抑制性消减杂交技术主要包括如下几个基本步骤
三种差异表达基因克隆方法的比较
三种差异表达基因克隆方法的比较[摘要] 为了能快速、有效、准确地克隆出有意义的基因,本文就常用的三种基因克隆方法,即差异显示PCR、抑制性消减杂交、PAP-PCR,从其原理、应用、优越性、主要缺陷等几方面进行了简要概述。
这些方法为中医、针刺治疗各种疾病过程中有关的基因差异表达,以及有关基因分子克隆提供有效的分子生物学工具。
[主题词] 针灸原理;基因表达;克隆,分子;聚合酶链反应高等生物大约有100000个不同的基因,但在生物体内任一细胞中只有15%的基因得以表达。
而这大约15000个基因的表达是按时间和空间顺序有序地进行着,这种表达方式即为基因的差别表达(differentialexpression)[1]。
生物体表现出各种各样的特性,主要是其基因表达的差异引起的。
基因差异表达的变化有两种,即新出现的基因表达与表达量差异的基因表达。
由于基因表达的变化是调控细胞生命活动过程的核心机制,通过比较同一类细胞在不同生理状态下或在不同生长发育阶段的基因表达差异,可为分析生命活动过程提供重要信息。
当前,人类基因组研究的重心正在由“结构”向“功能”转移,一个以基因组功能研究为主要内容的所谓“后基因组时代”(post genomics),即功能基因组(func tionalgenomics)时代即将到来,这就决定了寻找差异表达基因成为分子生物学的研究热点之一。
目前已有针灸科研工作者从分子生物学水平探讨针灸治疗各种疾病的可能机理。
有实验[2]报道针刺翳风等穴位面神经组织中NT 3及TrKCmR NA表达增加;针刺后癫痫大鼠海马内nNOSmRNA和iNOSmRNA增加[3];针刺可调节CCK 8mRNA、THmRNA、SOMmRNA、c fos\c junmRNA、CGRPmRNA的增减[4]。
为适应当前医学的发展,为满足针灸科研工作者分子生物学研究的需要,本文对差异显示PCR、抑制性消减杂交及RNA任意引物PCR三种常用的差异基因筛选法,分别从其基本原理、过程、应用范围及优缺点等作一个简介。
抑制性减法杂交技术
抑制性减法杂交技术1996年，L. Diatchebko在RDA的基础上建立了抑制性减法杂交（supression subtractive hybridization, SSH）技术，该技术是RDA技术的发展，能有效克服RDA或cDNA RDA技术难以解决的问题，如两者不能用于分离两组基因表达差异较小的基因，也不能用于研究存在上调表达的基因等。
(1) SSH的主要原理SSH的核心技术是抑制性PCR (suppression PCR )，它是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤结合为一体的技术。
其中标准化步骤均等了检测子中的cDNA单链丰度，而消减杂交步骤去除了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。
因此SSH显著增加了获得低丰度表达差异cDNA的概率，简化了对消减文库的分析。
抑制PCR是利用链内复性优先于链间复性的原理，使非目标序列片段两端的长反向重复序列(long inverted repeats)在复性时产生“锅柄样”(panhandle-like）结构或“发夹结构”而无法与引物配对，从而选择性地抑制了非目标序列的扩增。
同时，根据杂交的二级动力学原理，丰度高的单链cDNA复性时产生同源杂交速度要快于丰度低的单链cDNA，从而使得丰度存在差异的cDNA相对含量趋于基本一致。
（2）SSH的基本过程如图所示，SSH的主要步骤包括：限制性核酸内切酶切割，产生大小适当的平头末端cDNA片段。
②将检测cDNA分成均等的两份，分别接上接头1或接头2,接头（adaptor)由一长链(40nt)和一短链(l0nt)组成的一端是平末端的双链cDNA分子。
长链3′端与cDNA5′端相连。
长链外侧序列（约20nt）与第一次PCR引物序列相同，内侧序列则与第二次PCR引物序列相同。
此外，接头上含有升启动子序列及内切酶识别位点（如Not I, Srf I, Sma I和Xba I等），为以后将该片段插入克隆载体和测序提供便利。
抑制性消减杂交技术的应用[1]
![抑制性消减杂交技术的应用[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/a11ab97801f69e3143329423.png)
・技术与方法・生物技术通报B I O TECHNOLOGY BULL ET I N2009年第5期抑制性消减杂交技术的应用李小庆 景志忠(中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室,兰州730046) 摘 要: 基因的差异表达是调控各种生命活动的核心分子机制,而分离、克隆并进一步研究差异表达基因已成为现代分子生物学研究的热点,也是功能基因组学研究的重要内容。
在研究差异表达基因的诸多项技术中,抑制性消减杂交(SSH )技术具有特异性强、假阳性率低、灵敏度高和快速简便等优点,被广泛地应用于生命科学和医学领域的基因差异表达的研究中。
近年来,抑制性消减杂交(SSH )技术得到了相应的改进和完善,而在许多研究领域,该技术在广度和深度上都有了一些新进展。
主要就抑制性消减杂交技术的产生背景、原理、技术流程、特点及其最新应用研究进展等方面作简要综述。
关键词: 抑制性消减杂交 差异表达 功能基因 DS N 均一化技术 c DNA 微阵列Suppressi on Subtracti ve Hybr i di zati on Techn i que andProgress i n the Appli cati onL i Xiaoqing Jing Zhizhong(Lanzhou Veterinary R esearch Institute CAAS,Key Laboratory of Ani m al Parasitology of Gansu P rovince,Key Laboratory of Veterinary PublicHealth of M inistry of Agriculture,S tate Key Laboratory of Veterinary E tiological B iology,Lanzhou 730046) Ab s trac t: D ifferential exp ressi on of genes is the centralmolecular mechanis m of regulating all kinds of life acti ons 1Among all thetechnol ogies of identifying differential exp ressed genes,supp ressi on subtractive hybridizati on (SSH )is considered t o be with high s peci 2ficity,l ow backgr ound,high sensitivity,convenient mani pulati on,and had been widely app lied in life science and medicine research fields 1I n this paper,the p rinci p le,method,characteristics and the research p r ogress of SSH technique were intr oduced 1Key wo rd s: Supp ressi on subtractive hybridizati on D ifferential exp ressi on Functi onal genes DS N (dup lex 2s pecific nuclease )2nor malizati on method c DNA m icr oarray收稿日期:2008211211基金项目:国家自然科学基金项目(30871884),国家高新技术“863”项目(2006AA10A203),甘肃省支撑计划项目(0804NKCA076)作者简介:李小庆(19832),男,硕士,专业方向:畜禽疫病的分子生物学与免疫学通讯作者:景志忠,博士,研究员,主要从事病原与宿主的分子生物学与免疫学研究;E 2mail:zhizhongj@yahoo 1com 1cn 上世纪90年代以来,随着分子生物学技术的快速发展以及多物种包括人类的基因组全序列测定计划的陆续完成,分子生物学的研究热点已经从结构基因组研究转向基因功能和表达调控的功能基因组研究,于是多种用于差异表达分析的基因克隆技术相继问世。
