相对荧光定量PCR的常用方法和注意事项

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定量pcr的方法

定量pcr的方法定量聚合酶链反应（Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR）是一种在实验室中常用的分子生物学技术，旨在定量测定DNA或RNA分子的相对丰度。

本文将详细介绍定量PCR的原理、操作步骤以及应用领域。

一、定量PCR的原理定量PCR的原理基于聚合酶链反应（PCR）技术，该技术通过复制模板DNA 或RNA分子的特定片段来实现特异性扩增，从而产生大量复制产物。

在定量PCR 中，引入一种特定的荧光探针，该荧光探针与扩增产物结合，并在每个扩增周期的末端释放荧光信号。

荧光信号的数量与初始模板分子量成正比，因此可以通过测量荧光信号的强度来定量PCR产物中的特定DNA或RNA分子序列的相对丰度。

二、定量PCR的操作步骤1. 制备PCR反应体系：将反应缓冲液、模板DNA或RNA、引物、荧光探针、聚合酶、核苷酸和水混合制备反应体系。

反应体系中的核苷酸是用来提供DNA 或RNA的基本成分。

2. 热循环条件设置：选择合适的PCR仪，并设置合适的热循环条件。

热循环的三个步骤包括变性、退火和扩增。

3. 变性步骤：将反应体系加热至高温，通常为94-98，使DNA或RNA解性，即DNA双链分离，RNA变性为单链，使模板分子可供扩增。

4. 退火步骤：降低温度到引物特异性结合的温度，引物会与模板分子特异性结合，这通常在50-65之间进行。

5. 扩增步骤：将退火的反应体系加热至合适的温度，通常为72，此时聚合酶开始合成新的DNA链，延伸引物。

该步骤重复多次，每次扩增会产生两倍数量的DNA或RNA分子。

6. 荧光检测：在PCR反应进行过程中，荧光探针会与扩增产物结合，并在每个扩增周期的末端释放荧光信号。

荧光信号的强度与扩增产品的数量成正比。

7. 数据分析：使用特定的软件来分析荧光信号数据，将其转化为反应物的初始模板浓度。

可以通过比较不同样本的荧光信号强度来定量比较DNA或RNA的相对丰度。

定量PCR的实验流程及注意事项

qPCR实验设计需要考虑的问题
● 绝对定量与相对定量 ● 使用SYBR或是Taqman探针 ● 对照组的设置 ● 标准品的选择 ● 看家基因的选择 ● 引物与探针的设计 ● 扩增子的设计 ● 实验循环条件的设计
扩增子设计
● 扩增子长度：75-200bp ● 避免二级结构 ● 利用mFold 分析二级结构
借助熔解曲线分析结果
10,000 copies of input nucleic acid
80 copies
Amplicon
Nonspecific product
qPCR实验设计需要考虑的问题
● 绝对定量与相对定量 ● 使用SYBR或是Taqman探针 ● 对照组的设置 ● 标准品的选择 ● 看家基因的选择 ● 引物与探针的设计 ● 扩增子的设计 ● 实验循环条件的设计
好的引物及扩增子设计
● 提高扩增反应的效率 ● 提高反应的特异性、减少非特异性扩增 ● 提高产量和灵敏度 ● 减少多重PCR的交叉影响
准确、可重复的结果
引物设计
● 避免二级结构 ● GC含量控制在50-60% ● 连续的G或C不超过3个碱基 ● 5’末端不含G
通过引物设计提高特异性
● BLAST ● 使用SYBR Green方法时考虑到以后采用探针法 ● 进行多重PCR的可能 ● 测试多个引物对 ● 选择无引物二聚体且扩增效率最高的引物对
未知样品标准品梯度阳性对照阴性对照基因组对照
● 校准生物学误差：看家基因 ● 降低其余误差：样品重复实验
重复
● 定量PCR中样本（包括对照及标准品）一般需要3个重复 ● 一般重复间允许的差异≤0.5Ct（理想的状态≤0.25Ct） ● 理想的重复:
¾ 准备反应体系master mix, 包括样本 ¾ 使用热启动taq酶，避免非特异产物的扩增 ¾ 分装mix时使用一个枪头 ¾ 充分旋涡震荡5秒以上

1、试述荧光定量pcr技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用

1、试述荧光定量pcr技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用
荧光定量PCR是一种在PCR反应过程中，通过荧光信号的检测来对PCR产物进行实时定量分析的技术。

