(完整版)大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备方法
大肠杆菌感受态细胞的制备步骤：
1．划线，出单菌落。
2．挑取单菌落，接种于5ml psI液体培养基中（试管），37℃振荡培养12h左右，直至对数生长后期。
3．转接，取菌悬液以1%的比例接种于100ml psI液体培养基中，37℃振荡培养2-3h至OD600=0.5左右。
4．OD值达到后，取下摇瓶冰上放置20min。
5．将培养液转入50ml离心管中，4℃，5000rpm，离心10min。
6．弃上清，用0.4倍体积冰冷的溶液I轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30min后，4℃下5000rpm 离心10min。
7．弃上清，加入0.04倍体积的溶液II，轻轻悬浮细胞，冰上放置15min，即成感受态细胞悬液。
8．感受态细胞分装成100μl的小份，贮存于-80℃。
溶液与试剂
1.psI培养基配制：
酵母提取物5g，胰蛋白胨20g，MgSO4 7H2O 5g，定容至1000ml，用KOH调pH=7.6 2.溶液I配制：
将5g RbCl，1M KAc 12.3ml，1M CaCl2 4.1ml，1M MnCl2 20.5ml，61.5ml甘油混匀，用0.1M乙酸调pH=5.8，加水定容至410ml。
过滤除菌。
3.溶液II配制：
将1M Mops 1.5ml，1M CaCl2 11.25ml，1M RbCl 1.5ml，22.5ml甘油混合均匀后，1M KOH 调pH=6.5，加超纯水定容至150ml，过滤除菌。
(完整版)大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(JinLab)
(Jin Quan-Wen Lab at XMU)
一、大肠杆菌电转化感受态细胞制备：
第Hale Waihona Puke 天：1. 用枪头或接种环挑取单克隆菌落， 接种入盛有 5ml LB 液体培养基的培养管中， 可以准备两管。 37 C，220rpm，培养过夜（ 14-16 个小时）。
2. 高温灭菌大的离心瓶（ 250-500ml）和几个 50ml 离心管，以备第二天离心收 集细菌用。
* Optimal efficiency is ca. 1X10 8 cfu/ gμDNA for general cloning. ** For library transformation, efficiency with ca. 1X10 9 cfu/ gμDNA is required.
感受态细胞制备简要流程： 收集细胞 冰水冲洗细胞 2 次 10% 甘油冲洗细胞 1 次 重悬细胞在 10% 甘油 分装
5．弃上清液，加少量灭菌水，重悬菌体，再加水至所有细胞悬浮约 中。 4 C，4000rpm，离心 15 分钟。
500ml 冰水
6．弃上清，往离心管中加入少量 10%甘油 (灭菌，预冷 )，重悬菌体，再加 10% 甘油至终体积约为 20ml。 4 C, 4000rpm, 离心 10min 。
7．小心弃去上清（沉淀可能会很松散 !），加入 2ml 10%甘油 (灭菌，预冷 )重悬 浮细胞。
二、电转化 [连接产物、纯化质粒或质粒 ]： 1．从 -80 C 冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻。 2．将无菌的电击杯置于冰上预冷。 3．将解冻的感受态细胞按照 40～ 100ul/管转移至预冷的 1.5ml 的离心管中，小
心混匀，冰上放置。 4．取 1-2 μl 纯化的质粒或克隆连接产物于 1.5ml 的离心管中，冰上放置 10min。
大肠杆菌感受态细胞得制备原理、步骤以及重组质粒转化
一、目得1、了解感受态细胞生理特性及制备条件,掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2、掌握质粒DNA 转化大肠杆菌得方法,了解转化得条件与利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 得原理。
二、原理(一)大肠杆菌感受态细胞制备得原理所谓感受态,就是指细菌生长过程中得某一阶段得培养物,只有某一生长阶段中得细菌才能作为转化得受体,能接受外源DNA而不将其降解得生理状态。
感受态形成后,细胞生理状态会发生改变,出现各种蛋白质与酶,负责供体DNA 得结合与加工等。
细胞表面正电荷增加,通透性增加,形成能接受外来得DNA 分子得受体位点等。
本实验为了把外源DNA(重组质粒)引入大肠杆菌,就必须先制备能吸收外来DNA分子得感受态细胞。
在细菌中,能发生感受态细胞就是占极少数。
而且,细菌得感受态就是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子得本质瞧法不一。
主要有两种假说:1、局部原生质体化假说――细胞表面得细胞壁结构发生变化,即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁,使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有:(1)发芽得芽孢杆菌容易转化;(2)大肠杆菌得原生质体不能被噬菌体感染,却能受噬菌体DNA 转化;(3)适量得溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞得表面形成一种能接受DNA 得酶位点,使DNA分子能进入细胞。
证据就是:(1)蛋白质合成得抑制剂如氯霉素,可以抑制转化作用;(2)细胞分裂过程中,一直有局部原生质化,但感受态只在生长对数期得中早期出现;(3)分离到感受态因子,能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞得转化理论尚未有统一结论,但就是许多实验室一直进行探索,试图从实验中获得明确回答。
有人根据pBR322 质粒DNA对E・coli K――12X1776菌株得转化结果,认为:近来,在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理,可提高转化效率几十倍,通常把细胞悬浮在p H6、0 得100mmol/L CaCl2中,在冰浴条件下,放置过夜,转化率转高,但一过24小时,转化率测恢复为原来得水平。