抑制性差减杂交技术_SSH_在植物学研究中的应用
抑制性差减杂交技术( SSH) 在植物学研究中的应用
阎爱华, 王冬梅
( 河北农业大学 生命科学学院, 河北 保定 071001)
摘要 : 抑制性差减杂交是一种基于转录水平的杂交技术, 能将差异表达 基因扩增 千倍后富集, 具有 高效、灵 敏、操 作简单, 假阳性率低等特点, 已经越来越多的被应用在植物学研究领域。就该 技术的原理、特点 及其在植物 学方面的 应用研究进展作一简要介绍。
DNA 微阵列技术 DNA microarray
巨克隆技术 M egaclone
将基因片段、寡聚核苷酸、cDNA 等固定 在硅质、塑料、玻 璃或尼龙膜 上, 用不 同组 织或 来源 的 mRNA 制 成探 针, 与芯片杂 交, 根 据信 号 查找 差 异 片段 并 进行 克 隆 和分 析。 cDNA 连上不 同的标签 ( tag ) , 与 带有 antitag 的 microbeads 杂交, 固定 cDNA, 并 且每 个 microbead 上 只与 一个 c。
基因差异表达分析方法
Methods of different gene expression techniques
基本原理
The basic principles of different gene expression techniques
优点 Advantage
缺点 Disadvantage
mRNA 差异显示 PCR mRNA differential display
收稿日期: 2008- 08- 11 基金项目: 国家自然科学基金资助项目( 30671244) ; 河北省应有基础研究计 划重点基础研究 项目资助( 08965505D) ; 河北省自然科 学基金
抑制差减杂交技术原理及常见操作结果分析
将RsaI酶切完全的cDNA用adapter1和adapter2R两 种接头连接。通过PCR扩增检测连接效率。 PCR的引物根据RsaI位点和adapter1、adapter2R 的序列设计。这一般要求扩增的片段中不含RsaI 位点序列。在扩增后琼脂糖胶电泳检测结果中, 如果用一个基因特异性引物和一个接头引物所得 到的带亮度与两个基因特异性引物所得到的带的 亮度一致,说明连接较好;如果用一个基因特异性 引物和一个接头引物所得到的带亮度只有两个基 因特异性引物所得到的带的亮度的25%,则说明连 接效率不到25%,应检查RsaI酶切效果并重新连接。
3 抑制差减杂交技术的优缺点
3.1 与其他几种方法相比,SSH技术具有较明显的优越性: (1)通过两步消减杂交和两次抑制PCR可DDRTPCR和cDNA-RDA法中,低丰度的 mRNA一般不易被检测到,SSH方法所做的均等化和目 标片段的富集,保证了低丰度mRNA 也可被检测出。 (3)速度快,效率高。一次SSH反应可 以同时分离几十或成百个差异表 达基因。
抑制差减杂交技术原理 及常见操作结果分析
摘要
抑制差减杂交 (SuppressionSubtractiveHybridization,SSH)是一种 高效鉴定和分离克隆差异表达基因的新技术。 目前,该技术在分子生物学研究的各个领域得 到了广泛的应用作了较全面的介绍,可为研究者们 提供参考。
2.4 第一次杂交、第二次杂交和PCR扩增
将经RsaI消化的drivercDNA和分别连接有adapter1、 adapter2R的testercDNA混合进行第一次杂交。再将第一次 杂交的两个样本混合在一起,同时加入新鲜的drivercDNA, 以进一步富集差异表达序列。在两端具不同接头的差异 表达的cDNA形成新的杂交分子。
抑制消减杂交SSH步骤(精)
抑制消减杂交SSH步骤一、cDNA第一链的合成1、在0.5ml经DEPC处理过的离心管中分别加入tester和driver的mRNA各2 ug，然后加入1ul（10uM）随机引物（9mer），70℃温浴2min，然后迅速置于冰上放置2min，然后在每管中加入如下混合物：2、42℃反应1.5hr，然后将离心管置于冰上，终止cDNA第一链的合成，然后马上进行第二链的合成。
二、cDNA第二链的合成1、在已经合成好cDNA第一链的离心管中加入每管如下反应物，16℃反应2hr：2、加入2ul（6U）T4 DNA Polymerase，16℃反应30min。
3、加入20×EDTA/Glycogen Mix 4ul，以终止反应。
4、加入100ul 苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提，并沉淀出cDNA双链，溶解于50ul双蒸水中。
三、cDNA质量检测设计特异性引物，目标片段大小为427bp。
以反转录所得cDNA为模板，若PCR 扩增能得到目标片段，说明线粒体mRNA已经成功反转录。
四、Rsa I酶切双链cDNA1、tester和driver cDNA经37℃过夜酶切，酶切体系为：2、每管用2.5ul EDTA/Glycogen混合物终止反应。
3、加入50ul 苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提，并沉淀出酶切后的cD NA双链，溶解于5.5ul双蒸水中。
五、接头连接酶切消化的tester双链cDNA分为两份，一份与Adaptor 1连接，另一份与Ad aptor 2连接，具体步骤如下：1、取1ul酶切的tester ds cDNA用5ul ddH2O稀释；2、连接反应液（Ligation Master Mix）的制备如下：3、在两个EP管中分别加入如下试剂：4、在另一离心管中混合1.5ul tester1-1和1.5ul tester1-2，连接反应完成后即为本实验所需要的unsubtracted tester control 1-c；5、轻微离心，16℃过夜连接；6、加入1ul 20×EDTA/Glycogen Mix，终止反应；72℃温育5min使ligase失活；7、取1ul unsubtracted tester control 1-c，用1ml ddH2O稀释，该样品将用来进行PCR检测；8、所有样品放入-20℃保存。
抑制性消减杂交技术介绍
M: ФX174-Hea Ⅲ消化。 1: 杂交骨骼肌肉tester二次PCR产物 2 : 未杂交的骨骼肌肉tester
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G3PDH基因得到了极大的扣除
January 17, 2020
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差异表达基因的富集与看家基因的扣除
以2ug/ml PHA和2ng/ml PMA处理72小时后的人类Jurkat T细胞的cDNA作 为Tester ，未处理的cDNA作为Driver。Tester cDNA、Driver cDNA及消减 后的cDNA扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳（每个孔上样量为 0.3ug）并转移到尼龙膜上，分别与已知活性的IL-2Rα基因和看家基因 G3PDH核酸探针进行杂交。
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抑制后的应答基因 鉴定抗病毒相关基因 ......