1. 原理：
荧光定量PCR利用荧光染料或者荧光探针，标记扩增过程中的每一个循环的产物，这些荧光标记的产物在激发光的作用下会发出荧光。

随着反应的进行，PCR产物不断累积，荧光信号也随之增强。

通过对荧光信号的实时监测，可以推断出样本中起始模板的数量。

2. 方法：
主要方法包括探针法、SYBR Green I染料法和分子信标法等。

探针法使用与目标序列特异性结合的荧光探针来标记PCR产物。

SYBR Green I染料法则是利用染料与双链DNA的结合特性，将染料添加到反应体系中，随着PCR产物的增加，染料的荧光信号也增强。

3. 注意事项：
荧光定量PCR对样品纯度要求较高，应避免杂质的干扰。

反应体系中的成分和浓度需要精确控制，以确保实验结果的准确性。

荧光定量PCR的结果解读需要参考标准曲线，以确定未知样本中的目标序列数量。

4. 在临床与科研中的应用：
在临床应用中，荧光定量PCR被广泛用于病原体检测、基因突变分析、遗传病诊断以及癌症研究等。

例如，用于检测病毒如HIV、HBV等的载量，或者检测癌症相关基因的表达水平。

在科研领域，荧光定量PCR可用于基因表达分析、基因组学和表观遗传学研究中。

例如，比较不同组织或细胞类型的基因表达差异，或者研究表观遗传修饰对基因表达的影响。

总的来说，荧光定量PCR技术是一种高灵敏度、高特异性的核酸定量分析方法，对于临床诊断和科学研究具有重要意义。

7500荧光定量PCR仪使用说明(相对定量)

?实验数据用格式化u盘拷取数据可暂存于本机电脑硬盘中各实验室d盘中有指定文件夹中心外部人员数据存于fuwu文件夹下的子文件夹中
7500荧光定量PCR仪使用说明
注意事项：
实验过程必须戴干净的一次性乳胶手套进行操作。
PCR反应所用的96孔板、8联管或单管必须适合ABI7500专用，禁止使用凸盖PCR管。
（以下过程按字母顺序a→q进行操作）
创建反应板文件
双击电脑桌面上SDS软件图标打开SDS软件；
在对话框中选择Create New Document…，或选择菜单栏File > New；
为每个反应孔指定探针和任务
为反应孔设置样品名
使用8联管两侧需用空管支撑，使用单管四角需用空管支撑，以防止板槽受力不均。
实验数据用格式化U盘拷ຫໍສະໝຸດ ，数据可暂存于本机电脑硬盘中，各实验室D盘中有指定文件夹，中心外部人员数据存于“FUWU”文件夹下的子文件夹中。
操作步骤
开机
依次打开电脑显示屏、主机，输入开机密码“7500”。
放入反应板
注：关闭仪器托盘时，应按一个角度推压托盘的右侧。

荧光PCR定量质量控制及防污染措施

荧光PCR定量质量控制及防污染措施解放军第三0⼆医院王海滨写在课前的话近⼏年在临床检测病毒核酸和细菌核酸上，荧光定量PCR技术越来越⼴泛。

但是如何进⾏治疗控制以及出现污染后怎样进⾏清除污染？本⽂主要讲述怎样来防⽌污染的产⽣。

⼀、荧光PCR定量的概述（⼀）荧光PCR定量的原理实时荧光定量 PCR 技术，是指在 PCR 反应体系中加⼊荧光基团，利⽤荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进⾏定量分析的⽅法。

常规的PCR也就是电泳PCR，它是合成⼀个正向引物和反向引物为⽬的模板，即DNA或RNA作为⼀个模板扩增，扩增后通过跑电泳的⽅式来检测它存在与否，是相对量的变化。

由于跑电泳经常导致产物外泄，因此污染的⼏率⽐较⾼。

近⼏年 PCR 扩增时在参⼊⼀对引物的同时参⼊单个特异性的荧光探针，该探针为⼀寡核苷酸，两端分别标记单个报告荧光基团和单个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时， Taq 酶的5'端～3'端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从⽽荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增⼀条 DNA 链，就有单个荧光分⼦构成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物构成完全同步。

