(完整word版)目的基因到工程菌的构建
第四章 目的基因的制备、连接、导入与基因文库的构建(ye)
筛选含有目的基因的目的重组子
菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）
鸟枪法操作的改进
使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA
使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。
如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA， 然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高 重组子中目的重组子的出现频率
DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段
混合退火 Klenow酶聚合 T4-DNA连接酶连接
克隆入合适的载体
大片段酶促法：
根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段
混合退火
Klenow酶聚合
T4-DNA连接酶连接
克隆入合适的载体
上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈短，收率就
5’ A 5’ T T7 lacZ MCS ori Apr A 5’ T 5’ PCR扩增产物
T 载体
3 cDNA法
cDNA法克隆目的基因的基本战略 cDNA法分离目的基因的基本程序 cDNA法法克隆目的基因的局限性
cDNA法克隆目的基因的基本战略
cDNA第一链的合成
mDNA
G 5‘ppp’5 G
愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合 成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片 段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95% 则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%
1.1.2 探针等寡聚核苷酸合成
在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸
第四章 隆载体的体外重组 重组载体引入受体细胞 重组子的筛选基因的构建第一节 目的基因的制备
基因工程菌构建的方法和步骤
基因工程菌构建的方法和步骤嗨，大家好！今天咱们要聊聊一个听起来可能有点高深的东西——基因工程菌的构建。
别担心，我会把这事儿说得简单明了，像在跟朋友闲聊一样。
如果你对基因工程一知半解，也不用急着担心，接下来的内容会把这事儿讲得像做菜一样简单易懂。
好了，咱们开始吧！1. 先来个热身：什么是基因工程菌？说白了，基因工程菌就是经过“动刀子”的细菌，咱们给它加了些新“配料”。
这就像是你喜欢的菜里突然多了点特别的调料，让它味道更好或者更特别。
这个“动刀子”其实是指把一些新的基因搞到细菌里去，这些新基因会让细菌做出一些你平时见不到的“特技”，比如说生产某种药物或者是分解污染物。
2. 基因工程菌的构建步骤好啦，进入正题。
咱们要一步步来，首先得搞明白整个过程都包括哪些步骤。
别担心，这个过程并不复杂，主要就是几个大步骤：2.1 设计基因首先，咱们得确定你想要的“特技”是什么。
比如你想让细菌制造某种药物，那么你就需要设计一个含有这个药物生产所需基因的“蓝图”。
这一步就像是做菜之前，你得先想好要做什么菜，准备好食谱。
设计的过程需要用到一些高科技的工具和软件，但大致上就是确定你要的基因序列。
2.2 制备载体有了基因的设计，接下来要做的就是把这些基因装进“载体”里。
载体就像是细菌的“旅行包”，它能帮助基因顺利进入细菌体内。
载体一般是一些小的环状DNA，这些DNA就像是装在“小盒子”里的基因，好比是给细菌送去的“外卖”。
这个载体要跟细菌的细胞膜亲密接触，才能顺利把基因送进去。
2.3 转化细菌接着，就是把装有基因的载体送到细菌里面，这个过程叫做“转化”。
把细菌和载体混在一起，再通过一些方法，比如热激、电击等，帮它们“融合”。
想象一下你在举办一场小派对，细菌就是客人，载体就是派对上的小礼物，我们要确保这两者能“相遇”。
2.4 筛选和验证好了，基因送进去了，接下来就得确认细菌是不是变得“乖乖”的了。
我们要做一些筛选工作，确保细菌里确实有咱们放进去的基因。
基因工程菌构建的方法和步骤
基因工程菌构建的方法和步骤哎呀，这可是个大话题啊！基因工程菌构建的方法和步骤，听起来就让人觉得高深莫测。
不过别担心，我这个话痨会尽量用简单易懂的语言来解释清楚的。
咱们就从头开始吧，一步一步地往前走。
我们得知道什么是基因工程菌。
简单来说，就是把一种生物体的基因提取出来，然后放到另一种生物体里，让它变得更强大、更有用。
这样一来，我们就可以生产出更多的药物、食物和其他有用的东西了。
那么，怎么才能构建出一个好的基因工程菌呢？这可是个技术活儿，需要掌握一些基本的方法和步骤。
咱们先来看看第一步：提取基因。
提取基因可不是一件容易的事情。
我们需要从一种生物体中提取出它的DNA,然后把它转移到另一种生物体里。
这个过程叫做转化。
转化的关键在于找到正确的方法和条件，让DNA能够成功地转移到目标生物体里。
这可是个技术活儿，需要耐心和细心。
好了，现在我们已经成功地把基因提取出来了。
接下来就是第二步：构建基因表达载体。
构建基因表达载体就是为了把基因放到目标生物体里去。
这个过程叫做克隆。
克隆的关键在于找到正确的方法和条件，让基因能够成功地转移到目标生物体里并且正确地表达出来。
这可是个技术活儿，需要耐心和细心。
好了，现在我们已经成功地把基因表达载体构建好了。
接下来就是第三步：转化目标生物体。
