蛋白质结晶方法探究

蛋白质结晶方法探究

发表时间：2018-08-20T14:56:45.123Z 来源：《医药界》2018年1月下作者：高铨，解婧妍

[导读] 有机大分子蛋白质是生命物质基础，其基本组成单位是氨基酸，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。它与生命以及各种生命活动紧密联系，几乎参与了全部生理过程。蛋白质还是大多数食品的主要成分，是一类重要的产能营养素。（西北工业大学陕西西安 710072）

本文相关工作受到国家级大学生创新创业训练计划（新型CDM结晶板悬滴法对蛋白质结晶影响，资助号#201710699109）支持。【摘要】有机大分子蛋白质是生命物质基础，其基本组成单位是氨基酸，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。它与生命以及各种生命活动紧密联系，几乎参与了全部生理过程。蛋白质还是大多数食品的主要成分，是一类重要的产能营养素。蛋白质的复杂结构决定了其功能的复杂性，鉴于此，要研究蛋白质的具体功能及其应用的前提是解析出高分辨率的三维结构。

【关键词】蛋白质结晶 X射线衍射晶体质量

引言

目前，测定蛋白质空间结构的有效方法主要有X射线衍射技术、核磁共振技术及电镜技术。电镜法研究不染色的蛋白质分子结构明显的困难是样品对电子损伤的高敏感性和样品在真空中三维结构的改变。核磁共振技术解析蛋白质的结构虽不需结晶，可研究动力学，但因分子量的限制，且需要标记。因此，解析蛋白质的结构最有力的方法首推X射线衍射技术，它能精确确定生物大分子中各原子坐标，确定共价键键长、键角。

据PDB数据库的统计，超过88%的蛋白质是由X射线衍射技术得到的，所以充分利用这项技术对于开展后续研究十分重要。X射线衍射技术解析蛋白质结构需获得蛋白质晶体，而这种晶体不是普通的晶体，它必须具有足够大小和质量才能保证数据收集的准确性。因此，得到符合要求的晶体成为了整个衍射过程的关键，是最终决定结构解析成功与否的因素。获得可以用于X射线衍射的高质量蛋白质晶体也成为晶体学领域追求的目标。

蛋白质结晶过程是蛋白质分子在溶液中析出的过程。蛋白质分子首先在其过饱和溶液中形成晶核，之后由于溶液中蛋白质浓度降低，蛋白质结晶生长趋于平稳，具体表现是蛋白质不再形核，晶体逐渐长大。这个过程中要想获得高质量的蛋白质晶体一般需要考虑一些问题，如如何获得高纯度的蛋白质溶液，选择什么结晶方法能获得质量好的晶体。本文基于此，对现有结晶方法进行总结，并介绍一些在蛋白质结晶领域的新技术。

1 传统结晶方法

A. 批量结晶法

该方法是最古老也是最简单的方法，蛋白溶液和结晶试剂开始就在确定的浓度下混合，其中蛋白质溶液一定是处于过饱和状态[1]。混合溶液一般处于密封的体系下，溶液各种参数都不变化，形成的晶体也不溶解。这种方法也有一个比较明显的缺点，由于这种方法需要大量且纯净的蛋白质晶体，但多数纯化得的蛋白质最终量都是非常少，所以，该方法未被大量使用，取代的是微量批量结晶法[2]，该方法只需非常少量的结晶液，结晶液滴混合后被分配到低密度的石蜡油和硅胶的混合物中。因液滴的密度要大，故整个过程都在石蜡油中进行，在这种混合物中的结晶效果等同于蒸汽扩散结晶，同时又可以防止溶剂挥发、空气污染和外界晃动，方便装置的移动，但溶液包含小分子有机物的实验不能用此方法，因为他们会溶解入油滴中。

B. 气相扩散法

气相扩散法主要是利用在蛋白质和沉淀剂混合的液滴中，沉淀剂的浓度低于晶体形核所需要的浓度，导致水分子不断从低浓度的液滴向高浓度的液池扩散，液滴中的蛋白质浓度逐渐增加并于沉淀剂结合，进而实现结晶。