通过荧光物质参⼊和TapMan探针技术来做实时荧光PCR,避免了电泳检测结果的过程,使整个PCR过程从扩增到检测都在⼀个封闭的状态。

荧光集团⽬前临床常⽤的有两个，⼀个是SYBR green，⼀个是TapMan探针。

SYBR green是⼀类荧光染料，能与所有的 DNA 双链相结合，对 DNA 模板没有选择性，所以特异性不如 TaqMan 探针。

变性后双螺旋变成单链，然后作为扩增的模板。

在扩增的过程中由变性到负性扩出了另⼀条链和模板DNA进⾏退⽕变成双链。

这时SYBR green染料与 DNA 双链结合,发出荧光信号。

⽤SYBR green荧光染料来作为指⽰剂时，中间要加⼀个溶解曲线来证实它的特异性的问题。

荧光定量PCR应用指南

荧光定量PCR应用指南荧光定量PCR（Fluorescent quantitative PCR）是依靠荧光信号的强度来定量PCR产物的一种PCR技术。

该技术通过在PCR反应体系中添加特异性荧光探针，利用荧光信号的强度来反映PCR产物的数量。

荧光定量PCR在生物医学研究、基因表达分析、致病微生物检测等领域有着广泛的应用。

下面将介绍荧光定量PCR的原理、实验步骤和一些注意事项。

一、原理：荧光定量PCR最常用的荧光探针是TaqMan探针，TaqMan探针是由两个DNA引物和一个荧光标记的探针组成。

当PCR反应进行到延伸阶段时，引物和探针结合到靶序列上形成荧光信号。

荧光信号的强度与PCR产物的数量成正比，通过检测荧光信号的强度可以定量PCR产物的数量。

二、实验步骤：1.设计引物和探针：选择特异性的引物和探针对目标序列进行扩增。

引物和探针的设计需要遵循一些原则，如避免引物和探针之间的自互补性、探针需选择合适的荧光染料等。

2.准备PCR反应体系：根据PCR反应需要，准备PCR反应体系。

一般包括模板DNA、引物、探针、聚合酶、缓冲液等。

3.荧光定量PCR反应：将PCR反应体系加入到荧光定量PCR仪中，进行PCR反应。

PCR反应的条件需要根据目标序列的特性进行优化，包括温度、延伸时间等。

4.数据分析：通过荧光定量PCR仪记录荧光信号的强度，根据荧光信号的强度可以反应PCR产物的数量。

通过数据分析软件对荧光信号进行定量计算，获得PCR产物的数量。

三、注意事项：1.引物和探针的设计需要严格控制，确保其特异性，避免与非靶序列结合。

2.PCR反应的条件需要进行优化，不同的目标序列可能需要不同的温度、延伸时间等。

3.控制实验中的阳性对照和阴性对照，确保实验结果的可靠性。

4.严格遵守无菌操作，避免PCR反应体系受到外源性污染。

5.选择合适的荧光定量PCR仪进行实验，确保获得准确的荧光信号强度数据。

6.实验过程中需严格按照操作规程进行，避免操作失误对实验结果产生影响。

荧光定量PCR技术的使用教程

荧光定量PCR技术的使用教程PCR（聚合酶链式反应）技术是分子生物学中常用的实验手段之一，它可以扩增起始序列的DNA片段。

荧光定量PCR技术是PCR技术的一种改进方法，它结合了PCR扩增和荧光检测技术，可以对扩增产物进行精确的定量分析。

本文将详细介绍荧光定量PCR技术的使用步骤和相关注意事项。

第一步：准备实验材料与试剂在进行荧光定量PCR实验前，首先需要准备好以下实验材料和试剂：1. DNA模板：可以是DNA提取物、血浆、组织样本等。

2. 引物（Primer）：引物对应于目标序列的两端，用于扩增DNA片段。

应选择合适的引物，包括正向引物和反向引物。

3. 标记荧光的探针（Probe）：探针可以是DNA分子、RNA分子或合成的寡核苷酸，用于检测PCR扩增产物。

4. dNTPs混合液：包含dATP、dCTP、dGTP和dUTP。

5. 磷酸缓冲液：用于维持PCR反应的酸碱平衡。

6. DNA聚合酶：用于酶切和DNA复制。

7. MgCl2：用于在PCR反应体系中提供镁离子。

8. 蒸馏水：用于稀释试剂和制备反应体系。

第二步：制备PCR反应体系1. 在无菌试管中依次加入如下试剂，制备PCR反应体系：- 1 μL DNA模板- 1 μL 正向引物- 1 μL 反向引物- 0.5 μL 荧光探针- 10 μL 2× PCR反应缓冲液- 0.5 μL 10 mM dNTPs混合液- 0.2 μL DNA聚合酶- 1 μL 25 mM MgCl2- 35.8 μL 蒸馏水注意：根据实验需求和试剂浓度的不同，反应体系中有时需要调整试剂的用量。