转化目标生物体就是为了把基因表达载体放到目标生物体里去。
这个过程叫做转化。
转化的关键在于找到正确的方法和条件，让基因表达载体能够成功地转移到目标生物体里并且正确地表达出来。
这可是个技术活儿，需要耐心和细心。
好了，现在我们已经成功地把基因表达载体转化到目标生物体里去了。
接下来就是第四步：筛选阳性细胞株。
筛选阳性细胞株就是为了选出那些能够成功表达出我们的基因表达载体的细胞株。
这个过程叫做筛选。
筛选的关键在于找到正确的方法和条件，让阳性细胞株能够被成功地筛选出来。
这可是个技术活儿，需要耐心和细心。
好了，现在我们已经成功地选出了阳性细胞株。
接下来就是第五步：扩大培养规模。
菌种构建的过程
菌种构建是一个涉及遗传工程和分子生物学技术的过程，旨在通过直接改变微生物的遗传物质来赋予或增强特定的生物学特性。
这一过程广泛应用于发酵工业、生物制药、环境治理、农业等领域。
以下是菌种构建的一般步骤：1. 目标基因的克隆与合成：- 首先需要确定所需赋予微生物的特性，比如抗性、特定代谢能力等，然后找到或合成相应的基因。
- 可以通过基因克隆技术从基因库中获取，或通过化学合成方法合成目标基因。
2. 基因表达载体的构建：- 将目标基因插入到表达载体中，这个载体通常是一个质粒或人工染色体，它能在宿主细胞中复制和表达目标基因。
- 表达载体设计时需考虑启动子、终止子、调控元件等因素，以确保基因的高效表达。
3. 转化：- 将构建好的表达载体转化到目标微生物中。
转化方法包括钙离子处理、电转化、脂质体介导转化等。
- 转化效率通过蓝白筛选等方法进行初步鉴定。
4. 转化子的筛选与验证：- 通过抗生素抗性或其他选择性标记来筛选成功转化的菌株。
- 通过PCR、DNA测序等分子生物学方法验证目标基因是否成功插入和表达。
5. 遗传稳定性分析：- 评估转化子在宿主细胞中的遗传稳定性，确保基因能够稳定传递给后代。
6. 生物特性评估：- 通过发酵试验、生物活性测试等方法，评估转化子是否获得了预期的生物学特性。
7. 优化与改良：- 根据评估结果对菌种进行进一步的优化和改良，可能涉及菌株的生理、代谢和生长条件的调整。
8. 大规模培养与应用：- 最终确定后，将菌种用于大规模生产或应用。
在整个菌种构建过程中，需要遵守相关的生物安全法规和指导原则，确保操作的安全性和环境的可持续性。
同时，科研人员和工程师还需要不断学习最新的科研进展和技术创新，以提高菌种构建的效率和成功率。
基因工程菌的构建
转化子DNA的快速鉴定
（一）制备0.8%琼脂糖凝胶 （二）取Eppendorf管，每管加50微升Cracking gel缓冲液 （三）用扁头牙签，将菌落刮到Eppendorf管中 （四）在37℃水浴中保温15分钟 （五）取出各管，4℃，1,500r/min，离心15分钟 （六）立即吸出各管上清液25-30微升，进行点样电泳 （七）当溴酚兰迁移到凝胶板的2/3处时，停止电泳 （八）将电泳凝胶染色30分钟 （九）观察质粒的迁移距离，并拍照供进一步分析
分子生物学实验
• 一、实验设计 • 二、实验操作
• 指导教师：林 凤
实验设计
• •
基因工程菌的构建
•
载体
酶切
目的基因
PCR扩增，酶切
载体片段 +目的基因片段
连接
重组质粒
转化
重组子阳性鉴定
酶切位点设计
• 1、载体多克隆位点 • 2、缓冲溶液 • 3、温度 • 4、末端的性质
载体与目的基因的连接
弃500 µ l 上清, 连接产物取100 µ l , 10 µ l各涂一平板, 空白，阳性对照和阴性对照200 µ l各涂一平板 37 ℃，12-16 h 观察转化子的出现
（三）倒皿铺平板 1. 按照各组转化反应的混合物，控制不同的选择性培养基 LB固体培养基+Ap（100ug/ml）+Tet（40ug/ml） 供连接混合物转化，pUC 18转化用 LB固体+Ap（100ug/ml）+X-gal（100ug/ml）+IPTG（119ug/ml） 供连接混合物转化，pUC 18转化用 共10皿 2. 转化反应前一天，先倒皿铺好平板 3. 取以上各组反应物在平板上涂布 4.培养皿置于37℃培养箱中过夜 5. 观察转化子出现的情况
工程菌构建的基本过程
工程菌构建的基本过程工程菌构建是一种利用基因工程技术将微生物菌株改造成具有特定功能的生物工厂的过程。
该过程包括以下几个基本步骤：菌株选择、基因克隆、基因编辑和菌株表达。
在工程菌构建的过程中，菌株选择是非常重要的一步。
科学家们需要根据所需产物的特性和生产环境的要求，选择合适的菌株作为基础。
常用的菌株包括大肠杆菌、酵母菌等，它们具有较高的生长速度和较好的基因操作性能。
接下来，基因克隆是工程菌构建的关键步骤之一。
科学家们需要将目标基因从原有的生物体中剪切下来，然后通过PCR等方法扩增得到大量的目标基因。
接着，将目标基因与载体DNA连接，形成重组DNA。
通过转化或转染等方法将重组DNA导入到宿主菌中，使宿主菌获得目标基因。
基因编辑是工程菌构建的另一个重要步骤。
在完成基因克隆后，科学家们需要对目标基因进行编辑，以实现所需的功能。
常用的编辑方法包括基因敲除、基因插入、基因点突变等。
通过这些方法，科学家们可以改变菌株的代谢途径、增强菌株的生物合成能力，从而实现产物的高效生产。
菌株表达是工程菌构建的最后一步。
在编辑完成后，科学家们需要将菌株培养在适当的培养基中，提供所需的营养物质和培养条件，促进目标基因的表达和产物的积累。
同时，科学家们也需要对菌株进行监测和调控，确保产物的质量和产量达到预期的要求。
总结起来，工程菌构建的基本过程包括菌株选择、基因克隆、基因编辑和菌株表达。
通过这一过程，科学家们可以构建具有特定功能的工程菌，并利用其高效地生产各种有用的产物。
这一技术在医药、能源、环境保护等领域具有广阔的应用前景，为人类社会的可持续发展提供了新的思路和方法。
基因工程菌的构建过程
基因工程菌的构建过程
一、基因工程菌的构建过程
1.克隆
克隆技术是将目标基因从一种物种转移到另一种物种中的过程。
