叶绿素的提取实验报告

叶绿素的提取及叶绿素铜钠的合成及测定生物资源系食卫101 韦琪（20102023）

指导老师：张倩、刘新梅

一、实验目的

1.从蚕沙中提取叶绿素并计算提取率；

2.研究用叶绿素合成叶绿素铜钠的工艺条件；

3.分析叶绿素铜钠产品的纯度，计算产率；

4.通过试验提高综合能力及练习巩固各种相关操作。

二、实验原理

蚕沙是桑蚕的排泄物，由蚕沙制取天然色素——叶绿素酮钠盐，是国外普遍采用的最佳途径。叶绿素是一种酯，因此不溶于水，而溶于乙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂。

叶绿素是植物吸收太阳能进行光合作用的主要色素，叶绿素是一种含有卟吩环的天然色素，在叶绿素的结构中，含有一个由四个吡咯环和四个次甲基交替相联形成的卟吩环．卟吩环闭合的共轭体系提供了包围镁离子(或其它相似离子)的刚性平面．高等植物中含有叶绿素a和叶绿素b分子式如下：

蚕沙中含有丰富的叶绿素，其纯含量达0.8—1.0%，居所有天然色素之首，故可用蚕沙来提取叶绿素，由于叶绿素易溶于乙醚、苯、丙酮、乙醇的脂性溶剂，故可用乙醇、丙酮混合液来提取。所得的叶绿素由于遇热、光、酸、碱等易分解，且又不溶于水。110度左右会分解，故把叶绿素制备成叶绿素铜钠，其性质更稳定溶解性也会有所提高。

叶绿素分子中的镁原子和四个吡咯上的氮原子相结合，环上是双羧酸的酯，一个被四所酯化，另一个被叶醇基所酯化，故可以发生皂化反应生成钠盐：

C55H72MgN4O5 + 2 NaOH →C34H30O5N4MgNa2 + CH3OH + C20H39OH

在酸性介质中，叶绿素钠盐分子中的镁极易被氢原子取代生成褐色的叶绿素酸：

C34H30O5N4MgNa2+ 4 H+→C34H34O5N4 + Mg2+ + 2 Na+

叶绿素酸可与铜盐加热条件下生成叶绿素铜酸析出，将叶绿素铜酸溶于丙酮，再与碱反应就生成叶绿素铜钠盐：

C34H34O5N4 + Cu2+→C34H34O5N4Cu + 2 H+

C34H34O5N4Cu + 2 NaOH →C34H34O5N4CuNa2 + 2 H2O

由叶绿素转化成叶绿素铜钠的过程也可用化学反应方程表示：

（1）皂化：

COOCH3COONa

C32H30ON4Mg + 2NaOH → C32H30ON4Mg + CH3OH + C20H39OH COOC20H39 COONa

（2）酸化：

COONa COOH

C32H30ON4Mg + 2H2SO4 → C32H30ON4H2 + MgSO4 + NaSO4

COONa COOH

（3）铜代：

COOH COOH

C32H30ON4H2 + CuSO4 → C32H30ON4Cu + H2SO4

COOH COOH

（4）成盐：

COOH COONa

C32H30ON4Cu + 2NaO H → C32H30ON4Cu + 2H2O

COOH COONa

三、实验仪器和试剂

1.仪器：（一个），分液漏斗（2个）,250mL锥形瓶（1个），烧杯（100ml、250 mL、

500mL ）各1个，容量瓶（100mL、250mL）各1个，蒸馏装置，减

压过滤装置，玻璃棒，电子天平，圆底烧瓶（250mL）2个，酸度计，

分光光度仪（一台）。

2.试剂：（50g）、95%乙醇，丙酮，石油醚，2%～5%NaOH乙醇溶液，硫酸铜溶

液，无水乙醇，稀盐酸，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾。

四、实验流程

蚕沙——预处理——浸提（三次，分别是3h,1h,1h）——抽滤——浓缩

——萃取液皂化——分离——萃取——调PH值——铜化——抽滤——

离析——沉淀——烘干——纯化——成盐——过滤——成品

五、实验步骤

叶绿素原料→极性有机溶剂萃取→过滤→萃取液→皂化→非极性有机溶剂萃取除去脂溶剂性质→叶绿素盐溶液→酸化形成叶绿素酸→→铜代→加氢氧化钠形成叶绿素铜钠→洗涤干燥→检验纯度及质量。

