流式细胞术质量控制

流式细胞术质量控制流式细胞术（flow cytometry,FCM）越来越广泛的应用在临床检验中。

由于临床检验本身的性质，它要求临床检验的管理者和操作人员必须把好常规操作已经结果分析的质量关。

同时还必须懂得如何判断分是在控还是失控。

作为临床检验工作，其工作的质量标准就是使检验的结果最佳地符合病人有无病变的实际情况。

在临床检验中分为分析前、分析中、分析后的质量控制。

分析前的质量控制主要内容是标本采集、保存和传送等；分析中的质量控制即实验操作过程的控制；分析后的质量控制主要是对数据结果的处理，对检验结果的可信度评价和及时将报告送给临床并听取反馈意见。

为此，从临床医师开出化验单，，直至拿到检验报告的整个过程都在质量控制的范畴之中，即所谓全程质量控制。

它包括质量保证、质量控制和质量评估。

质量保证，指围绕所有的步骤，监测和评估实验室规章制度与操作流程的效力。

主要利用质量控制和质量评估。

质量控制指建立一套完善的实验室监控方法，保证结果的可靠性，提高准确度、精密度、重复性和室间结果的可比性。

对于一个实验，应建立一套包括各种可变因素（仪器设备、样本处理、试剂、操作过程、数据分析等）的操作规程。

质量评估是由一个区域性的、国家的或国际性的机构，组织通过一系列的方法来比较实验室内或不同实验室之间的结果而建立的一套评价系统。

其主要目的是建立室间和仪器设备之间的可比性。

当一个标准品或参考标准存在时，质量评估通常被称为熟练度测试。

因此，严格的质量控制是先进的临床检验分析技术真正发挥作用的保证。

FCM作为一项先进的检测技术，对质量控制自然也不例外。

目前，FCM应用于临床检验的项目主要集中在几个方面：1，免疫表型分析，包括外周血淋巴细胞表型分析、白血病/淋巴瘤免疫分型、血小板膜糖蛋白分析、HLA-B27检测、阵发性血红蛋白尿（PNH）的检测等等。

2，细胞DNA、RNA检测及细胞周期分析，包括DNA倍体检测、细胞周期分析、网织红细胞检测、网织血小板检测等等。

3，定量分析，包括爱滋病划分中外周血CD4的绝对定量、OKT3治疗监测中CD3的绝对定量、干细胞移植中的CD34的定量等等。

FCM实验的质量控制自然也包括仪器设备、样本处理、试剂、操作过程、数据分析等整个实验过程的质控。

一、流式细胞仪的校准流式细胞仪的校准包括流路的稳定性、光路的稳定性、多色标记荧光颜色补偿、光电倍增管转换的线性和稳定性。

对仪器的校准主要是利用标准微球进行监测。

聚苯乙烯可以被做成各种大小的微球，也可被荧光标记或者拥有定量免疫球蛋白的结合位点。

这种制成固定荧光强度、大小和光散射性的聚苯乙烯微球，已成为流式质控中的一个常用的标准品。

BECKMAN COULTER公司拥有仪器校准所需全部标准微球（见表一）。

另外，在颜色补偿方面，BECKMAN COULTER公司的流式细胞仪除了可以用标准补偿试剂来完成外，还可以直接利用生物样品进行自动颜色补偿，这使多色标记变得非常容易。

BECKMAN COULTER公司的流式细胞仪所带的全程质控软件，使日常仪器性能的质控以及质量控制评估都可自动完成。

二、实验操作过程的质控（一）样本的质量控制用于流式分析的样本种类很多，包括外周血、骨髓穿刺液、骨髓活检物、组织活检物、浆膜腔积液、脑脊液、皮肤、黏膜（内窥镜活检物）、细针穿刺物等等。