它由两个步骤组成：（1）将目标基因扩增到一种可以被容易地检测和分离的质粒中；（2）将扩增的基因质粒尽可能多地植入宿主细胞中，使宿主细胞拥有一个新的基因，为后续基因工程提供条件。
2.启动子定向突变
基因工程菌的定向突变是指在基因的启动子序列中引入突变，以改变其对基因表达的影响。
典型的定向突变包括插入、缺失或点突变，等等。
这些突变可以增强基因的表达，也可以减弱基因的表达，从而改变它的生物功能。
3.基因敲除
基因敲除技术是一种遗传改造技术，它是指将一个或多个基因从宿主的基因组中消除，以减少或完全抑制受体基因的表达。
基因敲除技术与基因表达调控技术一起衍生出了各种类型的基因工程菌，为基因研究提供了新的思路。
4.基因重组
基因重组技术是指在宿主细胞中重新连接两个不同的基因，以产生拥有新的功能的基因组。
通过基因重组，可以将一个基因的多个功能分解成多个更小的基因，从而丰富和改变生物的功能。
5.基因融合
基因融合技术是一种合成生物技术，它是把两个以上的基因连接在一起，形成一个新的基因，以改变基因组或改变其表达特征。
基因融合技术是基因工程的重要技术，能够改变宿主的生物功能，改变这种宿主的表达特征。
大肠杆菌基因工程菌的构建流程
大肠杆菌基因工程菌的构建流程大肠杆菌基因工程菌的构建可有趣啦，就像搭积木一样，不过是微观世界里超级复杂又超级酷的积木哦。
一、目的基因的获取。
咱得先有个目标呀，就是那个要改造大肠杆菌的基因。
这基因从哪来呢？可以从其他生物的基因组里找哦。
比如说，要是想让大肠杆菌能产生某种特殊的蛋白质，就去找有这个蛋白质合成信息的基因。
这就像是在一个超级大的基因宝藏库里寻宝。
有时候呢，这个宝藏可能在一些很奇特的生物里，科学家们就得各种探索，像探索神秘岛屿一样。
这一步可不容易呢，得用好多高科技手段，像PCR技术（聚合酶链式反应），这个技术就像是基因的复印机，可以把我们想要的基因片段大量复制出来，这样才有足够的材料来进行后面的操作。
二、载体的选择。
有了基因还不行，得给这个基因找个“小推车”，这个“小推车”就是载体啦。
常见的载体有质粒哦。
质粒就像是一个小小的基因快递员，它能带着我们的目的基因进入大肠杆菌的细胞里。
选择质粒的时候可讲究啦，要考虑好多因素呢。
比如说这个质粒得能在大肠杆菌里稳定存在，不能进去就被大肠杆菌的防御系统给消灭了。
而且这个质粒最好有一些特殊的标记，就像给快递员戴个特别的帽子，这样我们就能很容易地知道哪些大肠杆菌是成功接收了带有目的基因的质粒的。
就像在一群小蚂蚁里找那几只带着特殊任务的蚂蚁一样。
三、基因和载体的连接。
找到基因和载体之后，就要把它们连接起来啦。
这就像是把小零件组装在一起。
有一种酶叫DNA连接酶，它就像是个超级小工匠，可以把基因和载体的末端连接起来。
这个过程就像是把两个小链子的环扣在一起，要非常精准才行呢。
如果连接得不好，那整个构建工程可能就会出问题。
这一步有点像给基因和载体牵红线，要让它们完美结合，才能走向幸福的大肠杆菌细胞生活呀。
四、大肠杆菌的转化。
连接好的基因和载体组合，就要进入大肠杆菌啦。
这个过程叫做转化。
想象一下，大肠杆菌的细胞就像一个小小的城堡，我们要想办法把这个带着新基因的质粒送进去。
基因工程基本操作的四个步骤
利用PCR技术扩增
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端 互补的寡核苷酸引物。
在PCR反应中，模板DNA、引物、四种脱氧核糖核苷酸、DNA聚合酶以及适宜 的缓冲液系统被置于“热循环”的反应环境中，通过精确控制温度，在DNA聚合 酶作用下高特异性、高灵敏度地扩增目的基因。
受体细胞的选择
01
02
03
原核细胞
适用于细菌等原核生物作 为受体细胞，如大肠杆菌。
真核细胞
适用于动物和植物细胞作 为受体细胞，如CHO细胞、 动物胚胎细胞、植物愈伤 组织等。
受精卵
适用于动物基因工程，直 接将目的基因导入受精卵， 实现基因的长期稳定表达。
转化或转染方法
01
02
03
04
化学转化法
利用CaCl2、MgCl2等化 学试剂诱导细菌感受态 细胞的产生，吸收外源 DNA。
载体的构建过程
目的基因的获取和修饰
从供体细胞中获取目的基因，并进行 必要的修饰，如限制性酶切、连接等。
载体的获取和修饰
从宿主细胞中获取载体，并进行必要 的修饰，如限制性酶切、连接等。
目的基因与载体的连接
将目的基因与载体进行连接，形成重 组DNA分子。
重组DNA分子的转化
将重组DNA分子导入到宿主细胞中， 并使其在宿主细胞中复制和表达。
03 目的基因与载体的连接
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶是一类能识别并附着特定的核苷酸 序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸
之间的磷酸二酯键进行切割的酶。
限制性核酸内切酶的识别位点通常是DNA双链上的特 异序列，这种序列通常由4-6个核苷酸组成。
基因工程工程菌构建
实例二：某工程菌的应用效果
应用领域
01
用于生产某种药物或工业酶。
应用效果
02
通过工程菌的构建和优化，实现了目标产物的高效表达和纯化
，降低了生产成本，提高了产品质量和产量。
经济效益
03
工程菌的应用为企业带来了显著的经济效益，推动了相关产业
的发展。
实例三：某工程菌的改进与优化
改进目标
提高工程菌的生长速度、产物表达量或产物纯度等。
基因工程工程菌构建
汇报人：XX
目 录
• 引言 • 基因工程原理与技术 • 工程菌构建流程 • 工程菌构建实例分析 • 工程菌构建的挑战与解决方案 • 工程菌在生物医药领域的应用前景
01
引言
基因工程概述
基因工程定义
基因工程是通过对生物体基因进行改造和重组， 以实现特定目标的方法和技术。
常用技术
包括基因克隆、基因编辑、基因转移等。
抗体药物研发
通过基因工程技术改造工程菌，实现抗体药物的高效表达和纯化。
疫苗研发与生产
利用工程菌生产疫苗，如基因工程疫苗、重组亚单位疫苗等，提高 疫苗的安全性和有效性。