CaCl2法大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)
感受态细胞(Competent cells):
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
（1）从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于3~4ml LB液体培养中，37℃振荡培养~12h左右，直至对数生长期。
将该菌悬液以1:100～1:50转接于3 x 100ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600nm，至OD600nm≤0.5时停止培养；
（2）取培养液50ml转入50ml离心管中，在冰上冷却30min，于4℃，4000r／min离心10min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；
（3）倒净上清培养液，用15ml冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴10Min；（4）0～4℃，4000r／min离心10min；
（5）弃去上清液，加入~15ml冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。
冰浴10 min 后，0～4℃，4000r／min离心10min；
（6）弃去上清液，加入2ml冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；
（7）加入占总体积10％左右高压灭菌过的甘油，混匀后以200 l为单位分装于0.5ml EP 管中，置于-80℃保存。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞是一种重要的细菌功能研究模型。
下面是制备大肠杆菌感受态细胞的步骤：
1. 选择适当的大肠杆菌菌株，通常使用DH5α或BL21(DE3)等菌株；
2. 选用适当的质粒载体（例如pET系列），根据需要将目标基因插入载体中；
3. 制备大肠杆菌的化学转化液（例如CaCl2转化法），转化质粒到大肠杆菌细胞中；
4. 通过筛选和鉴定，筛选出带有目标基因的单克隆菌株；
5. 将单克隆菌株培养至对数生长期，然后添加适当浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），诱导目标基因的表达；
6. 培养细胞至感受态状态，通常需要1-2小时的诱导时间；
7. 用适当的方法分离并提取感受态细胞膜，例如超声法或离心法；
8. 在提取的细胞膜中添加目标配体或生理作用物质，检测感受态细胞的响应。
通过这些步骤，我们可以制备出高效的大肠杆菌感受态细胞，用于研究蛋白质的结构和功能、药物筛选等方面的研究。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备1. CaCl2法1）从新鲜平板上挑取一个单菌落，转到含有5ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养8－12小时。
2）将培养物接种到200ml LB培养基中，37℃培养至OD约为0.3到0.5，然后置于冰浴中20分钟。
3）用预冷的30ml管收集菌体，4℃6000rpm 离心5分钟。
4）弃上清，于超净台中倒置10－20秒，控干管壁上的液滴。
5）用预冷的0.1M CaCl210ml重悬菌体，4℃6000rpm 离心5分钟；弃上清，于超净台中倒置10－20秒，控干管壁上的液滴。
6）重复步骤5）7）加入预冷的0.1MCaCl2 1ml/管，重悬菌体，置于4℃。
8）立即取100μl新鲜制备的感受态细胞转化质粒或连接产物。
9）转化结束后14小时左右观察转化平板，检测转化效率。
10）取出置于4℃的感受态细胞，加入等体积的－20℃预冷的0.1M CaCl2－甘油（由0.1MCaCl和甘油等体积混合后高压蒸汽灭菌而成），混匀后以150μl/管分装至－20℃预冷的无菌微量离心管中，立即置于－70℃保存。
2.细菌电转化感受态细胞的制备1）将新鲜的菌落或细菌菌种冻存物接种于含5ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养8－12小时，然后转接含400ml LB培养基的1L摇瓶中，37℃振荡培养至OD600约为0.8，将细菌培养物置于冰浴20－60分钟。
2）用预冷的30ml离心管于4℃6000rpm离心5分钟。
收集菌体，弃上清。
3）用预冷的10％甘油（10％超纯甘油加90％去离子水，高压蒸汽灭菌）轻轻重悬菌体，4℃6000rpm离心5分钟，弃上清。
4）重复步骤3）两次，最后合并至1支30ml管中。
5）弃上清后，用1ml无菌、预冷的10％甘油轻轻重悬菌体，分装至无菌预冷的微量离心管中，每管20μl，保存于－70℃。
用该方法制备的细菌感受态细胞转化效率比CaCl2法高出100倍左右。
实验大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
。
感受态细胞 质粒DNA
蒸馏水
转化体系 100ul
1ul
空白对照 100ul
1ul
实验步骤
2、轻轻混匀，立即放在冰上30min； 3、42℃水浴90s，然后迅速冰浴1-2min； 4、加入0.8ml LB液体培养基，160r/min，37 ℃培养
40min； 5、稀释后，取培养液100ul，涂布于具有50ug/ml
制备感受态旳细胞一般选择对数生长久，新鲜幼嫩旳 细胞是制备感受态细胞和进行成功转化旳关键。常用旳感 受态制备措施涉及KCl、CaCl2等措施；后者因为操作简便 且符合大多数旳分子克隆要求，因而被广泛采用。
实验原理
CaCl2 法旳基本原理： 细菌处于低温（0℃）和低渗旳CaCl2溶液
中，菌体膨胀，细胞膜旳通透性发生了临时性 旳变化，转化混合物中旳DNA形成抗DNase旳 羟基-钙磷酸复合物黏附于菌体表面，在42℃ 进行短时间旳热激处理，增进DNA旳吸收。
实验原理
2、质粒旳质量和浓度：用于转化旳质粒DNA应主要 是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA旳浓度在一 定范围内成正比，但当加入旳外源DNA旳量过多或 体积过大时，转化效率就会降低。
