分枝杆菌(检验)

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分枝杆菌分离培养和药敏试验

视标本性状，加1~2倍体积4%氢氧化钠（NaOH)消化液于痰瓶中，拧紧螺旋盖，涡旋震荡器上震荡1min，使痰液充分匀化，室温放置。自加入氢氧化钠消化液起，整个处理时间应在15~20min。标本较多时，应分批处理
去污染处理(其他标本)
病理组织或干酪块标本切碎后置于无菌组织研磨器，加入适量（0.5~1ml）生理盐水后充分研磨成混悬液；混悬液经3000r/min离心30min 后，沉淀物进行碱处理[与2~4倍量2%氢氧化钠（NaOH)混合，处理15min]后接种。
对氨基水杨酸（2.8%）
乙胺丁醇（1.5%）
氨硫尿（1.3%)
8省（次）耐药监测耐药状况
省份
耐药率（%）
新病人
复治病人
总
河南（1996）
35.0
66.0
40.5
河南（2001）
29.8
60.8
35.5
内蒙
35.7
65.3
44.8
辽宁
42.1
55.8
43.3
山东
17.6
50.0
24.5
湖北
17.5
44.5
结核病细菌学实验室布局原则
结核病细菌学检查要有独立的实验室，不得与其他实验室混用。
培养基制备、洗刷等相对洁净的操作与涂片镜检、培养前处理、药敏试验等污染操作要有独立分开的场所，最好分别在专用的房间进行。
分枝杆菌分离培养检查法的重要意义
(1)不论从结核病控制、流行病学检查或临床诊断的角度看，分枝杆菌的分离培养检查法都是结核病确诊最可靠的方法，是结核病病原学诊断的“金标准”。
分枝杆菌种类
分枝杆菌属，除结核分枝杆菌复合群（结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌）及麻风分枝杆菌外，余者统称为非结核分枝杆菌（Nontuberculosis Mycobacteria,NTM）

检验结核分枝杆菌及结果分析

暖固
丽．２Ｎ０Ｏ１２７０
临床
医学
检验结核分枝杆菌及结果分析
徐懿
（阳医学高等专科学校附属医院湖南益阳益
４３０）１００
【要】摘目的观察肺结核病人痰茵情况，分析结核分枝杆菌检验结果。法取自本院呼吸内科的肺结核病人ｌ０，液直接涂方例痰０片抗酸染色镜检；结核杆茵培养采用罗氏培养法，液碱前处理后，０ｉ内接种完毕。痰于３ｒｎａ结果
西医结合杂志，０３１６４～６５．２０，２：３３
等“ １相反，报道其原因在于培养阳性率不高由于Ｆ－Ｃ采用闭管ＱＰＲ
取自本院呼吸内科的肺结核病人１０，选自门诊和住院病０例均人，线检查或病理学检查确诊为结核病（系初治病人）非结核经ｘ均。肺部病例４例，中肺炎２例，气管扩张ｌ例，癌５。Ｏ其３支２肺例
可指导临床用药，ＱＰＲ定量监测Ｔ — ＮＡ可用于判断疗效。Ｆ — ＣＢＤ参考文献
［】中国防痨协会．ｉ结核病诊断细菌学检验规程［】中国防痨杂志，Ｊ．
２００６．
痰液直接涂片抗酸染色镜检；核杆菌培养采用罗氏培养法，结痰
优势。
确诊的ＭＢＴ患者￣Ｆ－Ｃ的阳性检出ＱＰＲ
率可达５％，８明显高于培养法与涂片法，０４例非ＭＢＴ病人无一例为阳性。论Ｆ－Ｃ￥较涂片和培养法无论敏感性还是特异性都有结ＱＰＲ－￣

三种检测方法诊断分枝杆菌感染的效果分析

结核病是由结核分枝杆菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒ⁃
杆菌（ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ，ＮＴＭ）引起的疾病
最多的单一病原体所致的传染病，也是全球十大死因
果不能及时准确鉴定极易造成误诊［２］，并且大多数
ｃｕｌｏｓｉｓ，ＭＴＢ）引起的一种慢性疾病，是全球死亡人数
素（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，ＦＡＭ）和六氯荧光素（ｈｅｘａｃｈｌｏ⁃
ｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，ＨＥＸ）通道，荧光采集点选择６０ ℃ ３０ｓ。
样本扩增曲线呈Ｓ型，且循环阈值（Ｃｔ值）＜４０判定
为阳性，扩增曲线不呈Ｓ型或Ｃｔ值≥４０（或无任何数
值）判定为阴性。ＦＡＭ通道阳性，ＨＥＸ通道阳性或阴
ＰＢＳ）至约５０ｍｌ，盖紧盖子，混合后以３０００ｇ离心
１５ｍｉｎ，去上清液，加１～３ｍｌＰＢＳ悬浮沉淀，加０５ｍｌ
悬浮液至提前加入０８ｍｌ分枝杆菌培养添加剂的分
枝杆菌培养管中，使用ＢＡＣＴＥＣＴＭＭＧＩＴＴＭ９６０全自
动分枝杆菌培养监测仪进行检测。仪器报阳后用萋
１４２ＰＣＲ⁃荧光探针法严格按照试剂说明书进
行操作，首先在无菌杯内加入等量的４％ＮａＯＨ溶
ｒｅｓｃｅｎｃｅｓｔａｉｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄｉｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ．ＲｅｓｕｌｔｓＩｎｔｈｅｓｐｅｃｉｍｅｎｓｏｆｔｈｅ１０４ｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｓｕｓｐｅｃｔｅｄ
ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌｄｉｓｅａｓｅ，ｔｈｅｒｅｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅＢＤ９６０ｌｉｑｕｉｄｃｕｌｔｕｒｅｍｅｔｈｏｄ