气相扩散法的优点在于晶体生长的过程缓慢，蛋白有足够的时间在晶格中堆积，节省样品而且可有效利用储存空间。

C. 平衡透析法

平衡透析法需要用半透膜在装置里形成一个分隔面，在左右两边分别是蛋白质溶液和结晶试剂，因为两边存在浓度梯度，所以在结晶试剂里的小分子如离子、添加剂和缓冲剂就会通过半透膜进入到样品区，样品区的沉淀剂浓度逐渐增加。与此同时，由于蛋白质分子属于大分子，不能通过半透膜，由于结晶试剂里的小分子在样品区的浓度逐渐增加，蛋白质浓度就会逐渐下降，最终达到过饱和状态形核结晶。这种方法可以用于大规模的结晶实验，但要注意的是不是所有的结晶试剂都能应用此方法。

D. 液-液扩散法

又叫自由界面扩散法，这个方法是利用扩散作用而达到体系平衡并析出蛋白质晶体的过程。通常是将样品蛋白质溶液和结晶液在一个毛细管状的容器中，两者存在着浓度梯度，通过缓慢的扩散，整个系统自发的选择形核和晶体生长的过饱和状态。这种方法在确定了沉淀剂、pH和缓冲液后，可以作为筛选条件的微调实验。

2新技术的应用

一些生物结构科学家通过将传统方法和现在最新技术相结合，在传统的基础上提出了一系列有关于蛋白质结晶的新方法，提高了蛋白质结晶的质量。

由于蛋白质晶体生长是在晶核的基础上进行的，晶核的质量直接影响到蛋白质量。由于高质量的晶核是在较低的过饱和的状态下形成的，条件比较难控制。因此在2004年Ireton等学者利用低分辨率的晶体作为籽晶，导入到新结晶溶液中得到了适于衍射的高分辨率晶体[3]。D’ Arcy 等人在此基础上用导入籽晶的方法对牛胰岛素等5种蛋白结晶条件进行了筛选，发现导入籽晶可以有效的提升使蛋白质结晶筛选的成功率[4]。

共结晶技术近年来也成为提高蛋白质结晶质量的一种常用方法。有些晶体在与核苷酸、协同因子或是一些小分子可以稳定存在。Schartman等学者通过计算的方法证明共结晶技术可稳定晶体热力学性质，从而更易得到晶体[5]。实验证明这种方法尤其适用于配体溶解度很低或者蛋白质分子容易聚合的情况下，可以显著提高结晶成功率，尤其是一些膜蛋白只有与配体共结晶后才能得到晶体。

3展望

随着生命科学的逐渐发展，越来越多的新型蛋白质被发现，为了研究它们的功能，如何快速准确地解析它们的结构解析也变得越来重要。近年来结构生物学发展迅速并和其他学科相互渗透交叉,使得蛋白质晶体学从解析简单的蛋白质三维结构延伸到解决各类生物大分子及复合物结构, 因此就需要更加准确的结构模型。

虽然现今蛋白质结晶质量提高的方面已经做了很多的研究，但是如何获得高质量适合X射线衍射的蛋白质依然是急需解决的问题，尤其是发现一种较为普适的结晶方法更应该成为蛋白质结晶的研究方向。

本文相关工作受到国家级大学生创新创业训练计划（新型CDM结晶板悬滴法对蛋白质结晶影响，资助号#201710699109）支持。

通讯地址：陕西省西安市碑林区友谊西路127号西北工业大学友谊校区。

参考文献

[1] Chayen N. E. Comparative Studies of Protein Crystallization by Vapour-Diffusion and Microbatch Techniques[J]. Acta Crystallographica, 1998, 54(Pt 1): 8-15.

[2] Chayen N E, Stewart P D S, Blow D M. Microbatch crystallization under oil — a new technique allowing many small-volume crystallization trials[J]. Journal of Crystal Growth, 1992, 122(1–4): 176-180.

[3] Ireton G C, Stoddard B L. Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase[J]. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2004, 60 (3):601.

[4] D Arcy A, Villard F, Marsh M. An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization[J]. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2007, 63 (4):550.

[5] Schartman R R. On the thermodynamics of cocrystal formation[J]. Int J Pharm, 2009, 365 (1-2):77.