1ng旳超螺旋态DNA即可使50μl 旳感受态细胞到 达饱和。一般情况下，DNA溶液旳体积不应超出感 受态细胞体积旳5％。
实验原理
CaCl2 法简便易行，用 CaCl2法制备旳 感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DNA 产生5106-2107个转化菌落。在实际工作 中，每微克有105以上旳转化菌落足以满足 一般旳克隆试验。
制备出旳感受态细胞临时不用时，加入 占总体积15％旳无菌甘油于-70℃，能够保 存六个月。
实验原理
实验大肠杆菌感受态 细胞的制备和转化
实验6_大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
试剂 1、LB固体和液体培养基
LB培养基配方：（单位g/L）
胰蛋白胨 10
酵母提取物 5
NaCl
10
琼脂（1.5%） 15g （注：LB培养液不加琼脂）
按配方称量药品,加入一定量的ddH2O后置电炉上加热熔解琼脂， 待琼脂完全熔解后加入ddH2O定容至1000ml,用NaOH调节pH至7.0。 121℃湿热高压灭菌20-30分钟，待冷却至60℃左右,在超净工作台中
pUC19载体带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码 信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框；宿主 细胞编码β-半乳糖苷酶C端部分序列。这样，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶 （ β-半乳糖苷酶）活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这 种现象称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生 色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。
由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物XGal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的 多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带 有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。如 用蓝白斑筛选则经连接产物转化的平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重 组质粒的细菌形成白色菌落。
4000rpm离心5分钟。
2、弃去上清（轻轻倾倒掉上清液，并用吸水纸或移液器移除残余 的过多水分）。
3、加入1ml预冷的0. 1mol/L的CaCl2 溶液，轻轻拨动管底使细胞 完全悬浮,冰上放置15分钟后,4℃下4000rpm离心5分钟。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛存在于自然界中。
在科学研究中，大肠杆菌常被用作实验模型，因其生长迅速、培养简便，以及对环境因素的敏感性等特点。
为了更好地研究大肠杆菌的感受态细胞，需要进行细胞的制备工作。
大肠杆菌感受态细胞的制备工作通常包括以下几个步骤：1. 培养基的准备：首先，需要准备适合大肠杆菌生长的培养基。
常用的培养基包括Luria-Bertani（LB）培养基和M9培养基等。
这些培养基含有适量的营养物质，可以提供大肠杆菌生长所需的营养。
2. 菌液的接种：将已保存的大肠杆菌菌株接种到含有培养基的试管中。
接种前需要将试管和接种环进行高温灭菌处理，以消除外源性污染。
接种时应注意使用无菌技术，避免细菌污染。
3. 培养条件的控制：接种完成后，需要将试管放入恒温摇床或培养箱中进行培养。
培养的温度通常为37摄氏度，培养时间视实验需要而定。
同时，还需要控制培养基的pH值，保持在适宜的范围内。
4. 细胞的收获：培养一定时间后，可以通过离心的方法将细菌沉淀下来。
离心速度和时间的控制要根据细菌的大小和培养液的体积来确定。
沉淀下来的细菌即为大肠杆菌感受态细胞。
5. 细胞的保存：为了长期保存大肠杆菌感受态细胞，可以将其冻存。
冻存液的配制需要添加一定比例的甘油或DMSO等保护剂，以防细胞在冻存过程中受到损伤。
冻存后的感受态细胞可以在需要时重新复苏。
通过以上步骤，我们可以成功制备出大肠杆菌感受态细胞。
这些细胞可以用于进一步的研究，如基因表达调控、信号传导等方面的实验。
同时，制备大肠杆菌感受态细胞的方法也可以应用到其他微生物的研究中。
大肠杆菌感受态细胞的制备是一项重要的实验工作，它为我们深入研究大肠杆菌的生物学特性提供了基础。
通过合理的实验设计和精确的操作，我们可以获得高质量的感受态细胞，为科学研究的进展做出贡献。
希望本文的内容能够对相关研究人员有所帮助，推动科学的发展和进步。
大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思
大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思【原创版3篇】目录（篇1）1.实验目的与原理2.实验步骤3.实验结果与分析4.实验反思正文（篇1）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌中，从而实现目的基因的表达。
实验原理主要基于重组 DNA 技术，通过外源 DNA 与载体 DNA 的连接，形成重组表达载体，然后将载体转化入大肠杆菌细胞内，使外源基因得以在细胞内表达。
二、实验步骤1.制备大肠杆菌感受态细胞（1）将 500 ml DH5a 的培养物在 LB 中培养至 OD 0.4-0.5（2）将培养瓶在冰浴中摇动 1-2 分钟以预冷细胞（3）将细胞置于无菌预冷离心瓶中，在 5K、4 下旋转 10 分钟（4）弃上清，并将菌液重浮于 1/10 体积 (即 50 毫升) 的冰冷的TSS 中（5）将 05 ml 样品放入预冷的无菌 Eppendorf 试管中，在液氮中快速冷冻。