实验十四：分枝杆菌

80%
PCR扩增
设计针对分枝杆菌特异性基因的引物，以提取的DNA为模板进行 PCR扩增，以检测分枝杆菌的存在。
实验步骤
02
01
03
1. 细菌培养
在无菌操作台上，将分枝杆菌接种在Middlebrook 7H10 Agar培养基上。
将接种后的培养基放入37℃恒温培养箱中，培养24-48 小时，直至形成可见菌落。
试剂与溶液
实验过程中需要使用到多种试剂与溶液，如PBS缓冲液、 DNA提取液、PCR反应液等。
实验方法
80%
细菌培养
将分枝杆菌接种在Middlebrook 7H10 Agar培养基上，置于37℃ 恒温培养箱中培养，直至形成可见菌落。
100%
DNA提取
使用细菌DNA提取试剂盒从分枝杆菌菌落中提取DNA，为后续 PCR扩增提供模板。
完善培养方法和提高培养效率
进一步优化培养基和培养条件，提高十四分枝杆菌的培养效率和产量，为其应用研究和产业化提供技术支持。
THANK YOU
感谢聆听
加强公共卫生管理
分枝杆菌感染具有一定的传染性，因此加强公共卫生管理对于预防和控制疾病的传播具有重要意义。包括加强疫情监测、提高公众卫生意识、改善环境卫生等措施。
07
实验总结与展望
本次实验成果总结
实验目标达成
01
成功分离并培养了十四分枝杆菌，并对其进行了初步的生物学
特性研究。
方法创新
02
采用了新的培养基和优化后的培养条件，提高了十四分枝杆菌
通过对菌落形态、生长速度、生化反应等特征的观察和分析，实现对分
枝杆菌的鉴定和分类。
02
分子生物学技术的应用

结核分枝杆菌检测及相关内容

（二）分离培养

2.荧光染色法（金胺O法）（1）染色剂：金胺0.01g溶于95％乙醇 10ml内，加5 ％石炭酸至100ml。脱色剂：3 ％盐酸乙醇。复染剂：0.5 ％高锰酸钾水溶液。（2）染色步骤：痰涂片火焰固定，加染色剂， 10~15分钟水洗。脱色剂脱色3~5分钟，至无黄色，水洗。复染剂染2分钟，水洗，干后用荧光显微镜镜检。（3）结果：结核分枝杆菌呈金黄色荧光。如下图。
（二）集菌涂片法
取深咳痰10ml于消毒处理过的广口瓶中，加5倍量的无菌蒸馏水，经121℃高压蒸汽灭菌20min，待用。离心集菌法：取上述痰液10ml放入50ml离心管内加蒸馏水至50ml， 3000r/min离心30min，取沉淀物涂片。漂浮集菌法：取上述痰液10ml放入100ml细口玻璃容器内，加蒸馏水30ml，加入二甲苯0.3ml，振荡10min，加蒸馏水至满，静置15min，取载玻片盖于瓶口，静置15min，取下玻片，干后染色。目前我们实验室采用BaSO溶痰剂与痰检体2：1 或3：1混合均匀，静置10~20min，待其完全溶化，离心取沉淀涂片染色。简化了操作过程。
控制结核人人有责

3月24日是第13个“世界防治结核病日”，今年卫生部的宣传主题是“控制结核、人人有责”。疾病预防控制中心提出，目前结核病仍然是严重危害人类健康的主要传染病之一，75%的病人为中青年，每年死亡13万人。
结核分枝杆菌检测及相关内容
张东华
一、结核名称的由来
结核病是一种古老的疾病，也许有了人类不久就已有了它的存在。1973年，湖南长沙马王堆汉墓出土的2100年前的女尸身上发现左上肺门均有结核病灶。1965年，法国学者Sylvius根据解剖了死于所谓“消耗病”或“痨病”人的尸体，发现肺脏及其它器官有颗粒状的病变，根据其形态特征称之为“结核”。因而，结核的名称就此而被应用至今。