2. 轻轻混匀试管中的液体，避免形成气泡。

第三步：进行PCR扩增反应1. 将PCR反应体系分装至PCR管或96孔板中。

2. 将PCR管或96孔板放入PCR仪中，并设置合适的PCR程序。

- 初始变性：95°C，5分钟- 循环变性：95°C，30秒- 退火温度：根据引物的Tm值进行调整，通常为50-65°C，持续30秒- 延伸：72°C，持续1分钟- 终止延伸：72°C，10分钟3. 根据需要，可以设置PCR程序的循环次数。

pcr相对定量原理

pcr相对定量原理
PCR相对定量是一种常用的实验方法，用于测量目标基因在样品中的相对表达水平。

该方法基于聚合酶链反应（PCR）的原理，通过共扩增目标基因和内参基因，利用其在不同样品中的扩增产物浓度比值来间接推断目标基因的表达水平。

PCR相对定量的步骤通常包括以下几个关键步骤：首先，需要设计合适的引物，这些引物需要特异性地扩增目标基因和内参基因。

接下来，在PCR反应中，需要将反转录的RNA转换为cDNA，并与引物和适当的PCR反应缓冲液一起添加到PCR管中。

然后，在一系列PCR循环中，通过不断的变性、退火和延伸步骤，使DNA序列得以扩增。

最后，通过凝胶电泳、荧光测量等方法，可以测量PCR扩增产物的浓度，并计算出目标基因与内参基因之间的相对表达水平。

PCR相对定量的关键在于选择一个合适的内参基因。

内参基因通常是在不同样品中表达稳定且不受待测条件影响的基因。

通过将目标基因的表达水平与内参基因的表达水平相对比，可以消除样品间的差异，提高实验结果的可靠性。

需要注意的是，PCR相对定量的结果仅能提供一种相对的表达量信息，并不能给出精确的绝对表达水平。

因此，在进行PCR相对定量实验时，需要进行适当的内部对照组设计和统计分析，以确保实验结果的准确性和可靠性。

荧光定量PCR的原理方法及结果分析

荧光定量PCR的原理方法及结果分析荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种常用的检测DNA或RNA含量的方法，通过测定荧光信号的强度来确定起始模板数量的多少。

其原理主要包括引物的选择、PCR反应的进行、荧光信号的测定以及数据分析等步骤。

首先，荧光定量PCR需要选择适当的引物。

引物的设计要求首先能够特异性地与目标序列结合，这样才能保证只有起始模板被扩增。

引物的长度通常在18-24个碱基对之间，GC含量在40-60%之间，碱基序列中不能存在太多的重复序列或者分子倒序等结构。

此外，引物的Tm值应该相近，不应过于接近，以免引物发生二次结合。

另外，荧光标记的引物通常采用双探针（dual-labeled probe）和SYBR Green I染料，二者的优缺点各有不同：双探针对应用的目标突变不敏感，但是对于长序列的目标扩增效果较好；SYBR Green I适用于鉴定多个不同基因的扩增，但是对于PCR产物的目标特异性检测较差。

其次，PCR反应的进行是荧光定量PCR的核心步骤。

反应体系通常包括引物、模板DNA、DNA聚合酶、荧光标记剂和反应缓冲液。

PCR反应过程中，首先是变性，将模板DNA的双链分离；然后是退火，使引物与目标序列结合；接着是延伸，DNA聚合酶在适当的温度下进行链延伸。

PCR反应的循环数通常在25-40之间，具体循环数多少需要根据目标序列的长度和浓度来决定。

PCR反应条件的优化要注意引物浓度、PCR温度和时间。

第三，荧光信号的测定是荧光定量PCR中不可或缺的步骤。

通常，荧光信号的测定可以通过荧光实时扩增仪来进行。

在每一个PCR循环过程中，荧光实时扩增仪会记录下PCR反应管中荧光信号的强度。

随着PCR反应的进行，PCR产物的数量也在逐渐增加，荧光信号的强度也会增加。

荧光信号的强度与PCR产物的数量之间存在着一定的线性关系，利用标准曲线可以将荧光信号的强度转化为起始模板的绝对数量。

荧光定量PCR实验中的策略及注意事项

荧光定量PCR实验中的策略及注意事项前一段时间在百度中搜索，发现多年前写的一个关于荧光定量PCR技术的PPT有很多人看过或引用过，后来又听见一些认识的人也说，近来也就觉得自己对社会有点看得见的贡献了。