在一 70C 下储存 KCM 感受态细胞2.转化实验（1）加入 20ul 5XKCM，加入 DNA 和 dd H20 至总体积为 100ul，保持冰上（2）加入 100ul 感受态细胞，混合并在冰上保持 20 分钟（3）37 热激 90 秒（4）向试管中加入 1ml 预热的 LB，在 37 温育 40-60 分钟（5）离心，剩余 50uL 菌体涂布在选择性培养基 (LB-amp/kana) 上。
三、实验结果与分析实验结果主要观察转化后大肠杆菌菌落是否具有抗生素抗性。
将涂布后的培养基在适当条件下培养，观察菌落生长情况。
若菌落生长，说明转化成功；若无菌落生长，则转化失败。
四、实验反思本次实验中，制备感受态细胞及转化过程均较为顺利，但需要注意实验过程中的无菌操作，避免因操作不当导致实验失败。
目录（篇2）1.实验目的与原理2.实验步骤及操作要点3.实验结果与分析4.实验反思与建议正文（篇2）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌，从而实现基因的表达和功能研究。
感受态细胞的制备（DH5α大肠杆菌）
感受态细胞的制备（DH5α大肠杆菌）感受态细胞的制备（DH5α大肠杆菌）一、准备工作1、实验器械4℃离心机（50ml离心管），37℃恒温箱，37℃摇床，紫外通风橱（提前一天预约）；0.22μm的滤器2个，10ml注射器2个；冰盒；高压灭菌的1.5mlEP管30个，与离心机配套的50ml离心管6个（高压灭菌），高压灭菌的500ml锥形瓶2个，高压灭菌的100ml 玻璃瓶2个，高压灭菌的1ml枪头和200μl枪头各一盒。
2、试剂配制① LB平板② TYM培养基：分别称取胰蛋白胨4g，NaCl 1.46g，酵母提取物1g，MgSO4 0.62g，至于250ml烧杯中，加入120mlDDW，摇晃，使其全部溶解，用浓NaOH调节PH值为7.5，最后定容至200ml，转入至500ml锥形瓶，高压灭菌，4℃保存。
③ TfBⅠ：分别称取乙酸钾0.294g，MnCl2 0.99g，KCl 0.146g，CaCl2 0.111g，置于200ml 烧杯中，加入15ml甘油和85mlDDW，摇晃，使其全部溶解。
然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，置于高压灭菌的100ml玻璃瓶中，4℃保存，使用前必须预冷。
④ TfBⅡ（每次现用现配）：分别称取MOPS 0.046g，CaCl20.167g，KCl 0.015g，置于50ml烧杯中，加入3ml甘油和17mlDDW, 摇晃，使其全部溶解。
然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，置于高压灭菌的100ml玻璃瓶中，4℃保存，使用前必须预冷。
二、实验步骤1、将DH5α甘油菌从-80℃冰箱中拿出来放在冰上，用枪头吸蘸取或取少部分菌液加到无抗生素的LB平板边缘，在火上稍微烧一下枪头，在平板侧壁上冷却枪头，同时使其顶端变圆变钝。
划线接种，倒置放入37℃恒温箱过夜。
注：①尽量在菌液融化前挑取，反复冻融对菌体有损伤。
②吸取菌液后，尽可能快把甘油菌放回-80℃冰箱。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物技术领域。
在生物技术中，大肠杆菌感受态细胞的制备是非常重要的一步。
感受态细胞是指细胞表面有特定的受体，能够感受到外界的信号，从而引发细胞内的反应。
下面将介绍大肠杆菌感受态细胞的制备方法。
1. 菌株的选择首先需要选择适合的大肠杆菌菌株。
常用的菌株有DH5α、BL21等。
这些菌株具有较高的转化效率和稳定性，适合用于感受态细胞的制备。
2. 受体的构建感受态细胞的制备需要构建受体。
受体是一种蛋白质，能够与外界的信号分子结合，从而引发细胞内的反应。
常用的受体有蛋白激酶、离子通道等。
构建受体需要进行基因克隆、表达、纯化等步骤。
3. 质粒的构建构建受体需要使用质粒。
质粒是一种环状DNA分子，能够在细胞内自主复制。
常用的质粒有pET、pGEX等。
构建质粒需要进行基因克隆、转化、筛选等步骤。
4. 细胞的转化将构建好的质粒转化到大肠杆菌中。
转化是指将外源DNA导入到细胞内，使其表达外源蛋白。
转化需要进行化学转化、电转化等步骤。
5. 细胞的培养转化后的细胞需要进行培养。
培养条件包括温度、氧气、营养物质等。
培养时间需要根据不同的实验目的进行调整。
6. 受体的表达和纯化经过培养后，细胞内的受体会被表达出来。
为了得到纯净的受体，需要进行蛋白质纯化。
常用的纯化方法有亲和层析、离子交换层析等。
7. 受体的功能验证得到纯净的受体后，需要进行功能验证。
功能验证是指验证受体是否能够与外界的信号分子结合，并引发细胞内的反应。
常用的功能验证方法有荧光共振能量转移（FRET）、酶联免疫吸附实验（ELISA）等。
大肠杆菌感受态细胞的制备需要进行菌株的选择、受体的构建、质粒的构建、细胞的转化、细胞的培养、受体的表达和纯化、受体的功能验证等步骤。
这些步骤需要严格控制，才能得到高质量的感受态细胞。
实验六 大肠杆菌感受态细胞的制备
三、实验材料
水浴锅、制冰机、离心机、超净工作台、恒温培养 箱、各式移液器、培养皿； 大肠杆菌DH5α； LB液体培养基、0.1M CaCl2溶液。
四、实验步骤
①挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37 ℃， 250r/min，过夜。 ②取150μl过夜培养物接种于15ml LB液体培养基中， 37 ℃，250r/min，培养至OD600 ≈0.375（一般为2h 左右，呈云雾状，使细菌处于对数早期或中期）。 ③将培养物1.5ml分装到预冷无菌的指形管中，冰上放 置5～10min。4 ℃，2000rpm，10min，弃上清。
实验六
大肠杆菌 感受态细胞的制备
一、实验目的
掌握制备大肠杆菌感受态细胞的方法
二、实验原理
Hale Waihona Puke 遗传物质的传递，一般常用接合转移、细胞融合、 转导、转染、转化等方法进行。 转化是指某一细胞由于接受了外源DNA，而导致其 原来的遗传性状发生改变，这种遗传性状包括遗传 型与表型的改变。
感受态是受体菌能接受外源DNA（周围环境中的 DNA分子）能力的一种生理状态，一般认为在细菌 生长对数期的后期是发展感受态的理想时期。
④沉淀用1ml冰冷的CaCl2溶液重悬， 4 ℃，2000rpm， 10min。 ⑤重复步骤④。 ⑥用200μl冰冷的CaCl2溶液重悬细胞，冰上放置30min， 备用。
五、思考题
重组基因的导入方法有哪些?