样本的条件控制可能是免疫表型分析质控最困难的环节之一。

每种样本都有不同的采集、保存、运输和制备要求。

首先，观测样本外观：有严重溶血、凝聚或坏死的样本应弃用。

第二，单细胞悬液的获取：外周血和骨髓穿刺液为天然单细胞悬液；活检组织常用机械分离和酶消化两种方法。

不同的实验要求适用不同的方法。

对于需要进行膜抗原标记的，不仅是要获得足够的单细胞悬液，还要尽量保证细胞结构的完整性和抗原性，机械法较适用。

只需进行细胞周期或DNA倍体分析的，在机械法的基础上加酶消化（如胰蛋白酶、胃蛋白酶等）较适用。

第三，抗凝剂的选择：外周血标本可采用EDTA、ACD或肝素抗凝。

如果用同一份血标本做白细胞计数和流式分析，则应用EDTA抗凝；对于血小板分析的实验，一般不用肝素抗凝。

骨髓穿刺液常用肝素或EDTA 抗凝。

由于相对大量的ACD会通过改变pH而影响骨髓细胞活性问题，通常不推荐用ACD作骨髓穿刺液的抗凝剂。

第四，样本的保存：理想状态下，样本应在采集后立刻进行处理和染色。

肝素抗凝的血和骨髓通常可保存至48-72小时/室温（16-25）；EDTA抗凝的外周血和骨髓可保存12-24小时/室温（16-25）；ACD抗凝的外周血可保存至72小时/室温（16-25）；对于只作胞内染色的样本，可固定细胞以长期保存。

但此“固定－染色”的方法取决于要分析的抗原特性和染色方式。

第五，去除红细胞的方法：红细胞裂解法，操作简单、快、并最可能保持原始标本的白细胞分布。

最好在染色后溶血。

若在染色前溶血，需确认：1)抗原性不被溶血过程改变；2)溶血剂被彻底洗去，细胞和抗体结合的动力反应未受影响；3)所用溶血剂不含固定剂，否则会影响细胞活性及表面标记结果。

密度梯度离心法，靶细胞回收较好并可能得到富集，同时去除红细胞、碎片等，但费时，某些重要细胞群体可能被选择性丢失。

第六，细胞与抗体的比例：厂家推荐的抗体用量通常是假定靶细胞数量在5X105 ~1x106范围内。

有些标本没有足够的细胞，有些则由于细胞量大，正常浓度下的抗体相对过量或不足，导致假阳性或假阴性结果。

因此，每个实验室应根据不同于厂家推荐的方法，调整细胞与抗体用量，得到最适的细胞/抗体比例。

第七，细胞活性的鉴定：死细胞对许多抗体均有很强的非特异性染色，这就使样本细胞活性检测变得非常重要，尤其是经过了长时间运输和储存的样本。

检测的方法通常有两种：1）实时的流式检测：利用荧光染料碘化吡啶（PI）、7氨基放线菌素D（7-AAD）或EMA（ethidium monoacide）进行死细胞染色，而活细胞拒染这些染料。