基因治疗与细胞治疗
基因治疗载体
工程菌可作为基因治疗的载体，将治疗基因导入患者体内 ，修复或替换缺陷基因。
细胞治疗辅助工具
利用工程菌生产细胞治疗所需的生长因子、细胞因子等， 促进细胞生长和分化。
通过代谢工程手段，改造工程菌的代 谢途径，提高其对底物的利用效率和 产物合成能力。
提高遗传稳定性
采用合适的基因整合方法，确保外源 基因在工程菌中的稳定遗传和表达。
03
工程菌构建流程
目标基因的选择与获取
选择目标基因
基因工程精选全文完整版
– 可直接表达不含任何原核序列的外源 蛋白（原核表达载体）
– 以融合蛋白的形式进行表达（原核基 因融合表达载体）
表达载体
真核表达载体含有：
– 原核基因序列 – 真核转录单位
真核表达载体：有两类
– 不带病毒复制子 – 带病毒复制子
质粒（plasmid）
存在于细菌等细胞质中 双链环状DNA分子 大约 1-200 Kb 具有自主复制和转录能力 不能独立存活 在子细胞中保持恒定的拷贝数 并表达其遗传信息
质粒（plasmid）
在细胞内的复制分两种类型
严密控制型
松弛控制型
(stringent control) (relaxed control)
基因工程操作流程
基因重组示意图
基因工程上游技术基本过程
选择载体 获得目的基因 目的基因与载体的重组 重组载体的转化 重组子的筛选与鉴定
载体（vector）
质粒（plasmid） 噬菌体（phage） 病毒（virus）
载体的条件
分子小（ 10 Kb） 有限制酶酶切位点 可自主复制 有足够的copy数 带筛选的标志
法将允许克隆人体器官
法国总理若斯潘（2000年9月28日） 表示：
– 法国政府将允许对人体器官克隆技术 进行用于医疗目的的研究
基因工程技术
上游技术（upstream）
– 重组子的构建 – 工程菌的构建及高效表达
下游技术（downstream）
– 工程菌大规模发酵最佳参数的确定 – 新型生物反应器的研制 – 高效分离介质及装置的开发 – 分离纯化的优化控制 – 生物反应器等一系列仪器、仪表的设计制造 – 超滤、反渗透技术的应用
利用重组酵母菌生产人胰岛素
利用重组酵母菌生产人胰岛素摘要：利用重组酵母菌生成人胰岛素为以下流程：获得目的基因→构建重组质粒→构建基因工程菌→工程菌发酵→产物分离纯化→产品检验。
其中前三个流程为产人胰岛素酵母工程菌的构建，根据人胰岛素的氨基酸序列和酵母偏爱的密码子，采用基因半合成技术合成人胰岛素基因。
将合成的胰岛素基因克隆到pPIC9质粒，构建了毕赤(Pichia)酵母重组表达载体pPINS319，用BglII线性化后用电转化法导入毕赤酵母GSll5菌株，经过营养筛选和PCR 复筛，得到含人胰岛素基因的毕赤酵母工程菌株。
后三个流程为胰岛素的大规模发酵生产，通过补料-分批发酵获得发酵液，分离纯化后获得人胰岛素。
纯化后的重组人胰岛素产品经SDS-PAGE检测，氨基酸组成分析及小鼠惊厥实验证明制得产品为有生物活性的人胰岛素。
关键词：重组酵母；人胰岛素；发酵；纯化；鉴定Using recombinant yeast to produce human insulinHuSheng 1142043040Abstract：The proceedings of produce human insulin by recombinant yeast show as follow:get purpose gene→c onstruct the recombinant plasmid→construct the genetic engineering bacteria→fermentation of e ngineering bacterium→separation and purification of the product→identification of the product. The front three processes is building engineering bacteria of human insulin yeasts . Insulin gene was synthesized according to the amino acid sequence of human insulin and yeast preferential codons. The insulin gene was cloned in to pPIC9 vector and expression vector pPINS319 was constructed. The expression vector was digested with BgllI and then used to transform Pichia Pastoris GSll5 by electroporation. The expression analysis showed that the insulin gene w s able to expressed efficiently in Pichia Pastoris. The posterior three processes is large-scale production by fermentation.Through fed - batch fermentation getting fermentation liquor, separation and purification the fermentation liquor getting human insulin.The final products purified by supedrex 75showed one band by SDS-PAGE analysis and were identical with the native human insulin by all critetia employed.(SDS-PAGE analysis,amin acid composition analysis and bioidentity assay) Keywords：recombinant yeast;human insulin; fermentation;purification;identification 胰岛素是FDA批准的第一个用于人类的基因重组药物。