大肠杆菌感受态细胞制备
E.coli Top10感受态细胞制备（CaCl2法）一、实验材料准备灭菌材料（提前2天）：一盒1.5mL EP管，6支50mL离心管（用四个），无菌大板小板，LB固体培养基，200mL LB液体培养基（100mL LB/500mL锥形瓶，现配，超纯水），0.1M CaCl2（现配50mL）、0.1M CaCl2+15%甘油（现配50mL）。
二、菌种活化无菌枪尖吸5μL感受态细胞（菌种也可）在新鲜的LB琼脂平板划线，37℃培养12-16小时。
注：划线尽量长、多，这样才可分出单菌落；如果早上做尽量早点接种划线，最好9点之前，否则就前一天晚上划线过夜培养；单个LB板（选用大板）如果用100mL倒平板，可先倒一个LB板（按15mL计算），剩余LB再加抗生素制成抗性平板。
三、预培养从LB平板上挑取一个分隔良好(处于线上形态圆润)的单菌落，转到一个含5mL LB的试管中，37℃，150rpm,12h。
此处过夜培养注：此处用两支试管，挑2个单菌落，但后面只用一个试管，好处防止某个管不长。
四、培养至对数期第二天早上从5mL菌液中各吸取1mL转接入2个100mL LB/500mL锥形瓶，37℃，200rpm，培养约2h，使OD达到0.4~0.6。
转接前吸取2mL LB培养基作空白对照。
在一个半小时时就测OD600，然后每隔10分钟测一次，接近0.4时每隔2分钟测一次。
注：开始接种时就把50mL和 1.5mL离心管放在-20℃冰箱，0.1M CaCl2、0.1MCaCl2+15%甘油、整盒蓝黄枪尖放在4℃。
培养1h时打开分光光度计预热，离心机预冷至4℃。
五、感受态细胞制备1.无菌条件下，将菌液转移到4个预冷的50mL圆底离心管中，在冰上放置10min。
2.4℃，1500g（尖底离心管1300rpm），离心10min，去上清，用枪吸尽残存培养基。
3.10mL预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌体，放置冰上，10min。
大肠杆菌热击感受态细胞的制备、注意事项和转化
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化大肠杆菌感受态细胞制备的原理：大肠杆菌自然条件下很难进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难。
在转化实验中，通常先采用人工的方法制备感受态细胞，代表性的方法之一是Ca2+诱导法。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA分子的受体位点等。
Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞的转化：①在0℃的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时CaCl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。
②Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶（DNase）的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。
当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。
一、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。
将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。
（OD600值在0.4到0.6之间）二、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
2、弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
4、感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-80℃可保存半年。
大肠杆菌感受态过程中的注意事项：1、细菌的生长状态：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
实验九大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
02
在实验过程中，发现感受态细胞的质量和转化效率受到多种因素的影响，如试 剂浓度、温度、时间等。因此，需要严格控制实验条件，确保实验结果的可靠 性和可重复性。
03
实验中还发现，不同批次的大肠杆菌菌株对感受态细胞制备和转化的影响也较 大，这可能与菌株的遗传背景和生理状态有关。因此，在实验中应尽量使用同 一种菌株，以保证结果的稳定性。
序列分析
对转化子进行序列分析，进一步验证目的基 因的准确性。
05
结果与数据分析
转化效率的计算
转化效率计算公式
转化效率 = (转化子数量 / 菌落总数) × 转化体系中 DNA的总量。
转化效率的影响因素
感受态细胞的制备方法、DNA的质量和浓度、转化条 件等。
转化效率的优化
通过调整感受态细胞制备方法和优化转化条件，可以 提高转化效率。
实验材料与试剂
实验材料：大肠杆菌菌株
大肠杆菌菌株
用于制备感受态细胞和转化实验的基本材料，应选择生长旺 盛、纯度高的菌株。
注意事项
确保菌株无污染，并按照实验室规定进行菌株保存和使用。
试剂：CaCl2、LB培养基、Amp等
CaCl2
用于制备感受态细胞的试剂，能够提高大肠 杆菌的转化效率。
LB培养基
用于培养大肠杆菌的生长，提供必要的营养 物质。
02
实验过程中，通过调整试剂浓度、温度和时间等参数，优化了感受态 细胞的制备和转化条件。
03
成功将外源DNA导入感受态细胞，并通过抗生素筛选获得了转化子。
04
实验结果表明，感受态细胞的制备和转化是实现基因克隆和表达的关 键步骤，为后续的分子生物学实验奠定了基础。
结果分析与讨论
01
实验结果与预期基本一致，成功实现了大肠杆菌感受态细胞的制备和转化。
实验10、大肠杆菌感受态的制备
实验十、大肠杆菌感受态细胞的制备【实验目的】熟悉利用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的操作及质粒转化大肠杆菌的方法。
【实验原理】当大肠杆菌生长到OD600约为0.2~0.4时，用冰冷的氯化钙低渗溶液处理大肠杆菌细胞，细胞膨胀成球形，可使大肠杆菌进入一种易于接受外源DNA的状态（感受态），处于此状态的细胞称为感受态细胞（competent cells）。