此方法的优势是细胞表面标志和活性分析可同时进行。

尤其适用于高度坏死的样本。

7-AAD 最常用，因为在488nm激发下，其最大发射光在670nm左右，适合与FITC 或PE进行多色标记。

但随着时间延长，7AAD会在固定的细胞群体重新分配，死活细胞的区分变得困难。

因此，对于染色并在固定后12小时以上分析的标本，最好用EMA。

EMA与死细胞DNA稳定的共价结合保证了长时间固定后仍能很好地区分固定前的死活状态。

2）手工检测：使用Trypan blue 或其他细胞活性染料。

3)使用专门的仪器进行检测。

如Vi-cell.（二）、选择和确定单抗组合流式分析最基本的试剂就是抗体。

所选抗体的好坏直接影响结果。

影响抗体特性的因素很多，如F/P比值、亚型、全长或片段、种宿来源、标记荧光种类等等。

而且，有CD分类号的300多种单抗和大量没有CD分类号的单抗使抗体的选择更加困难。

一般，选择抗体组合遵循以下基本原则：1）所选的抗体组合应足够宽，可以鉴别样本中的所有细胞亚群包括正常和异常群体。

2）对表达少的抗原应尽可能选择荧光强度强的荧光素标记。

3）了解不同抗体的细胞反应谱，以及染色模式。

根据不同的实验目的选择抗体。

因为相同CD编号的抗体可能识别不同的抗原决定簇。

4）抗体的多种组合可能相互影响与抗原的结合（如通过空间构型的阻碍），所以对所用抗体组合，应先了解每个抗体在对照细胞上单色标记的表达情况。

5）对于临床实验尽量选择体外诊断（IVD）试剂和分析特异性（ASR）试剂，而仅供研究用（RUO）试剂一般不能用于体外诊断实验。

在我国，用于体外诊断的试剂还必须取得国内的SDA 认证。

这样，一个抗体组合内的抗体可能来源不同的公司，有不同的浓度、不同的亚型、不同F/P值，可能均需要自身的同型对照，而实际上，这是非常困难的。

那么，尽量选择同一家公司的试剂可以减少上述的干扰。

对于临床上常见的流式检测项目，所需的试剂组合基本都有参考或推荐的抗体组合。

如，T细胞亚群检测的CD45/CD4/CD8/CD3、CD45/CD56/CD19/CD3；阵发性血红蛋白尿（PNH）检测的CD55、CD59；血小板无力症（GT）检测的CD41、CD61等等。

但对于白血病/淋巴瘤免疫分型，国际上迄今为止也没有统一的抗体组合。

在2000年国际细胞分析学会（ISAC）大会上，临床血细胞计数协会组织了一次国际专家会议，以期对检测血液淋巴系统肿瘤所需最少、最有效的单抗数达成共识。

75%与会者一致认为，对于慢性淋巴系统增殖性疾病（CLD）有9种单抗：CD5,CD19,κ,λ,CD3,CD20,CD23,CD10,CD45对初诊来说是最基本的。

淋巴瘤和CLD相似，需要至少12-16种单抗。

对于急性白血病（AL），75%的与会者认为大约13-15种单抗是最基本的：CD10,CD19,CD79a,CD13,CD33,CD34,CD45,CD2,MPO，CD7,CD14,CD3,HLA-DR等，对初步鉴别白血病系列是必需的。

其他一些（CD16,CD56,CDw65,TdT,cyCD3）可能对某些病例有用。

几乎所有的投票者都认为，要对急性白血病完善分类所需单抗的恰当数量平均为20-24种。

但这些抗体之间组合也是一大难题，目前也无统一规定（如表二）。

大会多数发言者(11/13)指出，对已确诊病人的监护和分期来说，仅需较少单抗。

抗体的质量控制是实验的关键环节。

抗体的质量包括其特异性、灵敏度、精密度。

对这一些，一些商业化的公司对常用单抗的检验均推出了一系列质控物。

如BECKMAN COULTER公司的Cyto-Trol、Immuno-Trol等（见表一）。

（三）染色方法细胞表面染色：大多数免疫表型分析均采用此方法。

但由于许多抗原也同时存在细胞内，所以在细胞表面抗原检测时应特别注意保持细胞膜的完整以保证检测的特异性。

表面标记又分溶血前标记和溶血后标记。

若红细胞对标记有影响或血浆成分对标记有影响的，适合溶血后标记，但要注意溶血剂膜抗原的影响，所以，溶血剂一般不含固定剂。

如免疫球蛋白轻链检测和阵发性血红蛋白尿的检测等。

细胞内染色：有些胞内抗原的检测对白血病的免疫分型尤为重要，如TdT, MPO, cCD3, cCD79a 。

胞内染色的关键是使细胞膜通透，把抗体或核酸染料导入胞内而不影响细胞骨架的完整性。

还要保证固定和透膜的步骤不影响有关抗原与相应抗体的结合力和核酸与染料的结合。

某些适用于胞内染色的试剂可能不适于表面标记分析。

通常胞内染色不能与细胞活性的检测同时进行，除非用EMA的方法。

对于胞内染色，所用的荧光素应足够小到能穿透到胞膜内。

对于某些核酸染料（如DAPI、TO、AO等）为活细胞染料，无需固定或透膜。

胞膜和胞内染色：通常，先胞膜染色，固定，膜通透和胞内染色，最后是DNA染色。