结核分枝杆菌实验室检测方法

• 按生长速度可分为三类，即缓慢生长菌、迅速生长菌和不能培养菌三种类型
结核分枝杆菌群
• 结核分枝杆菌，是人和动物结核病的病原体，包括人结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、牛分支杆菌（M.bovis）、非洲分支杆菌（M.africanum）和田鼠分枝杆菌（M.microti），前三种对人类治病，其中人型结核分枝杆菌感染发病率最高。
6
生物学形状
结核分枝杆菌为细长略带弯曲的杆菌，有时可见分枝状，无芽孢和鞭毛，因衰老或抗结核药物的作用可出现多形态，如球状、串珠状或丝状，大小为1～4X0.4μm。
细胞壁中含有大量脂质而不易着色，特别是有大量分枝菌酸包围在肽聚糖层的外面，一般用抗酸染色。萋尼染色呈红色，背景为蓝色；荧光染料金胺“O”染色，荧光显微镜下为橘黄色
培养特性
培养基
• 营养要求高，必须在含血清，卵黄，马铃薯，
甘油及无机盐类的特殊培养基上生长，常用的有罗氏固体培养基
• 专性需氧，3%-5%CO2能促进其生长最适温培养条度为35-37℃，最适pH为6.5-6.8
件
• 菌落粗糙型，表面干燥成颗粒状，不透明，乳
菌落特点
白色或淡黄色，菜花样
8
实验室检测方法
基于rpoB（利福平）和katG/inhA（异烟肼）的基因突变，对
耐多药结核病做出快速诊断。
➢ 通量：两个一线抗结核药（MDR） ➢ 速度：8周（药敏） 6 小时 ➢ 灵敏度：103 个菌/反应
24
五种结核检测方法效果评价
涂片法
MGIT 960 快速培养
斑点层析法
结核组：1260例
非结核组：100例
分子生物学检测方法

分枝杆菌属及检验

证明
• 全球性卫生问题
– 是艾滋病高发区人群的首要死因
• 世界防治结核病日
– 3月24日
结核分枝杆菌－－形态染色
• 细长略弯，丝状或分枝生长
• 无芽孢，无鞭毛，无荚膜,无菌毛
• 革兰染色阳性，不易着色
• 抗酸染色阳性,菌体被染成红色
• 结核分枝杆菌为细长略带弯曲的杆菌，大小1～ 4X0.4μm。牛分枝杆菌则比较粗短。分枝杆菌属的细菌细胞壁脂质含量较高，约占干重的60%，特别是有大量分枝菌酸(mycolic acid)包围在肽聚糖层
※液体培养基：形成菌膜，有毒株呈索状生长
• 初次分离需要营养丰富的培养基。常用的有罗氏（Lowenstein-Jensen）固体培养基，内含蛋黄、甘油、马铃薯、无机盐和孔雀绿等。孔雀绿可抑
制杂菌生长，便于分离和长期培养。蛋黄含脂质
生长因子，能刺激生长。根据接种菌多少，一般 2～4周可见菌落生长。菌落呈颗粒、结节或花菜状，乳白色或米黄色，不透明。在液体培养基中
教学大纲
• 掌握内容
– 结核分枝杆菌主要生物学性状；致病物质及致病机制；结核菌素试验原理及应用；微生物学检查法
• 了解内容
– 麻风分枝杆菌的形态染色特性、致病性及微生物学检查法
• 全世界有1/3人口，19亿人已感染结核分枝杆菌，15岁以下儿童感染者达1.8亿，每秒种就有一人感染，全球有2 000万活动性患者，新发病例 1 000万人，每年有300万人死于结核，死于结核的人数超过AIDS疾病、腹泻及热带病死亡人数的总和，是传染病死亡最多的。近年来AIDS的发病率上升，伴随结核病上升。我国解放前结核严重流行，发病率大于1%，有十痨九死之称，建国后人民生活水平提高，卫生条件的改善，抗痨药物的发现，特别是积极开展防痨工作，接种BCG，发病率和死亡率大大降低，但近年来有抬头趋势。

医学检验-微生物-分枝杆菌属测试题

第14章???分枝杆菌属测试题一、名词解释1.卡介苗（BCG）：是将有毒力的牛型结核分枝杆菌在含胆汁、甘油和马铃薯的培养基中，经过230次移种，历时13年培养而获得的减毒活疫苗。

预防接种后，可使人获得对结核分枝杆菌的免疫力。

2.抗酸杆菌(acid-fastbacilli)：抗酸杆菌的主要特点是细胞壁含有大量类脂，一般不容易着色，但经加温或延长染色时间着色后，能抵抗酸性乙醇的脱色，故得名。