【器材与试剂】1．实验仪器培养箱，恒温摇床，超净工作台，低温台式离心机，分光光度计，水浴锅，高压灭菌锅，微孔滤器（含0.22μm滤膜），酒精灯2．实验试剂氯化钠，无水CaCl2，蛋白胨，酵母提取物，1.0 mol/L NaOH，氨苄青霉素钠，琼脂粉，LB液体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl10 g，800 mL蒸馏水溶解后，用NaOH溶液调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min；LB固体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl10 g，800 mL蒸馏水溶解后，用1.0 mol/L NaOH调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，然后加入琼脂粉15 g，121℃高压灭菌20min，分别倒入无菌培养皿。
若配制选择性培养基，当温度降至60℃左右时，加入1 mL氨苄青霉素溶液（100mg/mL），混匀，分别倒入无菌培养皿；CaCl2溶液：准确称取无水氯化钙11.1 g，用双蒸水溶解，并定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min，4℃保存；氨苄青霉素钠溶液：准确称取氨苄青霉素钠0.5 g，用蒸馏水溶解并定容至5 mL，用微孔滤器过滤除菌后，分装于Eppendorf管中，-20℃保存。
3.实验材料E.coli DH5α, pUC18质粒【实验步骤】1．接种大肠杆菌单菌落于2 mL LB液体培养基中，37℃振荡（约250r/min）培养过夜。
2. 将2 mL过夜培养物转接到盛有100 mL的LB液体培养基的500 mL三角瓶中，37℃继续振荡培养至OD600约为0.2~0.4（约2 h）。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验原理及步骤
实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验原理体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。
研究发现，用含Ca2+ 的溶液处理大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA。
大肠杆菌吸收外源DNA的过程被称为转化。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。
用理化方法可以诱导细胞进入感受态，如电转化法、CaCL2法。
CaCL2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0°C 、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42°C短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。
宿主细胞一般是限制―修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，而质粒载体携带有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素的基因（AP＋）。
若将转化的细胞涂布与于含氨卞青霉素的平板上，则只有那些含有被转化质粒的细胞才能生存并生长增殖。
从而可以筛选出哪个克隆含有质粒。
本实验以E.coli JM109菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温实现转化。
将经过转化后的全部受体细胞进行适当稀释，在含有氨卞青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未有转化的受体细胞则因无抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。
转化子经过扩增后，可将转入的质粒DNA分离提取出来，用于电泳分析、限制性内切酶图谱的制作以及DNA测序等实验。
二、仪器及试剂1. 仪器：恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、超净工作台、分光光度计、高速冷冻离心机、台式离心机。
2. 材料E.coli JM109受体菌、质粒pUC18。
3. 试剂：LB培养液（1L）：胰蛋白胨 10g酵母粉 5gNaCl 10g（高盐）或5g（低盐）氨苄青霉素（Ampicillin） 100mg/ml在三角瓶中将胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高压灭菌。
(完整版)大肠杆菌感受态细胞的制备
所用的 CaCl2 等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于 ⑶、防止杂菌和杂 DNA 的污染
4 ℃。
整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿， 如离心管， 移液枪头等最好是新的， 并经
高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、
DNA 酶或杂 DNA 所污染，
否则均会影响转化效率或杂 DNA 的转入。
OD600 控制。对
TG1 菌株， OD600 为 0 ． 5 时，细胞密度在 5×107 个 /ml 左右。（应注意 OD600 值与细
胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。
此外，受体
细胞一般应是限制 -修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并
且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。 ⑵、试剂的质量
上摇动 10min, 弃去染色液 .
③ 加入约 50ml 的水 , 再加热至沸腾后保持沸腾状态
30-60s, 停止加热后在摇床上要
5-10min, 换水可完成脱色 .
④ 若要得到无背景的染色胶 ,可重复脱色步骤或将胶放在水中过夜 .