原创12：1.2 基因工程的基本操作程序
目的基因的mRNA
反转录
单链DNA(cDNA)
合成
双链DNA (即目的基因)
（2）化学合成法：根据已知的氨基酸序列合成DNA
根据已知蛋白质的氨 基酸序列，推测出相应的 信使RNA序列，然后按照碱 基互补配对原则，推测出 它的结构基因的核苷酸序 列，再通过化学方法，以 单核苷酸为原料合成目的 基因。
练习
1）以下说法正确的是
（C）
A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列
B、质粒是基因工程中唯一的运载体
C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制 酶切点，以便与外源基因连接
D、基因控制的性状都能在后代表现出来
2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是
A、能复制
（D）
B、有多个限制酶切点
C、具有标记基因
• 将目的基因导入受体细胞的原理
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳 定和表达的过程，称为转化。
（1）导入植物细胞 农杆菌转化法
农杆菌：感染双子叶植物和裸子植物
此外，还有基因枪法、花粉管通道法。
（2）导入动物细胞 显微注射法
（3）将目的基因导入微生物细胞
• 目的基因的提取方法从基因中获取目的基因人工合成目的基因
反转录法 化学合成法
利用聚合酶链式反应（PCR） 特异性地扩将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌 的群体中储存,各个受体菌分别含:
5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。
在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的
步骤是
基因工程菌株的构建方法 同源重组法
基因工程菌株的构建方法同源重组法一、同源重组法概述同源重组法是一种基于DNA同源序列的精确重组技术，常用于基因工程和分子生物学研究中。
通过同源重组，可以将外源DNA片段准确地插入到目标基因组位点，实现基因的敲除、敲入、点突变等操作。
同源重组法在基因治疗、基因组编辑、代谢工程等领域具有广泛的应用价值。
二、同源重组法的原理同源重组法的原理基于DNA的同源序列，通过DNA的碱基配对实现精确的基因重组。
在同源重组过程中，首先需要构建一个同源臂（通常是几百bp至几千bp的DNA片段），一端与外源DNA片段相连，另一端与目标基因组位点配对。
当同源臂与目标基因组位点配对时，DNA聚合酶可以延伸同源臂，并引导外源DNA片段插入到正确的位置。
由于同源序列的高度特异性，同源重组具有很高的精确度，减少了随机整合的风险。
三、同源重组的过程同源重组的过程通常包括以下步骤：1.构建同源臂：根据目标基因组位点的序列信息，设计并合成一对同源臂，一端与外源DNA片段相连，另一端用于与目标基因组位点配对。
2.基因组靶点定位：将含有同源臂的外源DNA片段导入细胞或生物体中，并定位到目标基因组位点。
3.同源臂与目标基因组位点配对：同源臂与目标基因组位点上的同源序列通过碱基配对结合。
4.DNA延伸和重组：DNA聚合酶在同源臂的引导下，延伸同源序列并实现外源DNA片段的精确插入。
5.筛选和鉴定：通过特定的筛选和鉴定方法，如PCR、测序等，对经过同源重组的基因工程菌株进行鉴定和筛选。
四、同源重组法的应用同源重组法在基因工程和分子生物学领域有广泛的应用价值，包括以下几个方面：1.基因敲除：通过构建含有同源臂的敲除载体，将敲除载体导入细胞或生物体中，实现特定基因的敲除。
2.基因敲入：将外源基因通过同源重组法精确地插入到目标基因组位点，实现外源基因的稳定表达。
3.点突变：通过同源重组法实现基因组中特定位点的突变，用于研究突变对蛋白质功能的影响。
4.基因治疗：利用同源重组法将正常的基因精确地插入到病变细胞中，以补偿缺陷基因的功能，实现基因治疗的目的。
基因工程菌构建的方法和步骤
基因工程菌构建的方法和步骤1. 了解基因工程菌嘿，伙计们，今天我们要聊聊“基因工程菌”这个话题，别担心，我不会用什么高深的术语把你绕晕。
我们先来把概念捋一捋。
基因工程菌，简单来说，就是把外来的基因“送”进某种细菌的体内，让这些细菌变成小小的生物工厂，生产我们需要的物质。
就像你在厨房里加点调料，能把菜肴的味道改变一样。
基因工程菌的目的是通过这种“改造”，让细菌能够合成有用的蛋白质、酶或者其他的化学物质。
这样一来，它们就能帮助我们解决各种问题，比如生产药物、清理污染或者改良作物。
2. 构建基因工程菌的步骤要构建基因工程菌，我们得经过几个步骤，哎呀，这可不简单，但也不至于让人望而却步。
接下来，我就给你细细道来，千万别走神哦！2.1 选择目标基因首先，我们得决定要插入哪个基因。
这个基因可以来自其他生物，比如植物、动物，甚至是其他细菌。
想象一下，你要给你的微型生物工厂添加一项新技能，就像给它升级一个新功能。
这一步就像是挑选你最喜欢的配料，关键在于找出最适合你需求的那个基因。
2.2 构建载体接下来，我们要搞个“载体”，也就是用来运输目标基因的工具。
可以把它想象成快递公司，我们的目标基因就像包裹，载体就是快递员。
常见的载体有质粒（就是一种小小的DNA环）或病毒载体。
载体的选择，基本上是看你的目标基因是小巧玲珑还是“大块头”，当然也要看它的安全性和有效性。
2.3 转化细菌现在，咱们得把装载着目标基因的载体“送”进细菌里。