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January 17, 2020
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抑制性消减杂交实验方法
正向消减
Tester
处理组
反向消减 Driver
Driver
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非处理组
Tester
January 17, 2020
抑制性消减杂交
主要内容
1 抑制性差减杂交技术概 述
2 抑制性差减杂交原理
3 抑制性差减杂交流程
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January 17, 2020
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抑制差减杂交技术SSH
定义：抑制差减杂交（SSH）SSH 是一种基于抑制PCR和差减杂交 技术建立的,在转录水平上研究基 因表达的技术。
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A, B, C, D
A B C
E
末端补齐
D
EE
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实验流程
[转载]基因文库构建的过程、原理及方法
![[转载]基因文库构建的过程、原理及方法](https://img.taocdn.com/s3/m/75baf7f9162ded630b1c59eef8c75fbfc77d94c1.png)
[转载]基因⽂库构建的过程、原理及⽅法原⽂地址：基因⽂库构建的过程、原理及⽅法作者：蓝茶基因⽂库构建的过程、原理及⽅法1 cDNA ⽂库的构建1.1 cDNA ⽂库构建的基本原理与⽅法cDNA ⽂库是指某⽣物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA ⽚段与某种载体连接⽽形成的克隆的集合。
经典 cDNA ⽂库构建的基本原理是⽤ Oligo(dT) 作逆转录引物，或者⽤随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得⽂库。
其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取⽅法的选择主要根据不同的样品⽽定)，要构建⼀个⾼质量的 cDNA ⽂库，获得⾼质量的 mRNA 是⾄关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细⼩⼼。
由于 RNA 酶存在所有的⽣物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建⽴⼀个⽆ RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。
在获得⾼质量的 mRNA 后，⽤反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第1链， cDNA 第2链的合成(⽤RNA 酶 H 和⼤肠杆菌 DNA 聚合酶 I，同时包括使⽤ T4 噬菌体多核苷酸酶和⼤肠杆菌 DNA 连接酶进⾏的修复反应)，合成接头的加⼊、将双链 DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插⼊⽚断，扩增 cDNA ⽂库、对建⽴的 cDNA ⽂库进⾏鉴定。
这⾥强调的是对载体的选择，常规⽤的是λ噬菌体，这是因为λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可⽤来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳⼤⽚段的外源 DNA。
1.2 cDNA 全长⽂库经典 cDNA ⽂库的构建虽然⾼效、简便，但⽂库克隆的⽚段⼀般较⼩，单个克隆上的 DNA⽚段太短，所能提供的基因信息很少，⼤多需要⼏个克隆才能覆盖⼀个完整的全基因的 cDNA。
为了克隆到真正的 cDNA 全长，建⽴富含全长的 cDNA⽂库具有重要意义。
抑制差减杂交
抑制差减杂交（SSH）抑制差减杂交技术运用了杂交二级动力学原理,即高丰度的单链cDNA在退火时产生同源杂交的速度快于低丰度的单链cDNA,在试验组(tester)和驱动组(driver)的cDNA变性后再复性的过程中,原来在丰度上有差别的单链cDNA达到均一化。
同时,由于试验组的cDNA在进行杂交之前等分的两份加有不同的接头,因此杂交时将产生5种不同类型的分子a、b、c、d和e(图1),当采用与两个不同接头序列互补的引物进行PCR扩增时,只有目标序列得到有效扩增,非目标序列因两端存在反向重复序列,退火时易产生类似”锅柄”的结构,无法与引物配对,扩增受到抑制。
抑制差减杂交(SSH)技术的主要步骤有:(1)cDNA的合成与酶切;(2)试验组cDNA分成两份,并与两个不同的接头连接;(3)试验组(tester)的cDNA与过量的驱动组(driver)cDNA杂交;(4)选择性PCR扩增与接头相连的试验组cDNA分子;(5)克隆PCR产物,构建差减文库;(6)筛选文库SSH方法一般只用于两个样品的差异比较分析,样品间的差异不宜太大或太小,而对于多个样品则无能为力,这在很大程度上限制了它的应用。
提取tester RNA的时期非常关键,选择使用该方法时,首先要根据不同的研究目的确定取材的最佳时期,取材时期不当将会给试验带来意想不到的困难,或许只得到很少几个差减克隆或根本得不到克隆,或得到一些非目的克隆。
从技术本身讲,提取的tester RNA和driver RNA及从中分离的mRNA的质量、限制酶的酶切效率、接头的连接效率、第二次PCR产物的转化效率及差减克隆的筛选方法等关系着验的成败。
另外SSH所需的起始RNA量较大,一般为几微克,对于一些珍贵稀有的不易获得足够RNA的材料要慎重使用。
SSH方法在研究植物基因的差异表达方面已得到有效应用,该方法在应用范围和深度上可进一步拓宽和加深:(1)利用SSH方法研究生物(如细菌和真菌等)和非生物逆境(如干旱和寒冷等)对植物的影响及生物与寄主植物的互作时,可进一步提早取材时期(如逆境诱导后的6小时或更早)和缩短取材间隔,以获得植物差异表达基因的表达动态和进行有关转录因子等方面的研究,进而获得植物与逆境互作的关键点,更好地理解其互作机制,为从分子水平上定向培育抗旱、抗寒、抗病等作物提供更可靠的理论依据。