镍柱。 用不同浓度的咪唑洗脱。 因为咪唑和组氨酸都带正电， 可在咪唑逐渐加大浓度的条件 下洗脱目的蛋白。 protocol 里有啊。
（二）感受态细胞的制备（注意：以下操作在超净工作台完成。） (1) 将菌液转入 50mL 离心管中，冰上放置 10min 。 (2) 在 4 ℃下， 4000r/min 离心 10min 。弃去上清，将管倒置 1min 以便培养液流尽。 (3) 用冰上预冷的 0.1mol/L 的 CaCl2 溶液 10mL 轻轻悬浮细胞，冰上放置 30min 。 (4)0 ～ 4℃ 4000r/min 离心 10min ，弃去上清， 加入 2mL 预冷的 0.1mol/L 的 CaCl2 溶液， 轻轻悬浮细胞，冰上放置（务必冰上放置）。 （注意：以上操作完成了新鲜感受态细胞的制 备）
大肠杆菌感受态细胞制备方法-
大肠杆菌感受态细胞制备方法：
(1)用牙签挑取活化好的大肠杆菌DH5α单菌落，接种到装有50mL LB培养基的三角瓶中，在37°C、230r/min振荡培养过夜；
(2)用移液枪吸取0.5mL上述培养液至装有250mLSOB液体培养基的500 mL三角瓶中，在18°C、200r/min振荡培养过夜，长至OD600=0.6时取出；
(3)将上述培养液分装到预冷的50mL离心管中，每管装40mL，并冰激10 min；
(4)将50mL离心管在4°C、3000r/min转速下离心10min，收集菌体；
(5)使用预冷的80~100mL TB溶液轻轻冲洗菌体，分装为3管；
(6)冰激收集的TB菌液10min；
(7)将上述菌液在4°C、3000r/min转速下离心10min，收集菌体；
(8)使用约20mL预冷的TB溶液重悬菌体；
(9)添加DMSO至浓度为浓度为7%(约添加1.5mL)；
(10)冰激上述溶液10min；
(11)分装至预冷的1.5mL离心管中，每管约68μL，迅速放置于液氮中速冻；
(12)贮藏在-80°C冰箱备用。
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电泳 ,约 1h 后 ,loading buffer 条带跑到底 ,便可停止 . ⑸考马斯亮蓝染色 ① 将电泳后的 PAGE 胶取下放入容器中 ,加入 50ml 双蒸水或去离子 水 ,加热至沸腾后停止 ,
继续在脱色摇床上摇动 5min, 弃去水溶液 .
② 加上染色液 ,以浸没胶面为准 ,加热沸腾后保持状态 30-60s, 停止加热后继续在脱色摇床
了暂时性的改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞 （ Compenent cells ）。进入
受体细胞的 DNA 分子通过复制、 表达实现遗传信息的转移， 使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（
Transformant ，即带有异
源 DNA 分子的受体细胞）。目前常用的感受态细胞制备方法有
但在人工构建的质粒载
体中，一般缺乏此种转移所必需的 mob 基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞
的接合转移。 如需将质粒载体转移进受体细菌， 需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态， 以
摄取外源 DNA 。
转化（ Transformation ）是将外源 DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种
上摇动 10min, 弃去染色液 .
③ 加入约 50ml 的水 , 再加热至沸腾后保持沸腾状态
30-60s, 停止加热后在摇床上要
5-10min, 换水可完成脱色 .
④ 若要得到无背景的染色胶 ,可重复脱色步骤或将胶放在水中过夜 .
镍柱。 用不同浓度的咪唑洗脱。 因为咪唑和组氨酸都带正电， 可在咪唑逐渐加大浓度的条件 下洗脱目的蛋白。 protocol 里有啊。
Tris- HCl 1M PH8.0 1000 ⑵ 上样
μ l,NaCl 4M 1000
μ l,Brij 20
μ l,DTT 3 μ l, H2O 18ml.
加 2ml 上清到 Ni 柱中 ,并用 2ml AT buffer 冲洗 .(注意缓慢滴加 )
⑶ 洗脱样品
加上 1ml 的 salt washing buffer 冲洗 ,其配方是 AT buffer 8ml,NaCl 5M 2ml,Brij 100 μl.
(3)30% 甘油： 30mL 甘油溶于 100mL 蒸馏水，高压灭菌。 主要设备 (1) 超净工作台 (2) 冷冻离心机 (3) 恒温摇床 (4) － 70 ℃冰箱 (5)10mL 移液管 (6) 吸耳球 (7)1mL 、200 μＬ移液枪（配套枪头） (8)50mL 离心管 (9)1.5mL 离心管
分子蛋白质不能进入孔内而径直流出 ,因此不同大小的蛋白质得以分离 .6、超速离心： 利用物 质密度的不同 ,经超速离心后 ,分布于不同的液层而分离 .超速离心也可用来测定蛋白质的分
子量 ,蛋白质的分子量与其沉降系数 S 成正比 .
蛋白纯化过程中 ,过完柱子后的上清称为什么 ?