这一步就像把新员工介绍给公司的老员工，确保他们能顺利融入团队。
我们用的技术有几种，比如化学转化、热激转化和电转化。
每种方法都有自己的“拿手绝活”，这时就得看情况选择最合适的了。
2.4 筛选和鉴定好了，目标基因成功送到细菌体内后，我们得确认它是否真的“安家”了。
这个步骤就像是检查你的新配方在实际操作中是否真的有效。
我们会用一些方法来筛选出那些成功转化的细菌，比如抗生素筛选、荧光标记等。
搞定这些之后，我们还需要用一些高大上的技术，如PCR、测序，来确认基因的确切位置和表达情况。
目的基因到工程菌的构建
目的基因到工程菌的构建1基因工程的诞生1972年,美国斯坦福大学的学者首先在体外进行了DNA改造的研究,他们把SV40〔一种猴病毒〕的DNA分别切割,又将两者连接在一起,成功构建了第一个体外重组的人工DNA分子。
1973年,Cohen等人首次在体外将重组的DNA分子导入大肠杆菌中,成功地进行了无性繁殖,从而完成了DNA体外重组和扩增的全过程。
在这个的基础上,基因工程诞生了。
SV40病毒第一个重组体的构建1.1基因工程技术的三XX论基础一是20世纪40年代Avery等人通过肺炎球菌的转化实验证明了生物的遗传物质是DNA,而且证明了通过DNA可以把一个细菌的性状转移给另一个细菌。
二是20世纪50年代Watson和Crick发现了DNA分子的双螺旋结构与DNA的半保留复制机理。
三是20世纪60年代关于遗传信息中心法则的确立,即生物体中遗传信息是按DNA→RNA→蛋白质的方向进行传递的。
1.2基因工程技术的三大技术基础三大基本技术问题：一是如何从生物体庞大的双链DNA分子中将所需的基因片段切割下来；二是如何将切割下来的DNA片段进行繁殖扩增；三是如何将所获得的基因片段重新连接。
20世纪70年代,由Smith 等人发现的核酸限制性内切酶、DNA连接酶和可以作为基因工程载体的细菌质粒的发现,解决了上述三大问题。
1.2.1 限制性核酸内切酶限制性内切酶不切割自身DNA是因为原核生物中不存在酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
1.2.2 DNA连接酶作用实质：将具有末端碱基互补的2个DNA片段连接在一起,形成重组DNA分子,其起作用时不需要模板。
1.2.3 基因工程的载体-质粒基因载体的作用是运载目的基因进入宿主细胞,使之能得到复制和进行表达。
也就是说,离开染色体的外源DNA不能复制,而而插入复制子DNA的外源DNA可作为复制子的一部分在受体菌中进行复制,这种复制子是外源基因的载体。
此外,为满足其使命,还必须具备如下一些特性：①能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制,在其DNA插入外源基因后,仍然保持稳定的复制状态和遗传特性。
工程菌构建的基本过程
工程菌构建的基本过程工程菌构建是一种利用合成生物学和基因工程技术来构建功能菌的方法。
它可以通过改造细菌的基因组，使其具有特定的生物合成能力或功能表达。
工程菌构建的基本过程包括选取目标菌种、设计基因组改造方案、合成和克隆目标基因、转化目标菌株、筛选和鉴定工程菌。
在工程菌构建的过程中，选取合适的目标菌种是十分重要的。
目标菌种应具备较高的遗传可操作性和生物合成能力，并且在工业应用中有一定的潜力。
常用的目标菌种包括大肠杆菌、酵母菌等。
接下来，设计基因组改造方案是工程菌构建的关键步骤之一。
通过对目标菌种的基因组进行分析和比较，找到关键基因或途径，确定基因组改造的目标。
根据目标基因的功能和调控机制，设计合适的基因组改造策略，如基因敲除、基因改写、基因插入等。
然后，合成和克隆目标基因是实现基因组改造的基础。
根据设计的基因序列，利用化学合成或PCR扩增等技术，合成目标基因的DNA序列。
然后，将合成的基因克隆到合适的载体中，如质粒、噬菌体等。
转化目标菌株是将工程基因导入到目标菌种中的关键步骤。
常用的转化方法包括化学法、电转化法、激光法、基因枪法等。
根据目标菌株的特点和实验要求，选择适合的转化方法。
将克隆的基因载体导入到目标菌株中后，经过一定的培养和筛选，得到转化后的目标菌株。
筛选和鉴定工程菌是工程菌构建的最终目标。
通过对转化后的目标菌株进行鉴定和筛选，确定哪些菌株成功地获得了目标基因的表达或生物合成功能。
常用的筛选方法包括基因检测、代谢产物分析、酶活性测定等。
通过对工程菌的筛选和鉴定，可以进一步优化和改良工程菌的性能。
工程菌构建的基本过程包括选取目标菌种、设计基因组改造方案、合成和克隆目标基因、转化目标菌株、筛选和鉴定工程菌。
这一过程需要综合运用合成生物学、基因工程和微生物学等多学科的知识和技术。
工程菌构建的成功将为生物制药、生物能源和环境修复等领域提供强有力的支持，具有广阔的应用前景。
工程菌构建的基本过程
工程菌构建的基本过程
工程菌构建的基本过程一般包括以下几个步骤：
1. 目标设定：明确所需的功能、性能和应用场景，确定要构建的工程菌的基本特征。
2. 菌种选择：根据目标设定，选取适合的菌种，可以是天然存在的菌种，也可以是经过改良的菌株。
3. 基因工程设计：设计合成或改造所需的基因表达元件，包括启动子、转录因子等，并确定优化目标基因的序列。
4. 基因组插入：将经过设计的基因导入到菌株的基因组中，使其能够表达目标基因并产生所需的产物。
5. 发酵条件优化：根据目标产物的需求，进行发酵条件的优化，包括培养基组成、温度、pH值等，以最大化目标产物的产量
和纯度。
6. 检测与分离：使用适当的分析方法对发酵产物进行检测和分离，以确定产物的纯度和活性。
7. 产物应用：将获得的工程菌应用于实际生产中，例如工业生产、医药制剂等。
8. 监测与改进：对工程菌的性能和产物质量进行监测和评估，根据需求进行改进和优化。
整个过程需要进行严格的实验设计和控制，确保工程菌的构建和应用的稳定性和可靠性。
同时，还需要合理的安全措施，以保证工程菌的安全性和环境友好性。
