(完整word版)目的基因到工程菌的构建

目的基因到工程菌的构建

1基因工程的诞生

1972年，美国斯坦福大学的学者首先在体外进行了DNA改造的研究，他们把SV40（一种猴病毒）的DNA分别切割，又将两者连接在一起，成功构建了第一个体外重组的人工DNA分子。1973年，Cohen等人首次在体外将重组的DNA分子导入大肠杆菌中，成功地进行了无性繁殖，从而完成了DNA体外重组和扩增的全过程。在这个的基础上，基因工程诞生了。

SV40病毒

第一个重组体的构建

1.1基因工程技术的三大理论基础

一是20世纪40年代Avery等人通过肺炎球菌的转化实验证明了生物的遗传物质是DNA，而且证明了通过DNA可以把一个细菌的性状转移给另一个细菌。二是20世纪50年代Watson和Crick发现了DNA分子的双螺旋结构及DNA的半保留复制机理。三是20世纪60年代关于遗传信息中心法则的确立，即生物体中遗传信息是按DN A→RNA→蛋白质的方向

进行传递的。

1.2基因工程技术的三大技术基础

三大基本技术问题：一是如何从生物体庞大的双链DNA分子中将所需的基因片段切割下来；二是如何将切割下来的DNA片段进行繁殖扩增；三是如何将所获得的基因片段重新连接。20世纪70年代，由Smith等人发现的核酸限制性内切酶、DNA连接酶和可以作为基因工程载体的细菌质粒的发现，解决了上述三大问题。

1.2.1 限制性核酸内切酶

限制性内切酶不切割自身DNA是因为原核生物中不存在酶的识别序列或识别序列已经被修饰。

1.2.2 DNA连接酶

作用实质：将具有末端碱基互补的2个DNA片段连接在一起，形成重组DNA分子，其起作用时不需要模板。

1.2.3 基因工程的载体-质粒

基因载体的作用是运载目的基因进入宿主细胞，使之能得到复制和进行表达。也就是说，离开染色体的外源DNA不能复制，而而插入复制子DNA的外源DNA可作为复制子的一部分在受体菌中进行复制，这种复

制子是外源基因的载体。此外，为满足其使命，还必须具备如下一些特性：①能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制，在其DNA插入外源基因后，仍然保持稳定的复制状态和遗传特性。②易于从宿主细胞中分离，并进行纯化。③载体DNA序列中有适当的限制性内切酶位点，并位于DNA复制的非必需区内，可以在这些位点上插入外源DNA，但不影响载体自身DNA的复制。某些病毒载体在外源DNA插入后变成缺损性病毒株，只能在有辅助存在时才能进行正常增殖。④具有能够观察的表型特征（有报告基因），在插入外源DNA后，这些特征可以作为重组DNA选择标志。

1.3基因工程的基本过程

1.4基因工程的应用

2目的基因的获取

基因工程订是通过人工方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而深入开展核酸遗传研究或者获取有价值的基因产物。通常我们把插入

到载体内那个特定的片段基因称为“外源基因”，而将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段称为“目的基因”。

来源于真核细胞的产生基因工程药物的基因是不能直接进行分离的。真核细胞中单拷贝基因只是染色体DNA中很小的一部分，为其10-5 -10-7 ，即使多拷贝基因也只有其10-5，因此从染色体中直接分离纯化目的基因极为困难。另外，真核基因内一般都有内含子，如果以原核细胞作为表达系统，即便分离出真核基因，由于原核细胞缺乏mRNA的转录后加工系统，真核基因转录的mRNA也不能加工、拼接成为成熟的mRNA，因此不能直接克隆真核基因，必须采用特殊方法分离目的基因。

目的基因的获取大致可以分为三类：一是利用PCR技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆、表达；二是构建感兴趣的生物个体的基因组文库或者cDNA文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从文库中挑出含有目的基因的重组克隆；三是近年来发展的利用基因差异表达获取目的基因

的技术。

2.1 直接分离法（鸟枪法）

直接从生物细胞基因组中获取目的基因

最常用的方法是“鸟枪法”，又称“散弹枪法”。

其是将供体生物的DNA用限制酶切割为许多

片段，再用运载体将这些片段都运载到受体

生物的不同细胞中去。只要有一个细胞获得

了需要的目的基因并得以表达，基因工程就

算成功了。

该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去。优点是速度快，简单易行，成本较低，并能获得与天然基因组DNA一样的有内含子的真核基因DNA片段。

2.2 逆转录法（cDNA法）

逆转录法合成DNA是人工模拟自然界某些生物的反转录过程。主要用于分子量较大而又不知道其序列的基因，它以目的基因的mRNA为模板，以dNTP为底物，酶催化按5ˊ→3ˊ方向合成一条与RNA模板互补的DNA单链（cDNA），它与RNA模板形成RNA与DNA的杂交体。随后又在反转录酶的作用下水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，由RNA指导的DNA合成过程完成。

2.3 反转录-聚合酶链式反应法（PCR法）

该法是将mRNA经反转录全成cDNA 的第一链，不需再合成cDNA第二链，而是在特异引物的协助下，用PCR法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组、

克隆。常用于含其极微量mRNA的细胞。

2.3.1 cDNA文库

cDNA文库是将生物特定的组织器官或特定发育时期的全部mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了其全部表达基因的转录本。原理是将带poly（A）的mRNA经酶促反应转变为双链DNA，再与原核载体连接。

cDNA文库的构建：

2.3.1.1 cDNA第一链的合成

利用反转录酶合成cDNA第一链

2.3.1.2cDNA第二链的合成

①自身引导合成法：单链cDNA的3’端能够形成发夹状的结构作为引物，在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下，合成cDNA的第二链.此法存在的缺点是在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时，会导致对应于mRNA 5’端的地方的序列出现缺失和重排.