考虑到自己作为荧光定量PCR仪的技术支持人员已经工作了五年了，做的实验以及解决的问题远比五年前多了，因此利用过年的时间，写点荧光定量PCR实验中的一些注意事项及感想，无论对错，都是希望对相关的人员有些参考价值。

荧光定量PCR原理等大家都已经很熟了，我就不细说了，主要是写一些有人问过的事，希望写的内容是大家都关心的。

普通PCR与荧光定量PCR技术区别？简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段，用于克隆、测序等实验，后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量，而荧光定量PCR技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR片段含量的方式。

如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。

前些年有人讲过普通PCR后，通过电泳也可以进行定量，其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。

近两年没有人再讲这类的话了。

Sybr Green、Taqman、Molecular beacon、LUX这些方法如何选择？从实验成本来讲，Sybr Green是最好的，基本上就是普通PCR加上一点Sybr Green I 荧光染料即可，其信号强度也很好，还可以进行融解曲线分析等，但缺点是只能在一个反应管内进行一种PCR反应的检测，另一个问题是非特异性扩增会影响实验结果，当然也有一些技术解决这些问题，后面会讲到。

对于研究人员来讲，如果需要检测的基因很多，而每个反应管中进行一种PCR反应的检测可以满足实验要求，则Sybr Green是最好的选择。

如果需要进行多通道实验，即在一个反应管中进行2种或以上的反应，则要选择其他的方法，最常用的是Taqman、Molecular beacon，这两种都是探针的方式，由于增加了探针的特异性，因此其扩增曲线反映的就是特异性产物的扩增曲线，不含有非特异性扩增的成分。

相对荧光定量PCR三种常用方法、注意事项

相对荧光定量PCR三种常⽤⽅法、注意事项相对定量⽅法实际操作（三种常⽤⽅法）本⼈⽤的是相对荧光定量PCR法，在分⼦⽔平上⽐较课题中5种新基因的表达差异。

实验进⾏很多次，感受颇深，同时遇到了⼀些问题：扩增效率、标准品选择（及赋值）、标准曲线、重复性等问题，希望有同⾏朋友⼀起探讨和指教。

1. Comparative Delta-delta Ct法定量流程（RG6000软件设置）1).先对样品中的⽬的基因与看家基因分别做标准曲线，通过标准曲线确定两个基因的扩增效率是否⼀致或接近；将扩增效率优化为⼀致。

2).同⼀样品分别进⾏看家基因和⽬的基因的扩增，分列在两页中公式：P1 P2相同的样品在两页⾥命名成相同的名称，并定义为unknown分别分析P1和P2页选delta-delta Ct选项依次填⼊，并定义对照样品完成分析F=2—待检样品看对照组⽬的基因平均Ct对照组看家—待检样品⽬——Comparative Delta-delta Ct法的特点、注意事项及实际应⽤1). Comparative Delta-delta Ct法是很常⽤的⼀种相对定量⽅法，其最⼤特点是，当优化的体系已经建⽴后，在每次实验中⽆需再对看家基因和⽬的基因做标准曲线，⽽只需对待测样品分别进⾏PCR扩增即可。

2). 其缺点是，每次实验都默认⽬的基因和看家基因的扩增效率⼀致，⽽并⾮真实扩增情况的反映，这⾥势必存在⼀定的误差。

3). Comparative Delta-delta Ct法展开定量实验前，在预实验中，必需对⽬的基因和看家基因做两组标准曲线。

Rotor-Gene 的软件会⾃动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差⼩于0.1，那么后续实验中就可以⽤Comparative Delta-delta Ct法进⾏相对定量分析。

反之，如果M差值⼤于0.1，就⽆法⽤该⽅法进⾏相对定量分析。

此时的解决⽅法有两种，⼀是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值⼩于0.1，⼆是换⽤其它的相对定量⽅法。