抑制差减杂交法_SSH_及其在植物中的应用
e)才得以指数扩增 ,而 c类因一端有接头 ,另一 端无接头 ,只能线性扩增 ,形成牢固的“锅 - 柄 ” 结构 ,不能有效扩增 。第二轮 PCR 实际上为巢 式 PCR ,极大地提高了扩增的特异性 ,使得差异 表达目的基因片段大量富集 。
3 SSH 的技术评价
3. 1 主要优点 (1)假阳性率较低 。 SSH方法采用加接头和
然后各自与过量的 D river cDNA 变性后退火杂 交 ,这时得到 4种产物 a, b, c和 d。这种不充分 杂交使单链 cDNA 分子在浓度上基本相同 ,同时 由于 Tester cDNA 与 D river cDNA 的序列相同片 段大都形成异源双链分子 c,使得差异表达基因 得到第一次富集 。然后混合两份杂交样品 ,同时 加入过量的新的变性 D river cDNA 进行第二次差 减杂交 ,这次杂交进一步富集了差异表达 cDNA , 并形成了两个 5’端分别接有不同接头的双链分 子 e。杂交完全后 ,补平末端 ,加入合适引物 (即 部分接头 1和接头 2的单链寡核苷酸片段 )进行 两轮 PCR扩增 。第一次 PCR 是基于抑制反应 , 只有两端连有不同接头的双链 cDNA 片段 (如
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山西农业科学 2007年 35卷第 4期
玉米 、小麦 、马铃薯 、大豆 、辣椒 、胡萝卜 、大麦 、棉 花 、康乃馨 、拟南芥 、甘蔗 、甜菜 、人参 、芒果 、灌 木 、梭梭 、橡胶树等多种植物 。
目前 , SSH方法在植物上的应用主要包括两 个方面 :一方面涉及植物的生长发育及组织特异 性研 究 。如 刘 军 等 [ 6 ] 以 水 稻 茎 尖 分 生 组 织 ( SAM )为对照材料 ,幼穗分生组织 ( pb / sb)为试 验材料 ,进行抑制性差减杂交 ,分离得到了 40个 水稻幼穗分生组织中特异表达或表达增强候选 基因 ; Kim M 等 [ 7 ]通过此技术分离得到了辣椒素 的生物合成相关基因 ; Feng DR 等 [ 8 ]也对水稻茎 尖分生组织和开花分裂组织的差异表达进行了 筛选 ; Kloos DU 等 [ 9 ]对甜菜根中表达的基因进行 了分离和鉴定 ; 常青山等 [ 10 ]同样应用此技术对 矮败小麦花药中特异表达的基因进行了研究 ;罗 志勇等也进行了人参皂苷生物合成相关基因的 筛选和鉴定 [11 ] ; 张雷等应用此项技术分离了胡 萝卜体细胞胚根发育相关基因 [ 12 ]等 。
抑制性消减杂交技术
抑制性消减杂交技术抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)技术是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术，其原理是以抑制性多聚酶链反应(PCR)反应为基础的cDNA 消减杂交技术。
通过合成两个不同的接头，连接于测试cDNA 片段的5’末端，达到选择性扩增差异性表达的cDNA 片段，抑制非目的cDNA的扩增。
该技术是Diatchenko 等1996年在抑制性PCR的基础上建立起来的cDNA消减杂交方法，它克服了DD法的假阳性较高和RDA法消减杂交轮次较多的缺点，十分适用于克隆分析造成某种特殊表型的目的基因及其功能。
抑制性消减杂交技术是一种以抑制性PCR 反应为基础，将标准化测试cDNA 单链步骤和消减杂交步骤合为一体的技术。
通过合成两个不同的接头，接于经限制性内切酶消化后的测试cDNA 片段的5’末端，将测试和驱动进行两轮杂交。
所谓抑制性PCR 是利用链内退火优于链间退火，使非目的序列片段两端的长反向重复序列在退火时产生“锅柄样”结构，无法与引物配对，从而选择性抑制非目的序列片段扩增。
抑制性消减杂交技术的基本实验过程如下。
首先，将要进行比较的两种组织或细胞来源的mRNA 样品反转录为cDNA，把含有目的基因的cDNA 称为测试(tester)，把参考cDNA 称为驱动(driver)，用同一种限制性内切酶Rsa I 切割，产生末端平头的片段，将测试cDNA 分为两份，每份连接不同的接头，即接头1(adaptor 1)和接头2(adaptor 2)。
接头为双链DNA 片段，且5’- 端均无磷酸基，这样保证只有接头中的长链可以与cDNA 的5’- 末端连接，两个接头含有可识别的序列. 接下来进行两次杂交。
第一次杂交每个测试里加入过量驱动，然后变性、退火，根据杂交动力学第二定律，即丰度越高的分子退火速度越快，因此测试cDNA与驱动cDNA相同片段大都形成异源双链分子，使得差异表达的单链分子得到富集。
某理工大学生物工程学院《现代分子生物学》考试试卷(516)
某理工大学生物工程学院《现代分子生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、分析题（5分，每题5分）1. 根据A基因序列设计原核表达引物。
A基因序列如下：ATGTCCGAAGTAATCGAAGAACATCTTCTCAGCGATAATTCTGATGATTCCAGCTCGGAAT TGACTTCTAC………GGACGAACCACGAAGAGACGATATTAApET28a多克隆位点如下引物设计必须满足：要求在引物两端分别加上BamHI（GGATCC）和EcoRI（GAATTC）。
要求表达的重组蛋白C端带His标签。
答案：设计引物时应注意：（1）酶切位点前后应添加1～6个保护碱基，以提高限制性端粒酶内切酶的切割效率。
（2）His标签位于酶切位点的下游，且靠近终止密码子，且mRNA的翻译方向是由N端向C端，所以目的片段插进时的顺序不颠倒。
（3）引物长度一般在18～27bp，且与目的片段有合适的互补长度以保证引物可以顺利结合。
上游引物可为（5′端至3′端）：CGCGGATCCGCGATGTCCGAAGTA。
下游引物可为（5′端至3′端）：GGCCTTAAGGCCAATTATAGCAGA。
解析：2、判断题（55分，每题5分）1. DNA的复制方法有多种，滚动式复制方式通常以双向方式进行。
（）答案：错误解析：DNA的复制方式通常以单向方式进行。
2. 顺式作用元件是指调控基因表达的蛋白质。
（）答案：错误解析：顺式作用器件指影响自身基因表达活性的DNA序列，与反式作用因子相互作用参与基因表达调节。