又因此类细菌的形态是细长微弯的杆状，有分枝生长的趋势，故又称为分枝杆菌。

如结核杆菌、麻风杆菌等。

3.结核菌素试验：属于迟发型超敏反应，用结核菌素试剂作皮肤试验，感染过结核分枝杆菌或接1.下列细菌中繁殖最慢的是A.大肠埃希菌;B.丙型链球菌;C.脑膜炎奈瑟菌;D.结核分枝杆菌;E.肺炎链球菌2.在液体培养基中形成菌膜生长的细菌是A.变形杆菌;B.布氏杆菌;C.肉毒梭菌;D.结核杆菌;E.产气荚膜杆菌3.结核杆菌常用的培养基是A.沙保培养基;B.罗氏培养基;C.疱肉培养基;D.巧克力色培养基;E.亚碲酸钾培养基4.细胞壁含脂类最多的细菌是A.结核杆菌B.白喉棒状杆菌;C.衣氏放线菌;D.霍乱弧菌;E.幽门螺杆菌5.与结核杆菌抗酸性有关的成分是A.索状因子;B.磷脂;C.分枝菌酸;D.蜡脂D;E.硫酸脑苷脂6.结核杆菌侵入机体的途径,不可能的是A.呼吸道;B.消化道;C.破损的皮肤;D.泌尿道;E.节肢动物的叮咬7.不以内毒素或外毒素为致病物质的细菌是A.白喉棒状杆菌;B.炭疽杆菌;C.结核杆菌;D.绿脓假单胞杆菌;E.布氏杆菌8.人体对结核杆菌的免疫特点是A.以体液和细胞免疫并重;B.以体液免疫为主;C.为有菌免疫;D.不能通过人工主动免疫获得;E.可引起I型超敏反应16.???下列各成分与结核杆菌的致病性有关,除外的是A.结核杆菌索状因子;B.磷脂;C.结核杆菌内毒素;D.蜡脂D;E.硫酸脑苷脂17.???关于结核菌素试验,下列哪项是错误的A.可用来选择卡介苗接种对象;B.检测机体细胞免疫和体液免疫状况;C.作为婴幼儿结核病的辅助诊断;D.红肿硬结直径大于0.5cm为阳性;E.试验阳性说明已感染过结核杆菌18.???下列哪种对象最适合接种卡介苗A.长期低热和咳嗽,疑为肺结核的患儿;B.OT试验阴性的麻疹患儿;C.OT试验阳性儿童;D.OT试验阴性儿童;E.OT试验阴性的细胞免疫缺陷者19.???一位18岁女学生就诊时主诉:近一个月来咳嗽,痰中时有血丝.消瘦并感疲乏无力、午后低热、心悸、盗汗、食欲不振.医生高度怀疑为肺结核并对其进行临床检查,其中痰标本微生物检查:痰标本集菌涂片后,应选用的方法是A.革兰染色法;B.墨汁染色法;C.特殊染色法;D.抗酸染色法;E.镀银染色法20.痰结核杆菌培养,应选用的培养基是（2）结核菌素试验：前屈臂皮下注射结核菌素，24-48小时后观察结果。

