酵母实验-学生版

酵母系列大实验设计

PCR介导的酿酒酵母基因敲除

1、实验目的

学习理解酿酒酵母中PCR介导的基因一步敲除法的原理，掌握酵母的转化方法，了解酵母生长及遗传学特性。

2、实验原理

酵母菌作为最简单的真核生物，能以单倍体和二倍体两种形式稳定存在，其中单倍体含有两种交配型，可以自由的在单倍体和二倍体之间进行转换，在生物学研究中有着得天独厚的优势。

首先酵母菌生长速度很快。对数期生长的单倍体菌株在YPD（富营养天然培养基）90分钟分裂一代，在合成培养基中140分钟分裂一代。其次，酵母的基因组很小，遗传背景相对简单，是一种很容易进行遗传操作的模式生物。酿酒酵母的基因组只有12052 Kb,其基因组序列早在1996年测序完成,已有约6000个超过100个氨基酸的ORF被报道，只有不到5%的ORF含有内含子，其中有约5700个蛋白编码基因，分散在16条染色体上。上世纪90年代末，由数个实验室联合进行的酿酒酵母基因组敲除项目的完成是酵母遗传学研究的里程碑事件。在这个项目中，四个基因敲除菌株库被成功构建：两种交配型的单倍体菌株库、杂合子二倍体菌株库以及非必需基因的纯合子二倍体菌株库。这个项目几乎完成了全部ORF的敲除，为生物学研究，特别是组学研究，提供了十分强大的系统性研究工具，为后续基因功能的研究奠定了坚实的基础。此外，酵母作为真核生物，与高等生物在很多代谢通路和蛋白表达调节等方面是高度保守的，为高等生物相关基因，例如疾病基因，功能研究具有提供了简单、易于操作的系统。

目前，酿酒酵母已经具有一套十分灵活快速的遗传操作体系。酵母允许外源质粒以独立复制子游离于基因组之外存在，也允许其整合到基因组中。但跟其他生物相比，酵母比较独特且强大的特点是外源序列的整合依赖于同源重组机制。之前提到的基因组敲除项目的完成就是依赖于高效率的同源重组，如图-1所示。人们利用PCR的方法，在筛选标记基因两侧引入待敲除基因（YFG，your favorite gene）特异性序列；随后将PCR产物通过转化传递到酵母细胞内部；在同源

重组的作用下，一些细胞的对应基因位点的内源性序列被含有同源臂的外源序列直接取代，并通过选择培养基筛选出来。通过这个方法，我们可以对任意选定的染色体序列进行改变。

本实验即是基于以上原理对实验菌株中的ADE2或ADE4基因进行敲除。ADE2及ADE4均编码酿酒酵母嘌呤核苷酸从头合成途径中重要的酶类，如图-2所示，ADE4位于ADE2的上游，编码5-磷酸核糖-1-焦磷酸盐酰胺转移酶（PRPPAT ），催化该合成途径的第一步。ADE 2则编码磷酸核糖酰氨基咪唑羧化酶(AIR-carboxylase)，催化该合成途径的第六步。ADE2或ADE4基因的缺失突变会表现出腺嘌呤营养缺陷的表型，不能在缺乏腺嘌呤的培养基上生长。除此之外，ADE 2基因被突变失去功能时，还会有独特的表型变化——其底物AIR （代谢中产物）会在胞内积累聚合形成红色产物，使菌落颜色由野生型的白色变为红色。这种肉眼直观的颜色变化可以作为初步判定菌株基因型及筛选的依据，ADE2也因此成为系统性筛选中应用广泛的标记基因。而ADE4基因突变会从第一步阻断该通路，使细胞无法合成AIR 等中间产物，菌落颜色依旧为白色。

图-1 PCR 介导的基因敲除原理

1.实验用具及材料

ExTaq DNA 聚合酶、rTaq 、 10X PCR buffer 、dNTP 、25mM MgSO 4、无菌去离子水、PCR 仪、1M 醋酸锂、鲑鱼精DNA 、PEG3350、100XTE （pH8.0）缓冲液、二甲基亚砜（DMSO ）、20% TritonX100

培养基:YPD 、Sc-ura 、Sc-leu ，Sc-ade

酵母菌株BY4741：MAT a ,his3Δ1,leu2Δ0,met15Δ0,ura3Δ0 酵母菌株BY4742: MAT alpha ,his3Δ1,leu2Δ0,lys2Δ0,ura3Δ0 质粒：pRS415（CEN LEU2），pRS416（CEN URA3）

图-2 酿酒酵母嘌呤核苷酸从头合成途径

100℃ 金属浴、30℃培养箱、42℃水浴锅、30℃摇床、离心机

4.实验方法及步骤

1、 扩增基因敲除片段

1) 引物设计原理：基因特异性同源臂+统一载体序列

ADE2

Up : 5’- CAATCAAGAAAAACAAGAAAATCGGACAAAACAATCAAGT

AGATTGTACTGAGAGTGCAC -3’

Down :5’- ATAATTATTTGCTGTACAAGTATATCAATAAACTTATATA

CTGTGCGGTATTTCACACCG -3’

ADE4

Up : 5’- AAGTTTAGCAAAGAAAGAGGTACAGCAAACAGCAGAATAG

AGATTGTACTGAGAGTGCAC-3’

Down :5’- AACTATTTTACATACAACTGAACAAGTTCGGAACAATCTA

CTGTGCGGTATTTCACACCG -3’

图-3 基因敲除引物设计示意图

斜体部分表示基因特异性同源臂

2) PCR反应体系

10X PCR buffer 5μl

dNTP 5μl

Up 引物(10μM) 1μl

Down 引物(10μM) 1μl

Extaq 0.5μl

模板（pRS415/ pRS416） 0.5μl

无菌去离子水 37μl

总体积 50μl

3)PCR程序设置

94℃预变性 2 min;

94℃变性 20s,

55℃退火 30s,

72℃延伸 1min 30s / 2min 30s,

重复10个循环;

94℃变性 20s,

65℃退火 30s,

72℃延伸 1min30s / 2min 30s ,

重复20个循环;

72℃保温 7 min;

4℃保存。

4)PCR产物电泳

采用浓度为1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

ade2::URA3 约1230 bp

ade4::LEU2 约2355 bp

2、酵母菌转化