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目的基因到工程菌的构建1基因工程的诞生1972年，美国斯坦福大学的学者首先在体外进行了DNA改造的研究，他们把SV40（一种猴病毒）的DNA分别切割，又将两者连接在一起，成功构建了第一个体外重组的人工DNA分子。
1973年，Cohen等人首次在体外将重组的DNA分子导入大肠杆菌中，成功地进行了无性繁殖，从而完成了DNA体外重组和扩增的全过程。
在这个的基础上，基因工程诞生了。
SV40病毒第一个重组体的构建1.1基因工程技术的三大理论基础一是20世纪40年代Avery等人通过肺炎球菌的转化实验证明了生物的遗传物质是DNA，而且证明了通过DNA可以把一个细菌的性状转移给另一个细菌。
二是20世纪50年代Watson和Crick发现了DNA分子的双螺旋结构及DNA的半保留复制机理。
三是20世纪60年代关于遗传信息中心法则的确立，即生物体中遗传信息是按DN A→RNA→蛋白质的方向进行传递的。
1.2基因工程技术的三大技术基础三大基本技术问题：一是如何从生物体庞大的双链DNA分子中将所需的基因片段切割下来；二是如何将切割下来的DNA片段进行繁殖扩增；三是如何将所获得的基因片段重新连接。
20世纪70年代，由Smith等人发现的核酸限制性内切酶、DNA连接酶和可以作为基因工程载体的细菌质粒的发现，解决了上述三大问题。
1.2.1 限制性核酸内切酶限制性内切酶不切割自身DNA是因为原核生物中不存在酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
1.2.2 DNA连接酶作用实质：将具有末端碱基互补的2个DNA片段连接在一起，形成重组DNA分子，其起作用时不需要模板。
1.2.3 基因工程的载体-质粒基因载体的作用是运载目的基因进入宿主细胞，使之能得到复制和进行表达。
也就是说，离开染色体的外源DNA不能复制，而而插入复制子DNA的外源DNA可作为复制子的一部分在受体菌中进行复制，这种复制子是外源基因的载体。
此外，为满足其使命，还必须具备如下一些特性：①能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制，在其DNA插入外源基因后，仍然保持稳定的复制状态和遗传特性。
②易于从宿主细胞中分离，并进行纯化。
③载体DNA序列中有适当的限制性内切酶位点，并位于DNA复制的非必需区内，可以在这些位点上插入外源DNA，但不影响载体自身DNA的复制。
某些病毒载体在外源DNA插入后变成缺损性病毒株，只能在有辅助存在时才能进行正常增殖。
④具有能够观察的表型特征（有报告基因），在插入外源DNA后，这些特征可以作为重组DNA选择标志。
1.3基因工程的基本过程1.4基因工程的应用2目的基因的获取基因工程订是通过人工方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而深入开展核酸遗传研究或者获取有价值的基因产物。
通常我们把插入到载体内那个特定的片段基因称为“外源基因”，而将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段称为“目的基因”。
来源于真核细胞的产生基因工程药物的基因是不能直接进行分离的。
真核细胞中单拷贝基因只是染色体DNA中很小的一部分，为其10-5 -10-7 ，即使多拷贝基因也只有其10-5，因此从染色体中直接分离纯化目的基因极为困难。
另外，真核基因内一般都有内含子，如果以原核细胞作为表达系统，即便分离出真核基因，由于原核细胞缺乏mRNA的转录后加工系统，真核基因转录的mRNA也不能加工、拼接成为成熟的mRNA，因此不能直接克隆真核基因，必须采用特殊方法分离目的基因。
目的基因的获取大致可以分为三类：一是利用PCR技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆、表达；二是构建感兴趣的生物个体的基因组文库或者cDNA文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从文库中挑出含有目的基因的重组克隆；三是近年来发展的利用基因差异表达获取目的基因的技术。
2.1 直接分离法（鸟枪法）直接从生物细胞基因组中获取目的基因最常用的方法是“鸟枪法”，又称“散弹枪法”。
其是将供体生物的DNA用限制酶切割为许多片段，再用运载体将这些片段都运载到受体生物的不同细胞中去。
只要有一个细胞获得了需要的目的基因并得以表达，基因工程就算成功了。
该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。
且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去。
优点是速度快，简单易行，成本较低，并能获得与天然基因组DNA一样的有内含子的真核基因DNA片段。
2.2 逆转录法（cDNA法）逆转录法合成DNA是人工模拟自然界某些生物的反转录过程。
主要用于分子量较大而又不知道其序列的基因，它以目的基因的mRNA为模板，以dNTP为底物，酶催化按5ˊ→3ˊ方向合成一条与RNA模板互补的DNA单链（cDNA），它与RNA模板形成RNA与DNA的杂交体。
随后又在反转录酶的作用下水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。
至此，由RNA指导的DNA合成过程完成。
2.3 反转录-聚合酶链式反应法（PCR法）该法是将mRNA经反转录全成cDNA 的第一链，不需再合成cDNA第二链，而是在特异引物的协助下，用PCR法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组、克隆。
常用于含其极微量mRNA的细胞。