铵、氯化钠、硫酸钠等 .盐析时 ,溶液的 pH 在蛋白质的等电点处效果最好 .凡能与水以任意比
例混合的有机溶剂 ,如乙醇、甲醇、丙酮等 ,均可引起蛋白质沉淀 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ2、电泳法 ：蛋白质分子在
高于或低于其 pI 的溶液中带净的负或正电荷 ,因此在电场中可以移动 .电泳迁移率的大小主要
取决于蛋白质分子所带电荷量以及分子大小 .3、透析法 ：利用透析袋膜的超滤性质 ,可将大分
-70 ℃冰箱保存。）
注意事项
⑴、细胞的生长状态和密度
最好从 -70 ℃或 -20 ℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已 过多次转接， 及贮存在 4 ℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在
经 5×107
个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的
手段， 它是微生物遗传、 分子遗传、 基因工程等研究领域的基本实验技术。 转化过程所用的
受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体
（R-,M- ），它可以容忍外源 DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些
特殊方法（如电击法， CaCl2 ，RbCl(KCl) 等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生
⑷、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。
人人都爱 protocol 。。。。 蛋白的纯化 1. 菌液离心 取出三角瓶 ,倒入离心管中 ,离心 (6000rpm,10min,4 ℃ ),离心之后 ,倒去上清 . 2. 细胞重悬 加上 2mL 的 lysis buffer 洗沉淀 ,重悬细胞 . lysis buffer 配方是 HEPES (2M,PH 7.0)200 μNla, cl (4M) 500 μ lD, TT 3 μ l,Brij 100 μ l, PMSF 200 μ l,H2O 19ml,共 20ml 体系 . 3. 初步溶解 加入溶菌酶 20μｌ（ 100mg/ml ）于重悬液中 ,然后冰浴 20min. 再用 1.5ml EP 管分装 . 4. 冷冻
实验材料
(1) 大肠杆菌 DH5α （R- ， M- ， Amp- ） 实验步骤
（一）受体菌的培养
(1) 从 LB 平板上挑取新活化的 E. coli DH5 下振荡培养过夜（ 12h 左右）。
α单菌落，接种于 3～ 5mL LB 液体培养基中， 37 ℃
(2) 将该菌种悬液以 1:100 的比例接种， 取 250 μＬ菌液转接到 25mL LB 液体培养基中， 37 ℃ 振荡培养 2～ 3h 至 OD600 ＝ 0.5 左右。
大肠杆菌感受态细胞的制备
标签：
tr..,Ca..,co.. 分类： 细胞技术 > 感受态细胞 来源：
实验管理实验概要
大肠杆菌感受态细胞的 CaCl2 法制备及质粒转化
实验原理 处于对数生长期的细菌经
CaCl2 处理后接受外源 DNA 的能力显著增加。细菌处于容易吸
收外源 DNA 的状态叫感受态。
在自然条件下， 很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，
OD600 控制。对
TG1 菌株， OD600 为 0 ． 5 时，细胞密度在 5×107 个 /ml 左右。（应注意 OD600 值与细
胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。
此外，受体
细胞一般应是限制 -修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并
且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。 ⑵、试剂的质量
（三）感受态细胞的分装与冻存
(1) 在 2mL 制备好的感受态细胞中加入 2mL30% 甘油（即 1:1 体积，甘油终浓度 15%）。
(2) 将此感受态细胞分装成每份 200 μ L (1.5mL dorf 管 )，液氮速冻，快速转入 -70 ℃冰箱保
存。（如果没有液氮，可以将分装的感受态细胞直接转入
分离蛋白质混合物的各种方法主要是根据蛋白质在溶液中的以下性质：
1）分子大小； 2）溶
解度； 3）电荷； 4）吸附性质； 5）对其它分子的生物学亲和力等进行分离 .
常见的分离提纯蛋白质的方法有： 1、盐析与有机溶剂沉淀 ：在蛋白质溶液中加入大量中性
盐 ,以破坏蛋白质的胶体性质 ,使蛋白质从溶液中沉淀析出 ,称为盐析 .常用的中性盐有：硫酸
再加上 1ml 的 Imidazole buffer （ AT buffer 9.8ml ,Imidazole 1M 0.2ml
）冲洗 ,洗去非特
异性蛋白。 ⑷ 再洗脱目的蛋白
用 300μｌ的 Elution buffer 冲洗 ,获得所需的特异性蛋白 . Elution buffer 配方： AT buffer
DTT 3 μ l, urea 8M 18ml. 其余 buffer 均用 urea buffer 来配置 .
9.SDS-PAGE 的鉴定 ⑴配胶 (根据此蛋白的大小（ 55KD ） ,配置 12% 的胶 )
下 层 胶 的 配 方 :Acr/Bis 4.44ml, 下 层 胶 缓 冲 液 PH8.8
3.75ml,TEMED7 μ l,10%APS75 μ l,ddH2O6.8ml. 上 层 胶 的 配 方 是 : Acr/Bis0.75ml, 上 层 胶 缓 冲 液 PH6.8 1.5ml,TEMED
4 μ l,10%APS37.5 ⑵配置样品
μ l,ddH2O3.75ml.
每管加样品 2μl,5 ×loading buffer 4 μ再l,加 ddH2O 补全 20μｌ体系 . 混合好 loading buffer
和样品后 ,在 100 ℃下煮约 5min, 然后置室温下冷却后上样。
样品 1 ：纯化上清；样品 2 ：纯化沉淀；
对照 1 ：未纯化上清；对照 2 ：未纯化沉淀；对照 3 ：标准甘油激酶 ⑶上样 添加样品 ,上样 20μl,同时加上 Marker,10 μl. ⑷电泳 加上足够的电泳缓冲液 (1 ×),要加在两板内外 ,一定要浸没过板 ,形成电流通路 .调好电压进行
7.5ml,Imidazole 1M 2.5ml.
8. 纯化细胞破碎液的沉淀 用 urea buffer 重悬细胞沉淀 , 在常温温育 1h, 再离心 (12500rpm 1h 4 ℃),收集上清 ,重复上
清纯化步骤 .urea buffer 的配方是 Tris- HCl 1M PH8.0 1000 μl,NaCl 4M 1000 μl, Brij 20 μl,
-HCl buffer(PH 8.0) 到上清中。（碱性有利于蛋白的获得）可以先放
-80.
7. 纯化上清 ⑴ 准备 Ni 柱
在试管中加上空柱 ,缓慢滴加 300μｌ的 Ni 柱于空柱中 ,待其完全沉淀（每 300μｌ树脂液中有
5%Ni-NTA agnose ）。再用 2ml 的 AT buffer 平衡柱子（大约 1h ）。 AT buffer 配方：