分枝杆菌属及检验考点总结

分枝杆菌属及检验考点总结一、结核分枝杆菌引起人和动物结核病的病原菌。

目前已知在我国引起人类结核病的主要有人型和牛型结核分枝杆菌。

（一）生物学特性1.形态与染色G+，细长或略带弯曲的杆菌，在培养基中可呈球状或丝状，陈旧培养物或干酪化的淋巴结中可见到分枝状。

抗酸菌。

既往在组织中曾发现革兰阳性的非抗酸颗粒，接种动物可产生典型的结核病变，后被称为Much颗粒。

2.培养特性◆专性需氧，在无氧条件下迅速死亡，在5%～10%C02环境中可刺激其生长。

需适当的湿度。

本菌生长缓慢，最快的分裂速度为18h一代。

◆固体培养基：2～6周才能长出菌落，呈干燥颗粒状，不透明，乳白色或米黄色，表面呈皱纹状，形似菜花。

◆液体培养基中生长较快，多为表面生长，形成菌膜，且干燥易碎而沉于管底。

有毒力菌株在液体培养基中可呈索状生长，无毒株则无此现象。

◆营养要求较高，必须在血清、卵黄、马铃薯、甘油以及某些无机盐类的特殊培养基上才能生长。

3.生化反应◆不发酵糖类，能产生过氧化氢酶，耐热触酶试验、聚山梨酯-80水解试验和耐热磷酸酶试验均为阴性，脲酶试验和中性红试验均为阳性。

◆人型结核分枝杆菌：烟酸试验、硝酸盐还原和烟酰胺酶试验均为阳性；牛型结核分枝杆菌均阴性。

4.抵抗力：对酒精敏感。

5.变异性：形态、菌落、毒力、免疫原性和耐药性等变异。

毒力变异：卡介苗（BCG）——将有毒的牛型结核分枝杆菌培养。

于含有甘油、胆汁、马铃薯的培养基中经13年传种230代，获得减毒菌株，再接种动物，不能致病而使其获得免疫力。

用于预防结核病。

（二）临床意义1.致病性◆不产生内毒素和外毒素，也无荚膜和侵袭性酶。

◆主要致病物质：脂质。

索状因子（破坏细胞，引起肉芽肿）、磷脂（形成结核结节）、硫酸脑苷脂（抑制吞噬体与溶酶体结合）、蜡质D（引起迟发性过敏反应）。

◆主要通过呼吸道、消化道和受损伤的皮肤侵入易感机体，引起多种组织器官的结核病，其中以通过呼吸道引起的肺结核最多见。

◆肺外感染可发生在脑、肾、肠及腹膜。

麻风分枝杆菌的实验室检查

C 碱性美兰液，取美兰2G，溶于95%酒精100ML中制成饱和液，再取饱和液30ML加入蒸馏水100ML及10%的氢氧化钾0.1ML混匀即成。
（2）染色:
A 固定，以钟摆的速度将涂片通过酒精灯火焰中部3次。
B 滴入足够的石碳酸复红液（将涂膜全部覆盖）于玻片涂片上，加热使冒气，保持10分钟。
麻风分枝杆菌的实验室检查
一、临床意义
（1）麻风病人的诊断；（2）麻风病人的疗效观察；（3）确定三联化疗治疗方案；（4）判断预后、确定复发；（5）科研。如鼠足垫接种、药
物筛选等。
二. 取材部位的选择
（1）常规查菌部位:眉弓、耳垂、下颌、皮损。
（2）结节取中央、斑块取边缘交界处。
（2）不要直接报告“查见麻风杆菌”或“未查见麻风杆菌”。
八、注意事项
1、涂片质量要高：涂片厚薄一致，涂点大小一致，不含红细胞，最好每个视野有一两个巨噬细胞。
2、染色质量要好：麻风杆菌成鲜红色，淋巴细胞呈兰色。
3、显微镜分辨率要好； 4.检验人员技术要硬。
（3）雷德里计数标准:
0=观察100个油镜视野未查见ML。
1=观察100个油镜视野查见1-10条
2=观察100个油镜视野，
平均每10个视野有1-10 ML。
3=观察25个油镜视野，
ML。
平均每视野有1-10
平均每视野有100-1000条ML
（4） BI指数（细菌指数）计算公式:
BI （细菌指数）=
（2）自然干燥后妥善保管, 防蚊蝇吃掉, 防玻片断裂, 注意编号, 查对真实姓名, 保证玻片编号及姓名与真实姓名吻合。
（3）防止混血和污染。
麻风病人面部温度示意图

结核分枝杆菌的核酸检测

（1）采集标本前，应清洗外生殖器，推荐连续采集3天清晨中段尿于无菌容器中，用于培养的尿液标本至少需要40ml
（2）只有在不能获得中段尿时，可以使用导尿术采集标本。
（3）标本运送不及时，应冷藏保存。
5. 无菌采集的体液（脑脊液、胸水、腹水、心包积液、关节液、骨髓）
（1）临床医生采用抽吸技术或外科操作无菌收集体液标本于无菌容器。
结核分枝杆菌核酸检测
增加分子生物学阳性可以作为确诊标
准，及强调病原学检查的重要性。
3.4.2 分子生物学检查结核分枝杆菌核酸检测阳性。 4 诊断原则肺结核的诊断是以病原学（包括细菌学、分子生物学）检查为主，结合流行病史、临床表现、胸部影像、相关的辅助检查及鉴别诊断等，进行综合分析做出诊断。以病原学、病理学结果作为确诊依据。 5.3 确诊病例结核分枝杆菌核酸检测阳性，及胸部影像学检查支持即可确诊。
阳性结果：患者存在结核感染，但是不能区别是否为活动性结核病。
结核杆菌DNA及Xpert标本：为防止标本凝固，需加入 EDTA抗凝处理（可注入于长紫管中颠倒混匀抗凝处理）。
IFN-γ释放试验（T-SPOT.TB）标本：分离淋巴细胞需加入肝素抗凝，抗凝比例为100ml胸腹水加入0.8ml肝素，颠倒混匀。
（2）标本尽可能快的运送到实验室
（3）应提交足够量的样本，脑脊液＞5ml，胸水和腹水5 ～10ml。
▪ INH单耐药的患者通常不会考虑立即改变治疗方案，与此相反，对RIF单耐药的患者，无论INH是否耐药，都会采取与耐多药患者相同的治疗方案1。
▪ 约90%利福平耐药的结核患者同时异烟肼耐药，也就是耐多药结核患者2。
1. Sven O. Friedrich et al,. Suitability of Xpert MTB/RIF and Genotype MTBDRplus for Patient Selection for a Tuberculosis Clinical Trial. Journal of Clinical Microbiology. 2011 (49):2827-2831.