而反式作用因子指调控基因表达的蛋白质。
3. 一般情况下，质粒既可以整合到染色体上，也可以独立存在。
（）答案：错误解析：一般情况下，质粒主要是独立存在。
4. tRNA转录后加工有剪接反应，它是由蛋白质催化的。
应用抑制性消减杂交技术筛选HBxAg蛋白结合蛋白XBP1的上调基因
应用抑制性消减杂交技术筛选HBxAg蛋白结合蛋白XBP1的上调基因樊万虎;成军;刘小静;张树林;王琦【摘要】Objective Human gene XBP1 interacting with HBxAg protein (HBXBP1) has been identified by yeast-two hybrid and bioinformatic technique. The purpose of this study was to screen genes transactivated by HBXBP1 with suppression subtractive hybridization (SSH). Methods Suppression subtractive hybridization and bioinformatics techniques were used for screening and cloning of the target genes transactivated by XBP1 protein. The mRNA was isolated from HepG2 cells transfected pcDNA3. l(-)-myc-his( A)-XBP1 and pcDNA3.1 (-)-myc-his (A) empty vector, respectively; SSH method was employed to analyze the differentially expressed DNA sequence in the two groups. After restriction enzyme Rsa I digestion, small size cDNAs were obtained. Then tester cDNA was divided into two groups and ligated to the specific adaptor 1 and adaptor 2, respectively. After tester cDNA was hybridized with driver cDNA twice and underwent two times of nested PCR, it was subcloned into T/A plasmid vectors to set up the subtractive library. Amplification of the library was carried out with E. coli strain DH5α. The cDNA was sequenced and analyzed in GenBank with Blastn search after PCR. Results The subtractive library of genes transactivated by XBP1 was constructed successfully. The amplified library contained 100 positive clones. Colony PCR showed that 80 clones contained 200-1 000 bp inserts. Sequence analysis wasperformed randomly in 30rnclones, and the full-length sequences were obtained with bioinformatics method. We obtained altogether 30 coding sequences, which consisted of 28 known and 2 unknown ones. Conclusion XBP1 can upgrade the changes of many genes in HepG2 cells after being expressed in liver cells. The genes are closely related to cell signal transmission, cell proliferation and differentiation, immune response, energy metabolism, cell necrosis, and oncogenesis.%目的应用酵母双杂交及生物信息学(bioinformatics)技术获得HBxAg蛋白结合蛋白XBP1,为了解该基因的反式调节机制,利用抑制性消减杂交技术筛选并克隆XBP1蛋白反式激活的靶基因.方法以XBP1表达质粒pcD-NA3.1(-)-myc-his(A)-XBP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)-myc-his(A)为对照；制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并合成cDNA,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组,分别衔接两种不同接头,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次PCR反应,产物与T/A克隆载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR鉴定后进行测序及同源性分析.结果成功构建人XBP1蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA.扩增后得到80个200～1 000 bp插入片段的克隆,随机挑选其中30个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得28个已知编码序列基因和2个未知的新基因.结论 XBP1在肝细胞内表达后能够上调HepG2细胞中许多不同基因表达的变化,这些基因与细胞信号转导、细胞增殖与分化、免疫应答、能量代谢、细胞凋亡、肿瘤发生等生物过程密切相关.