（1）蚕沙预先处理：将50g蚕沙放入打磨机中打磨粉碎。

（2）从蚕沙中提取叶绿素：加入乙醇-丙酮混合液（1:1）150ml于40~45°C提取3~5h，抽滤，滤渣再用同等体积乙醇-丙酮的混合液提取两次。经抽滤分离得墨绿色溶液。

（3）叶绿素的皂化：合并两次提取液并加5%的NaOH-乙醇水溶液调pH值为11，水浴加热(50-60°c)皂化回流1h左右。皂化目的是为了除去甲基和叶绿基酯基，即向溶液中加入NaOH溶液，在温度为50-60°c搅拌约1h。

皂化是否完全可用石油醚萃取来判断，上层液呈黄色即为皂化完全，反之亦真。然后再用分液漏斗萃取2~3次。

（4）回收，洗涤：皂化完毕后，蒸馏回收混合液（60°C左右）直至体积为原来的1/4~1/3即可。冷却后用石油醚萃取4次，以除去叶黄素，胡萝卜素等杂质。

（5）叶绿素酸中的铜代：石油醚下层液用稀盐酸溶液调pH值为7后，加入2-3mlCuSO4溶液，再用稀盐酸将溶液调节pH值为2。在50°C左右进行铜代2h。反应结束即有颗粒状沉淀生成，静置冷却。

（6）洗涤：室温下收集沉淀，先用50~60°C水洗涤，再用30%~40%的乙醇洗涤至乙醇层变为浅绿色。再用石油醚洗涤至石油醚层变为浅绿色。（7）溶解成盐：静置4小时后，用抽滤瓶进行抽滤，滤饼用丙酮溶解，再加入5%的NaOH-乙醇溶液pH值为12（相当于100g叶绿素铜酸约加入20gNaOH），皂化回流1小时，成盐（过程是先呈粘稠状，随着NaOH的

加入,渐渐变稀,直到pH达到11时又复变稠），可用滤纸法检验成盐情况：用玻棒点少许溶液放在滤纸上，滤纸不显绿色则说明完全成盐。

（8）过滤干燥：静置过滤，收集沉淀，用无水乙醇洗涤，然后在60°C~80°C 下烘箱中烘干结晶物，粉碎即得叶绿素铜钠盐。称量，计算产率。

（9）纯度分析：

1、标准叶绿素铜钠盐的标准曲线：

用电子天平称取标准样品0.0100g，加水溶解。转入10mL容量瓶中定容，摇匀。准确取1mL溶液以pH为7.5的磷酸盐缓冲液定容为100mL，摇匀，即为0.001%溶液。用分光光度计测定，在15分钟内用1cm 的比色杯，在405nm波长处测定溶液的吸光值A（每隔10nm测定一次），以缓冲液作空白对照。类似地，配制0.0005%,0.00075%,0.001%，0.005%,0.0075%浓度的溶液，用分光光度计测定，在15分钟内用1cm 的比色杯，在405nm波长处测定溶液的吸光值A （每隔10nm测定一次），以缓冲液作空白对照，绘制标准曲线。

2、标准叶绿素铜钠盐的吸收曲线：

取1中配置好的0.001%的溶液，用分光光度计测定，在15分钟内用1cm 的比色杯，在360nm～700nm波长处测定溶液的吸光值A（每隔10nm测定一次），以缓冲液作空白对照。记录数据,并绘制吸收曲线。

3、产品叶绿素铜钠盐的吸光比测定：

称取烘干成品0.100g（精确至0.0002g），加水溶解，移入10 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。从容量瓶中准确取2.00mL溶液移入50mL容量瓶，用pH=7.5磷酸盐缓冲液定容至刻度，摇匀，即为0.004%溶液，此液最大吸收峰为405nm 与630nm。以缓冲溶液为空白液，用分光光度计测定，在350nm-700nm波长处测定溶液吸光值A（每隔5nm或10nm测定一次），记录数据，绘制吸光曲线。

六、注意事项：

1.水浴加热时温度控制不宜加热过快；

2.减压蒸馏时对压力的要求不能过高；

3.保证浸润时间足够、提取完全；

4.实验操作的规范及安全问题；

5.要调节好溶液中pH值大小；

6.实验操作的规范及安全问题。