2.3.1 cDNA文库cDNA文库是将生物特定的组织器官或特定发育时期的全部mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了其全部表达基因的转录本。
原理是将带poly（A）的mRNA经酶促反应转变为双链DNA，再与原核载体连接。
cDNA文库的构建：2.3.1.1 cDNA第一链的合成利用反转录酶合成cDNA第一链2.3.1.2cDNA第二链的合成①自身引导合成法：单链cDNA的3’端能够形成发夹状的结构作为引物，在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下，合成cDNA的第二链.此法存在的缺点是在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时，会导致对应于mRNA 5’端的地方的序列出现缺失和重排.②置换合成法：以第一链合成产物cDNA：mRNA杂交体作为切口平移的模板，RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口,产生一系列RNA引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I 的作用下合成cDNA的第二链.此法的优点是：合成cDNA的效率高；直接利用第一链的反应产物，不需纯化；避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA。
③引物-衔接头法④Okayama-Berg法合成并克隆双链cDNA2.3.1.3双链cDNA分子的克隆①同聚物加尾法:利用小牛胸腺末端转移酶在双链cDNA和质粒载体的3’端都加上一个互补的同聚片段，通过退火使两个片段连接成重组质粒，再将重组质粒转化受体细胞.②接头-衔接头法③mRNA-cDNA克隆法方法：在mRNA反转录合成cDNA第一链后，将dA残基加到mRNA：cDNA杂交体上，然后与带dT尾的克隆载体连接，转化受体细胞，在宿主细胞内，mRNA被降解并代之以DNA.缺点：克隆的效率低（为双链cDNA克隆的1/10）2.3.1.4 cDNA文库的筛选和鉴定①核酸杂交1）同源探针；至少含有所需cDNA克隆的一部分确切序列.常用于以一个部分克隆分离cDNA文库中的全长克隆.2）部分同源探针：探针的序列与所要筛选的cDNA克隆的序列相关但不相同.常用于克隆家族基因.3）总cDNA探针：通过反转录酶均匀掺入放射性核苷酸或通过总的或分级分离得到的poly(A)+ mRNA进行末端标记而获得cDNA探针.4) cDNA扣除探针: 从第一种mRNA制备cDNA探针, 连续多次与20倍过量的第二种mRNA杂交; 回收未杂交的cDNA探针, 再与100倍过量的第一种mRNA杂交, 使得原mRNA中的一些特异序列得到高度富集.②特异性免疫学检测:在cDNA表达文库中，目的基因的表达产物能与特异性抗体发生免疫学反应，通过酶学的方法加以检测.③cDNA克隆的同胞检测:将cDNA文库分成若干组含有10-100个克隆子的易于处理的cDNA文库，对每组cDNA文库进行检测，当鉴定出阳性库后再不断将其分成更细的库进行检测，直到获得阳性单克隆.④cDNA克隆的确证:cDNA克隆含有编码某一特定蛋白质的完整氨基酸序列的开放读框.2.3.2 基因组文库基因组文库或简称基因文库，其是将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。
通过构建基因文库可以贮存和扩增特定生物基因工程组的全部或部分片段，同时又能够在需要时从基因文库中调出其中的任何DNA片段或目的基因。
理想的基因组文库应具备下列条件：①重组克隆的总数不宜过大，以减轻从文库中筛选目标克隆的工作量。
②克隆片段大于研究基因的平均片段，以便于从同一克隆中获得完全的单一基因。
③含有相邻DNA片段的独立克隆间，部分序列重叠的大小合理，一方面利于基因文库各克隆建立叠连群，进行染色体步查；另一方面，又不重叠过多，使步查效率低下。
④克隆片段易于从载体分子上完整卸下且最好不带有任何载体序列。
⑤重组克隆应能稳定保存、扩增及筛选。
基因组文库的构建：①细胞染色体大分子DNA 的提取和大片段的制备；②载体DNA 的制备；③载体与外源大片段连接；④体外包装及基因组DNA 文库的扩增；⑤重组DNA 的筛选和鉴定。
•表型筛选法：表达性状易于鉴别，如互补筛选•抗性筛选法：如二氢叶酸还原酶可以使三甲苄二氨嘧啶降解，而该化学物可抑制大肠杆菌生长•分子杂交法：利用分子探针对文库进行筛选•免疫筛选法：利用多肽等作为抗原进行原位杂交筛选•PCR筛选法：根据保守序列合成引物，扩增特异性片段2.3.3 cDNA文库和基因组文库的区别时效性: cDNA 文库代表某一时期特定细胞或组织中mRAN，是转录水平，仅反映某一时期特定组织表达的功能基因，不是全部基因；而基因组文库包含该生物所有基因。
序列组成不：cDNA 文库无间隔序列和调控区等非编码区；基因组文库可真实显示基因组的全部结构信息，由于制备DNA片段的切点是随机的，所以每一克隆内所含的DNA片段既可能是一个或几个基因，也可能是一个基因的一部分或除完整基因外还包含着两侧的邻近DNA顺序。
两种文库均有应用，如何选择：根据试验目的，在分离植物RNA、病毒基因、研究植物功能蛋白序列、分离植物特定发育阶段或特特异表达的基因时应用cDNA文库；在研究mRNA不存在的序列及基因组作图时必须构建基因组文库。
2.4 化学合成法该方法有个先决条件就是必须已知其核苷酸顺序，或者已知其蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出DNA的核苷酸序列。
用化学合成此基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成黏性末端的DNA双链片段。
然后将这些DNA片段按正确的次序进行退火连接起来形成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。