【期刊名称】《西安交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2012(033)006【总页数】5页(P671-675)【关键词】XBP1基因;HepG2细胞;抑制性消减杂交技术;反式调节【作者】樊万虎;成军;刘小静;张树林;王琦【作者单位】西安交通大学医学院第一附属医院感染科,陕西西安710061;北京地坛医院传染病研究所,北京100015;西安交通大学医学院第一附属医院感染科,陕西西安710061;西安交通大学医学院第一附属医院感染科,陕西西安710061;北京地坛医院传染病研究所,北京100015【正文语种】中文【中图分类】R575.1HBx是一种多功能的乙型肝炎病毒蛋白，能与多种蛋白相互作用，有存在于胞内的蛋白，如Jak1、PKC结合蛋白、Caspase-3等，有存在于胞核内的蛋白，如TFIIB、RXR、TBP等，还有穿梭于细胞质与细胞核间的蛋白，如Smad4、Tat结合蛋白等［1］。
抑制性消减杂交技术主要包括如下几个基本步骤
抑制性消减杂交技术主要包括如下几个基本步骤：（1）双链cDNA合成与酶切：分别提取待比较的两组细胞mRNA（实验方tester、驱赶方driver），利用随机引物反转录为双链cDNA后，用四碱基识别酶如Rsa I或HindⅢ切割成平均大小为600 bp左右的平端片段；该酶约在44=256 bp处就有一个切点，一分子而来的双链cDNA经该酶酶切后，可产生数个片段，每个片段一般＜600bp，可防止长链cDNA 片段所形成的复杂结构对有效消减杂交的干扰。
（2）两次消减杂交：将tester cDNA分为两组，分别于其5'端上接上两种不同的具有一段反向末端重复序列的寡聚核苷酸、去磷酸化接头（adaptor1, adaptor2），以利于随后的选择性扩增。
接头设计特点：①接头是由一长链（约40余个核苷酸）和一短链（约10余个核苷酸）组成的一端是平端的双链DNA片段，而且双链的5′均无磷酸基团，保证了接头以唯一方向与cDNA片段连接，即接头长链的3′端与cDNA双链5′端连接；②接头长链外侧（约20余个核苷酸）序列与第一次PCR引物序列相同，内侧序列与第二次PCR引物序列相同；③在接头上含有T7启动子序列，并且含有内切酶识别位点，为以后该片段插入克隆载体提供酶切位点。
两组tester cDNA样品分别与过量的driver cDNA进行第一次杂交，得到a、b、c、d四型分子，使原来丰度不同的单链cDNA得到大量富集，两组产物另加上新变性的drvier cDNA再次杂交，这样就产生了两个5'端有两个不同接头的e型分子，这种e型分子正是tester较driver特异表达cDNA，填平粘性末端。
第一次杂交中，将过量的driver cDNA分别加入两份tester cDNA中，变性后退火杂交。
第一次杂交后有4种产物a、b、c、d：a是单链tester cDNA；b是自身退火的tester cDNA 双链；c是tester和driver的异源双链；d是driver cDNA。
SSH抑制性消减杂交文库构建方法介绍
SSH抑制性消减杂交文库构建方法介绍SSH是一项可以快速获取两个不同生物材料中差异表达基因的分子生物学技术，是快速筛选差异表达基因的有效方法，也是寻找新基因的重要手段。
该技术尤其适合以genome尚不完全清晰的物种或者以特殊材料为研究对象的科研工作者。
是基因芯片技术的有效补充。
基本流程:通过差减文库构建，文库验证和筛选（逆向斑点杂交），获得阳性克隆，对阳性克隆测序及生物信息分析，可判定差异基因的情况。
另外结合RACE技术可进一步克隆所获得的差异基因的cDNA全长序列，并可用Northern blot 或Real－Time PCR加以验证。
抑制性消减杂交文库技术是一种革命性的差异表达基因筛选技术。
该方法结合了抑制性PCR和消减杂交技术，即御用PCR反应链内退火有限于链间退火的特点和分子杂交二级动力学原理，经过体系不断优化建立起来的快捷、有效的差异基因筛选方法。
与传统的DD—PCR、SAGE及cDNA—RNA等技术相比，具有低丰度mRNA富集效率高、假阳性低、灵敏度高重复性好等特点。
现已广泛应用于动植物发育和分化、疾病易感性差异、抗药性差异和组织（病理和正常样本）差异及微生物基因分型差异的研究。
技术方法成熟有效不需要利用传统的物理方法对单链、双链cDNA进行分离。
只要目的序列存在，就能进行指数扩增，筛选出差异基因片段。
放大稀有转录本本技术在同一操作下完成转录本丰度平衡和差减，在我们的模型实验中，稀有转录本至少被放大了5000倍，也就是说，利用本及时可以极大地增加获得表达差异地稀有转录本地可能性。
仅仅需要500ng的poly A＋RNA与其他的消减杂交方法不同，应用抑制性消减杂交技术只需要0.5－2的poly A+ RNA 即可进行有效实验。
如果您只有极少量（50ng-100ng）的总RNA，我们可以通过poly A＋RNA的高保真线性放大技术来合成足量的cDNA来进行抑制性消减杂交实验。
抑制消减杂交的原理及应用
人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交
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抑制消减杂交的实验过程
1.探针的制备
探针是一段标记核酸序列，可与靶序列 互补形成杂交双链，通过检测杂交链信 号即可对靶序列DNA的存在及其分子大 小加以鉴别.
探针可以是克隆的，也可以是合成的。 用PCR扩增产物可制备探针。也可用提 纯的质粒进行标记制备探针
PCR-TOPO 载体(T载体的一种)
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抑制消减杂交的实验过程
※ TA克隆构建原理：
TA克隆系统由Invitrogen公司发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产 物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一 个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶 作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的 多克隆位点（MCS）中。
大肠杆菌