几种常见的结核分枝杆菌快速检测方法

肺结核属于肺部慢性传染疾病，临床发病率高，该病的主要致病菌为结核分枝杆菌，病程相对较长，会向全身多个脏器累及。

菌阴肺结核指的是通过一次结核杆菌培养以及三次痰涂片检查，结果均显示为阴性的肺结核患者，具有较低的传染性。

大多数患者不了解菌阴肺结核的相关性知识，如果没有采取及时有效的诊断、治疗，患者的病情就会延误，继而转变为阳性，对患者的预后造成不利影响。

目前，临床中对于菌阴肺结核的特异性诊断措施相对缺乏，最常用的方法就是痰或呼吸道采集标本中结核分枝杆菌的检验。

近年来，结核病的发病率及死亡率呈现逐年上升的趋势。

筛选出一种能有效确诊早期结核病的检验方法十分重要。

目前临床上应用于辅助结核病诊断的检验方法以结核分枝杆菌培养和抗酸染色涂片为主，其中培养法作为结核疾病诊断的金标准具有准确性高、特异性高的优势。

结核分枝杆菌痰的分离培养，消耗时间较长，如果利用固体改良罗氏培养基进行培养，一般会需要至少20d，最长可需要60d，如果使用先进的全自动分枝杆菌进行检测，至少需要7d，至多需要20d。

实验室一般会通过痰涂片法进行检测，该方法的操作相对简单，价格较低，但是，操作费时，在基层痰检实验室涂片量过大的时候，一天内无法得到实验结果，这种现象无法满足目前的结核病防治工作。

近些年来，随着染色技术的逐渐先进，荧光染色技术作为新型的实验手段，已经在医学科学领域中广泛应用。

目前，涂片染色法已经成为无菌体液的主要检查方法，但是，通过传统制片以及染色法的检出率相对较低，误诊率以及漏诊率较高。

主要是因为染色时制片以及标本固定环节容易出现误差，而细胞沉淀仪法、改良的抗酸染色法、萋-尼氏抗酸染色法、金胺O荧光染色法、PCR等技术的应用越来越多。

传统方法：获取痰标本后，排除口水痰，然后纳入研究范围，确认纳入的当天，需要在每份痰标本相同位置，取两份，制成痰涂片。

离心处理标本，再在洁净的玻片上涂抹沉渣，涂完一层之后，使其自然干燥，再次涂抹，形成厚涂片，先使用萋尼抗酸染色法进行染色，随后使用石炭酸复红溶液初染，再使用盐酸酒精脱色，然后用美兰复染，寻找红色区域，待涂片干燥后置于显微镜镜检，于蓝色背景中寻找红色的杆状、分枝状细菌。

分枝杆菌菌种鉴定基因检测试剂盒

Bactec TB960 系统
含硝基苯甲酸(PNB)和2-噻吩羧酸肼(TCH)培养能快速鉴别结核和非结核分枝杆菌，但很难将非结核分枝杆菌进一步分型。
结核（人型）结核（牛型）
非结核Βιβλιοθήκη PNB 不长不长长TCH 长不长长
产品特点
MSM MTC MTR
MIN MAV MAU
MKA MSC MGA
主讲内容:
➢ 产品 ➢ 竞争对手
产品背景
根据国际分类法，将分枝杆菌分为三大类（Runyon分类法）：一、缓慢生长菌群
1．结核菌群（又称结核分枝杆菌复合群）：包括人型结核杆菌，牛型结核杆菌，非洲分枝杆菌，田鼠分枝杆菌。 2．I群光产色菌。如：堪萨斯、海分枝杆菌等。 3．Ⅱ群暗产色菌。如：瘰疠、戈氏分枝杆菌。 4．Ⅲ群不产色菌。如鸟型、胞内、溃疡分枝杆菌等。二、迅速生长菌即Ⅳ群菌，包括偶发、龟、耻垢分枝杆菌等。三、需要特殊营养菌包括麻风分枝杆菌、鼠麻风分枝杆菌、副结核分枝杆菌。 Runyon分类法中的 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ群分枝杆菌又称为非结核分枝杆菌 (nontuberculosis mycobacteria ，NTM)
➢ 公司：生物梅里埃中国
➢ 产品名称：
➢ Geno type Mycobacterium CM(common mycobacteria)(13种 )
➢ Geno type Mycobacterium AS(additional species)(16种)
韩国REBA Myco-ID
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致病性结核病麻风病结核样病变成人类似结核病，儿童淋巴腺炎儿童淋巴结炎皮肤创伤后脓肿皮肤创伤后脓肿皮肤创伤后脓肿水中擦伤的皮肤感染及溃疡病变类似结核病局部脓肿皮肤广泛坏死和溃疡

