氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子与终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine与Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG与一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
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.克隆载体及其主要功能
载体是克隆基因的关键组分，载体使重组DNA分子能够在受体细胞中复制。
质粒和噬菌体是两种天然的DNA载体。
目前，能在不同受体细胞中使用的载体有数百种，其中，可以在大肠杆菌中使用的载体数目最多。
质粒pBR322是一种典型的大肠杆菌克隆载体，它全长仅为4.3kb。
pBR322带有两种抗生素抗性基因：b -内酰胺酶基因和四环素抗性基因，前者修饰并消除氨苄青霉素对大肠杆菌的毒性。
通常，目的基因插入载体质粒将破坏四环素抗性功能。
因此，使用含有氨苄青霉素和四环素的培养基，我们可以鉴别大肠杆菌的转化细胞：带有重组质粒的转化细胞只能在含氨苄青霉素、不含四环素的培养基上生长；另一方面，原受体细胞不能在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上生长；而有载体质粒但没有目的基因的转化细胞能在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上生长。
另外，pBR322是一种松弛型质粒，在培养液中加入氯霉素可以使转化细胞中的质粒拷贝数由通常的15个增至1000-3000个，此间，大肠杆菌的染色体并不复制。
在细菌中，噬菌体载体是另外一类常用的克隆载体。
和质粒不同的是，噬菌体载体通过感染过程即转导进入宿主大肠杆菌细胞。
通常，作为克隆载体的噬菌体，都经过一定的突变和缺失处理。
因此，这类噬菌体进入大肠杆菌细胞之后，并不像一般噬菌体那样在宿主染色体上整合，而是直接进入裂解周期：大量复制噬菌体、裂解宿主细胞，最终在培养基上形成含有大量噬菌体拷贝的噬菌斑。
和质粒载体相比，噬菌体载体能够克隆更长的DNA片断。
3.重组克隆筛选
3.1.抗性基因插入失活筛选法
根据抗生素抗性基因插入失活原理而设计的插入失活法是重组体常用的筛选方法。
如非重组的pBR322质粒DNA上的四环素和氨苄青霉素抗性基因都是正常的, 表型为AprTcr。
带有这种质粒的受体菌可以在加有四环素和氨苄青霉素的双抗性平板上生长。
但是, 如果在该质粒的四环素抗性基因内插入外援片段, 就会造成四环素抗性基因失活, 变成AprTcs, 携带这种质粒的宿主菌可以在氨苄青霉素的平板上生长, 而不能在四环素抗性平板上生长。
3.2. 蓝白斑筛选法
根据抗生素抗性基因插入失活原理而设计的插入失活法需要进行菌落平板的影印复制, 才能够将所需的重组体挑选出来, 大大增加了筛选的工作量。
后来, 人们设计了以β-半乳糖苷酶的产生作为颜色筛选标记的载体, 简化了筛选程序, 提高了灵敏度。
这类载体系统包括M13噬菌体、pUC质粒系统、pEGM质粒系统。
它们的共同特点是载体上携带一段细菌的lacZ基因, 它编码β-半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的α-肽, 载体转化的受体菌为lacZΔM15基因型。
这样, 载体同宿主通过互补, 具有完整的β-半乳糖苷酶的活性。
如果在载体的lacZ基
因中插入外源DNA, 造成lacZ基因失活, 不能合成α-肽, 失去同宿主的互补, 不能形成有功能的β-半乳糖苷酶, 失去分解X-gal的能力。
在X-gal平板上, 含阳性重组体的细菌为物色菌落(质粒载体)或无色噬菌斑(M13噬菌体载体);
非重组体转化的细菌为蓝色菌落或蓝色噬菌斑。
4.重组克隆鉴定
酵母是目前较为有效的外源基因表达系统，可实现目的蛋白的高效分泌表达，且可对目的蛋白进行糖基化加工等。
酵母表达系统利用的是乙醇氧化酶基因启动子作为强诱导型启动子，可被甲醇诱导。
宿主菌GS115在His4基因位点被突变，因而只有当携有外源基因和His4基因的表达载体与酵母染色体在Aox1基因处发生同源重组后，酵母克隆才能在组氨酸缺陷培养基（MD）平板上生长。
而此时由于酵母基因组上Aox1基因被取代，重组克隆仅能利用Aox2缓慢代谢甲醇（Mut p>s），表现为在MM平板上生长缓慢。
因而一般采用MD/MM平板筛选法来筛选重组酵母克隆。
但由于至少10%～20%的转化子是载体His4基因和GS115染色体上的His突变基因位点间的转换而形成，因而这种所谓的重组克隆并不携有载体上的目的基因表达序列。
这种假阳性的克隆的排除只有用PCR方法来鉴定目的基因是否存在于酵母染色体上。
传统提取酵母染色体的方法较为繁琐且耗时较长，而其他相对简便的方法中则需使用酵母裂解酶处理，我们采用了一种新的快速制备酵母染色体的方法，通过PCR鉴定重组酵母克隆，排除了MD/MM平板筛选出的假阳性克隆。