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抑制消减杂交的实验过程
蓝白斑筛选示意图
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抑制消减杂交的实验过程
分子杂交
定义：确定单链核酸碱基序 列的技术。其基本原理是待 测单链核酸与已知序列的单 链核酸（叫做探针）间通过 碱基配对形成可检出的双螺 旋片段。这种技术可在DNA 与DNA，RNA与RNA，或 DNA与RNA之间进行，形成 DNA-DNA，RNA-RNA或 RNA-DNA等不同类型的杂 交分子。
PCR反应:杂交产物中两端连有不同接头的片段就是所寻找的差异表
达基因。经补平末端后进行巢式PCR扩增以获得所需要的差异表达基 因。
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抑制消减杂交的实验过程消减的克隆:经巢式PCR扩增得到所需要的差异表 达基因后，利用TA克隆法将 差异表达基因转化感受态大 肠杆菌，根据蓝白斑筛选原 理，筛选出转化成功的阳性 菌落。最后根据插入片段的 两端接头引物进行巢式PCR反 应对插入片段进行特异性扩 增。
消减实验步骤
抑制性削减杂交PCR削减杂交是一强有力的使研究人员能够比较两种mRNA群和获得仅在一mRNA群表达而在另一mRNA群没有表达克隆的强有力的技术。
虽然有几种不同的方法，但削减杂交背后的基本理论却非常简单。
首先，两组mRNA均转化为cDNA：我们将含有特异(差异表达的)转录物称为“tester”,对照cDNA称为“driver”。
Tester和Driver cDNA进行杂交，接着去除杂交序列。
结果，保留的未杂交的cDNA就代表了那些仅在tester组表达，而在driver组不表达的mRNA。
虽然传统的减法杂交方法在某些研究中已成功运用，但要求几轮的杂交且也不适合鉴定稀有信息。
CLONTECH PCR-Select™ cDNA削减杂交是唯一克服了传统减法杂交的这些缺点的方法。
图1表示PCR-Select过程的简短回顾。
本方法的几个特点使其具有高效和可重复性。
方法仅要求0.5--2μg polyA+ RNA，花3—4天时间，也不用分离ss和ds分子。
而且，抑制性PCR预防了不需要的扩增而使目标分子得到富集。
图2详细地描述了发生在PCR-Select cDNA消减杂交分子事件。
首先，cDNA从0.5--2μg 的polyA+ RNA合成。
Tester和driver cDNA以RsaⅠ酶切，该酶为一四碱基限制性内切酶，产生平末端。
Tester cDNA接着分成两部分，每一部分连一不同的cDNA adaptor。
Adaptor 的末端无磷酸基团，因此仅有adaptor的一链与cDNA 5’末端相连。
两adaptor具有不同的序列，这样当残留末端被补平后就能够同两个不同的PCR引物退火(Appendix B)。
接着进行两轮杂交。
首先，过量的driver cDNA 加入到每一tester样品，然后热变性和退火，在每一样品产生a、b、c和d分子(图2)。
由于杂交二级动力学的原因，高丰度分子退火快，因此高和低丰度序列在a型分子中的浓度趋于均衡。
消减杂交技术
消减杂交技术通过对《干旱胁迫下黄檗幼苗c DNA消减文库的构建和分析》的试验的介绍，说明消减杂交技术的原理，以及技术流程。
试验摘要以干旱胁迫下的黄檗幼苗cDNA 为tester, 正常生长的黄檗幼苗cDNA为driver, 利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH)构建了干旱胁迫下黄檗幼苗的消减文库并对其进行了EST序列分析。
从消减文库中随机挑取20个阳性克隆, 提取质粒进行酶切和PCR鉴定, 显示文库克隆的重组率大于95%, 插入片段大小大部分集中在300~800bp之间。
随机挑取816个克隆进行测序, 得到265个基因。
将其进行同源性分析, 划分为16类。
获得了热激蛋白70、脱水响应蛋白(RD22)、通用胁迫蛋白、金属硫蛋白(MTII), 晚期胚胎丰富蛋白(LEA14)等44种与干旱胁迫相关的基因,它们涉及了植物的渗透调节、信号传递、转录调控、活性氧清除等方面。
本研究为抗逆基因克隆和系统研究干旱胁迫下黄檗基因的表达奠定了重要的理论基础。
黄檗(黄檗Phellodendron amuranse Rupr.) 又名关黄柏、黄波罗, 为芸香科黄檗属, 是第三纪古热带区系的孑遗植物。
是东北重要的珍贵阔叶树种。
从生活史看, 黄檗经历了从第三纪炎热到寒冷等一系列的气候变迁, 对自然界的非生物胁迫(如高温、干旱、寒冷)有很强的适应力。
材料与方法• 1.1 实验材料•黄檗种子采于牡丹江市, 用70%乙醇对种子表面除菌后, 4℃低温层积2个月, 播种在珍珠岩中, 25~30℃光照培养箱培养。
大约生长60 d左右对黄檗幼苗进行胁迫处理, 减小加水量使其相对水含量达到65%~70%(约6~7d), 未处理的作为对照。
处理后, 取幼苗叶片和茎干置于液氮中速冻, −70℃保存。
1.2实验方法• 1.2.1 总RNA提取和mRNA纯化•以干旱处理的黄檗幼苗为实验组, 未处理的为对照组。
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抑制性消减杂交技术主要包括如下几个基本步骤：
（1）双链cDNA合成与酶切：分别提取待比较的两组细胞mRNA（实验方tester、驱赶方driver），利用随机引物反转录为双链cDNA后，用四碱基识别酶如Rsa I或HindⅢ切割成平均大小为600 bp左右的平端片段；该酶约在44=256 bp处就有一个切点，一分子而来的双链cDNA经该酶酶切后，可产生数个片段，每个片段一般＜600bp，可防止长链cDNA 片段所形成的复杂结构对有效消减杂交的干扰。
（2）两次消减杂交：将tester cDNA分为两组，分别于其5'端上接上两种不同的具有一段反向末端重复序列的寡聚核苷酸、去磷酸化接头（adaptor1, adaptor2），以利于随后的选择性扩增。
接头设计特点：①接头是由一长链（约40余个核苷酸）和一短链（约10余个核苷酸）组成的一端是平端的双链DNA片段，而且双链的5′均无磷酸基团，保证了接头以唯一方向与cDNA片段连接，即接头长链的3′端与cDNA双链5′端连接；②接头长链外侧（约20余个核苷酸）序列与第一次PCR引物序列相同，内侧序列与第二次PCR引物序列相同；