15第十五章分枝杆菌属检验

第十五章分枝杆菌属检验一、名词解释1.卡介苗（BCG）2.抗酸杆菌(acid-fast bacilli)3.结核菌素试验4.旧结核菌素(OT)5.索状因子二、选择题【A1型题】1.下列细菌中繁殖最慢的是A、大肠埃希菌B、丙型链球菌C、脑膜炎奈瑟菌D、结核分枝杆菌E、肺炎链球菌2.在液体培养基中形成菌膜生长的细菌是A、变形杆菌;B、布氏杆菌;C、肉毒梭菌;D、结核杆菌;E、产气荚膜杆菌3.结核分枝杆菌常用的培养基是A、沙保培养基B、罗氏培养基C、疱肉培养基D、巧克力色培养基E、亚碲酸钾培养基4.细胞壁含脂类最多的细菌是A、结核杆菌B、白喉棒状杆菌C、衣氏放线菌D、霍乱弧菌E、幽门螺杆菌5.与结核分枝杆菌抗酸性有关的成分是A、索状因子B、磷脂C、分枝菌酸D、蜡脂DE、硫酸脑苷脂6.关于结核分枝杆菌侵入机体的途径 ,不可能的是A、呼吸道B、消化道C、破损的皮肤D、泌尿道E、节肢动物的叮咬7.不以内毒素或外毒素为致病物质的细菌是A、白喉棒状杆菌B、炭疽芽胞杆菌C、结核分枝杆菌D、铜绿假单胞菌E、布鲁菌8.人体对结核分枝杆菌的免疫特点是A、体液免疫和细胞免疫同时存在B、以体液免疫为主C、有菌免疫D、不能通过人工主动免疫获得E、可引起I型超敏反应9.卡介苗是A、经甲醛处理后的人型结核分枝杆菌B、加热处理后的人型结核分枝杆菌C、发生了抗原变异的牛型结核分枝杆菌D、保持免疫原性 ,减毒的活的牛型结核分枝杆菌E、保持免疫原性 ,减毒的活的人型结核分枝杆菌10.卡介苗的接种对象主要是A、结核性脑膜炎患者B、结核菌素试验阳性者C、严重结核病人 , 结核菌素试验阴性患者D、新生儿和结核菌素试验阴性的儿童E、老年人11.有关结核菌素试验 ,下述错误的是A、属于皮肤迟发型超敏反应B、可检测机体对结核杆菌的免疫状况C、皮肤反应程度以局部红肿，硬结的直径为标准D、可检测机体细胞免疫功能E、12～18小时观察结果12. 结核菌素试验为阳性反应 ,下述叙述可能错误的是A、表明机体已感染过结核杆菌;B、表明机体接种卡介苗成功;C、表明机体对结核杆菌有一定的特异性免疫;D、表明机体对结核杆菌有迟发型超敏反应;E、表明机体对结核杆菌无免疫力13. 从痰中检出具有临床诊断意义的细菌是A、表皮葡萄球菌B、金黄色葡萄球菌C、甲型溶血型链球菌D、脑膜炎奈瑟菌E、结核分枝杆菌14.下列各细菌细胞壁中含脂量最多的是A、结核杆菌B、白喉杆菌C、放线菌D、霍乱弧菌E、幽门螺杆菌15.关于结合分枝杆菌生物学特性的叙述，错误的是A、专性需氧B、抗酸染色呈红色C、菌落表面粗糙呈菜花状D、耐酸碱E、耐煮沸，100℃，15分钟才死亡16.下列各成分与结核杆菌的致病性有关 ,除外的是A、结核杆菌索状因子B、磷脂C、结核杆菌内毒素D、蜡脂DE、硫酸脑苷脂17.关于结核菌素试验,下列错误的是A、可用来选择卡介苗接种对象B、检测机体细胞免疫和体液免疫状况C、作为婴幼儿结核病的辅助诊断D、红肿硬结直径大于0.5cm为阳性E、试验阳性说明已感染过结核杆菌18.下列最适合接种卡介苗的对象是A、长期低热和咳嗽，疑为肺结核的患儿B、OT试验阴性的麻疹患儿C、OT试验阳性儿童D、OT试验阴性儿童E、OT试验阴性的细胞免疫缺陷者19.一位18岁女学生就诊时主诉：近一个月来咳嗽，痰中时有血丝。