③在接头上含有T7启动子序列，并且含有内切酶识别位点，为以后该片段插入克隆载体提供酶切位点。
两组tester cDNA样品分别与过量的driver cDNA进行第一次杂交，得到a、b、c、d四型分子，使原来丰度不同的单链cDNA得到大量富集，两组产物另加上新变性的drvier cDNA再次杂交，这样就产生了两个5'端有两个不同接头的e型分子，这种e型分子正是tester较driver特异表达cDNA，填平粘性末端。
第一次杂交中，将过量的driver cDNA分别加入两份tester cDNA中，变性后退火杂交。
第一次杂交后有4种产物a、b、c、d：a是单链tester cDNA；b是自身退火的tester cDNA 双链；c是tester和driver的异源双链；d是driver cDNA。
第一次杂交是使tester单链cDNA 均等化，即是原来有丰度差别的单链cDNA的相对含量达到基本一致。
这种均等化的实现是依据杂交的二级动力学原理，丰度高的单链cDNA在退火时产生同源杂交的速度要快于丰度低的单链cDNA。
同时，由于tester cDNA中和driver cDNA序列相似的片段大都和driver形成异源双链分子c，使tester cDNA中的差异表达基因的目标cDNA得到大量富集。
第一次杂交后，合并两份杂交产物，另加上新的变性driver单链，再次杂交退火。
在这
一次杂交中，只有第一次杂交后剩余的经均等化和消减的单链tester cDNA能与driver cDNA一起形成各种双链分子。
这次杂交进一步富集了差异表达基因的cDNA，并产生了一种新的双链分子e，这种分子的两个5′端有两个不同的接头（接头1和接头2），正是由于这两个不同的接头，使其能在以后的PCR中被有效的扩增。
（3）两轮抑制性PCR：两次杂交后，填平粘性末端，利用巢式PCR原理进行扩增，将两个长接头序列设计成内外两对引物，先用外侧那对引物进行PCR反应。
基于PCR抑制效应的存在，只有那些代表了具有差异表达的，且两端同时接有不同接头的双链cDNA片段（e型分子）才能在PCR中得到以指数扩增，而a、d类分子没有引物结合点，b类分子由于两端均为同一接头，在链内极易形成发夹结构，故此3类分子均不能得以扩增，而c类分子一端无接头，只能线性扩增。
这样经过两轮PCR使差异表达的基因片段再次得到富集而构建成由差异cDNA片段构成的消减文库。
换言之，e型分子两端都能和引物配对，扩增效率高，而c型的双链分子只在一端有一个引物配对，扩增效率比e型分子低得多，b型分子由于两端有长序列的反向重复，可互补形成牢固的“锅-柄”二级结构，无法进行有效扩增。
第二轮PCR再用内侧那对引物进行配对，可极大提高扩增的特异性，使在最后的PCR产物中绝大部分是e型分子。
（4）消减文库的扩增与鉴定：将消减文库中的差异表达的cDNA片段以适当方式（T/A 方式或酶切粘性末端互补方式）插入载体，转化细菌，扩增文库后，经x-gal蓝白斑/抗生素初步筛选后，随机挑取白色克隆制备质粒，酶切后分析插入片段。
（5）对克隆出的片段进一步分析鉴定：包括用二次PCR产物制备探针，经点杂交筛选阳性克隆；以插入cDNA片段为探针进行Northern blot鉴定差异表达；cDNA序列测定，序列同源性分析；通过文库筛选或步移技术获取完整的差异表达基因全长。
抑制性消减杂交技术较以往差异基因克隆方法有了重要改进，具有三者无法比拟的优点：（1）高度的特异性，这主要来源于以下三个方面的设计特点：a、使用四碱基识别酶酶切，产生＜600 bp的片段，这样可防止cDNA片段形成复杂结构而影响杂交，同时使同一基因家族来源的片段不易交互杂交，大大提高了片段的代表性，提高了基因克隆的效率，由于使用四碱基内切酶使得基因（组）的复杂程度降低，大大提高了信息量，在一次SSH实
验中可同时分离出上百个差别表达的基因；b、应用两次消减杂交，将tester cDNA片段均与过量driver cDNA片段杂交，使差异表达基因的cDNA得到二次富集；c、充分应用了抑制性PCR和巢式PCR的原理，巧妙设计了两种不同的具有一段反向末端重复序列的寡聚核苷酸接头（adaptor1, adaptor2），这样不但使PCR扩增过程中两端均为同一接头的非特异性分子自我形成发夹结构而被大大抑制，而且在两轮PCR过程中依次分别使用与内外侧序列相吻合的引物，因此特异性地扩增代表差异表达的cDNA片段。
SSH方法通过它的两次特异性杂交和两次PCR特异性扩增使得假阳性率大大降低。
据德国Stein等报道，它的真阳性率高达94%（2）对低分度差异基因克隆的高灵敏性，SSH技术有一个归一化（normalization）过程。
在第一次杂交过程中，由于杂交二级动力学的原因，高丰度的转录物易退火，这样高低丰度序列浓度趋于一致。
实验证明，经过一轮减杂交即可对稀少的片段的几个分子富集达1000-5000倍，这样对低丰度的差异表达基因也能有效地克隆，这也使SSH技术成为大批量克隆新基因的有效方法，这是以往任何差异基因克隆方法远无法达到的。
一般说来，经过SSH，稀有丰度cDNA能富集1000-5000倍，这种富集作用使得低至每细胞一个拷贝的分子也有可能被检出；（3）筛选的简便性：SSH中方法中二次PCR产物可直接进行标记，成为Northern blot, Slot blot, Reverse blot, DNA sequence ，DNA芯片技术，文库筛选等后期实验的优质特异性的探针，大大减少了探针制备、纯化的繁琐过程。
此类探针可与经过反向消减文库（将原tester作driver, 原driver作tester进行消减杂交）而获得的同类探针分别与克隆进行杂交，可迅速鉴定出假阳性克隆；此类探针也可与未消减的cDNA进行杂交，可迅速鉴定出消减后特异性表达的基因。
（4）SSH方法简练、重复性好。
此技术仅需1-2 μg mRNA，而DD方法需20 μg mRNA，消减杂交技术需至少200 μg mRNA；操作熟练者可在7-14日内构建成功消减文库，获得差异表达基因cDNA片段，若使用增强剂如PEG，可进一步缩短实验时间；重复性好，假阳性率很低。
但SSH对起始材料相对要求较多（需数微克），使其不适于来源困难的样品，且若为cDNA SSH，则需来源样品保持新鲜，以防RNA降解造成信息的丢失。
1997年Stein等把SSH和反式Northern相结合，将第二次PCR的产物克隆到载体中，利用colony PCR对其进行第三次扩增，再用反式Northern对扩增产物进行筛选，进一步降低了假阳性和提高了对低丰度mRNA的显示能力，也大大减少了工作量。