微生物检验学之分枝杆菌属及检验

分枝杆菌属及检验分枝杆菌属是一类细长或略带弯曲、为数众多（包括54个种）呈分支状生长的需氧杆菌。

因其繁殖时呈分支状生长故称分枝杆菌。

本属细菌的主要特点是细胞壁含有大量脂类，可占其干重的60%，这与其染色性、抵抗力、致病性等密切相关。

耐受酸和抗乙醇，一般不易着色，若经加温或延长染色时间而着色后，能抵抗3%盐酸乙醇的脱色作用，故又称抗酸杆菌。

需氧生长，无鞭毛，无芽胞和荚膜。

引起的疾病均为慢性，有肉芽肿病变的炎症特点。

分枝杆菌的种类较多，包括结核分枝杆菌、非典型分枝杆菌和麻风分枝杆菌。

非典型分枝杆菌是一大群分枝杆菌的总称，与人类有关的非典型分枝杆菌主要有堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、戈分枝杆菌、鸟分枝杆菌、蟾分枝杆菌、龟分枝杆菌、偶发分枝杆菌和耻垢分枝杆菌等。

本属细菌无内外毒素，其致病性与菌体某些成分如索状因子、蜡质D及分枝菌酸有关。

根据国际分枝杆菌分类研究组（IWGMT）的方案将本属细菌分为三类，即缓慢生长菌、迅速生长菌和不能培养菌。

一、结核分枝杆菌在我国引起人类结核病的主要有人型和牛型结核分枝杆菌。

（一）生物学特性1.形态与染色结核分枝杆菌为细长或略带弯曲的杆菌。

在培养基中可呈球状或丝状，陈旧培养物或干酪化的淋巴结中可见到分枝状。

抗酸染色时因菌体含有大量脂类而不易着色，无论是否经碘液处理，着色后均不易被盐酸乙醇脱色，所以使菌体呈红色。

本菌无芽胞、无鞭毛，近年发现有荚膜。

2.培养特性本菌专性需氧，在无氧条件下迅速死亡，在5%～10%CO2环境中可刺激其生长。

烛缸不适合本菌培养，需用二氧化碳培养箱。

培养温度适应范围较大，35～40℃均可生长，最适温度为35～37℃。

最适pH为6.5～6.8。

兼性胞内寄生菌，在细胞内外均可发育繁殖，强毒株可长期生存于巨噬细胞内。

生长时还需适当的湿度。

本菌生长缓慢，最快的分裂速度为18小时一代。

在固体培养基上，一般需2～6周才能长出菌落。

菌落呈干燥颗粒状，不透明，乳白色或米黄色，表面呈皱纹状，形似菜花。

临床微生物学检验第14章分枝杆菌

三、微生物学检验
（二）标本采集 • 据感染部位的不同采集不同的标本 • 疑肺结核：收集清晨第一口痰，清洁干燥的容器内送检 • 疑泌尿系结核：清晨一次全部尿量或24小时尿沉淀10～
15ml送检，必要时作无菌导尿送检（诊断泌尿道结核通常需3～5份标本） • 采集脓液应直接从溃疡处取脓汁或分泌物,深部脓肿用无菌注射器抽取送检 • 其他：无菌抽取脑脊液、胸水、腹水及关节液等盛无菌试管送检。脑脊液标本静置后，表面可有细薄凝块，取凝块作涂片或接种培养
• WHO已把结核病与AIDS、疟疾一起列为人类的最主要杀手
二、临床意义
(一) 所致疾病通过呼吸道、消化道和损伤的皮肤等多途径
感染机体，引起多种脏器的结核病，其中以肺结核为多见 (二)免疫性
有菌免疫或称传染性免疫细胞免疫迟发型超敏反应
二、临床意义
(三) 变异 • 结核分枝杆菌易发生形态、菌落、生长温度、毒
生化反应--烦琐、费时（ 4～8 周）,影响因素多
• 结核分枝杆菌不发酵糖类 • 能产生触酶 • 人型MTB能合成烟酸，还原硝酸盐，耐受
噻吩-2-羧酸酰肼，而牛型MTB则不能 • 人型和牛型的毒株中性红试验均阳性，无
毒株则为阴性，并失去索状生长现象
噬菌体鉴定法（PhaB）
• Wilson 等于1997年建立的快速检测新技术 • 原理：是分枝杆菌噬菌体D29能感染活的分
二、临床意义
• 迄今为止已发现NTM有150余种，其中约 1/3与人类疾病有关。条件致病菌毒力低于结核分枝杆菌自然界中广泛存在可以在人体某些部位定植
• 结核病和NTM感染的治疗不同
为何要关注NTM？
自然界中广泛存在，如水、土壤和气溶胶，可导致免疫力低下的患者感染。近年来，因手术器械、注射器具及医疗用水等灭菌不合格、使用不规范造成患者手术切口、注射部位NTM感染暴发事件。