荧光定量PCR技术的使用中常见问题

荧光定量PCR技术的使用中常见问题引言：荧光定量PCR技术作为一种高效、灵敏和准确的基因定量方法，广泛应用于分子生物学、医学诊断、环境监测等领域。

然而，在使用荧光定量PCR技术的过程中，常常会遇到一些问题和挑战。

本文将就荧光定量PCR技术的使用中常见问题进行探讨和解答，旨在帮助读者更好地应对和解决实验中的困惑。

一、引物设计问题1. 引物设计原则荧光定量PCR实验的关键是引物的设计。

引物应具备特异性、高度选择性以及适当的配对特性，以确保PCR反应的准确性和灵敏度。

引物设计建议遵循以下原则：- 引物长度：一般选择长度在18-30个碱基对之间。

- 碱基组成：应尽量避免引物末端含有连续的鸟嘌呤（G）或鸟嘧啶（C）。

- 碱基序列：引物两端应该尽量避免含有重复的碱基序列，以防止不特异扩增。

- 温度计算：引物的Tm（解离温度）应该在50-60摄氏度之间，同时引物间的Tm差异应不大于5摄氏度。

2. 引物设计工具引物设计可以利用一些在线引物设计工具，如Primer3、NCBI Primer-BLAST 等。

这些工具能够根据用户提供的序列信息，自动生成符合上述引物设计原则的引物。

二、荧光探针选择和优化1. 探针选择荧光定量PCR常用的探针有TaqMan探针、Molecular beacon探针等。

选择合适的探针取决于实验需要和目标基因的特点。

TaqMan探针适用于高度特异性检测，而Molecular beacon探针则适用于检测低浓度的目标序列。

2. 探针的优化为了提高PCR反应的灵敏度和特异性，有时需要对探针进行优化。

以下是一些优化探针的建议：- 探针浓度优化：需根据实验条件和目标基因的特性进行探针浓度的优化。

- 探针长度：一般探针的长度限制在15-30个碱基对之间。

三、荧光定量PCR反应体系问题1. 反应体系的组成荧光定量PCR反应体系基本组成包括：模板DNA、引物、荧光探针、聚合酶、缓冲液和核苷酸等。

其中，重要的是要根据实验需要和试剂盒的要求确定各组分的浓度。

荧光定量PCR注意事项

荧光定量PCR注意事项
A、在操作中，应使用不含荧光物质的一次性手套（经常替换）、一次性移液器吸头（带滤嘴自卸式），并不能用手直接触摸毛细管、离心管的底部。

B、在试剂准备和标本处理时应使用超净工作台(负压式)或防污染罩，以防止对环境的污染。

C、操作台、移液器、离心机、PCR扩增仪等仪器设备应经常用10%次氯酸或75%乙醇擦拭消毒。

每次实验前后用10%次氯酸和70%乙醇擦拭移液器、操作台。

D、实验中涉及的有害有毒的标本及试剂应妥善放置，专人保管；废弃物应置专门容器中，妥善处理。

E、荧光探针应避光保存，加入反应液中后，应尽快配制好反应体系进行扩增。

F、配制反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有的液体都要缓慢加至管底，不要加至管壁，所有液体的混匀要用振荡器进行，不能用移液器吹打，反应体系配制完毕后低速离心数秒，避免产生气泡。

G、配制反应体系过程中若需标记，请在试管架或离心机管架上标记，不要直接标记在离心管上。

荧光定量pcr仪使用注意事项

荧光定量pcr仪使用注意事项一、实验前的准备工作1. 样品准备：确保样品的质量和纯度，避免有杂质或受到污染。

同时，根据实验需要适当稀释样品，以避免过高的浓度对荧光定量PCR反应的影响。

2. 引物设计：合理设计引物序列，确保引物的特异性和互补性，避免引物间的二聚体或非特异性扩增。

3. 反应体系的准备：根据实验需要准备好反应体系，包括引物、模板DNA、荧光标记的探针和PCR反应缓冲液等。

4. 试剂储存：保持试剂的干燥和防止受到光照。

一些试剂需要在低温下储存，如荧光标记的探针和酶。

二、操作过程中的注意事项1. 操作环境：在PCR实验室内进行操作，确保无尘、无菌、无DNase的环境。

避免空气中存在的DNA污染样品。

2. 试剂配制：根据实验要求准确配制试剂，避免试剂过量或不足对实验结果造成影响。

3. 反应体系的设置：根据实验需要合理设置反应体系，包括反应体积、荧光标记的探针的浓度和引物的浓度等。

4. 荧光定量PCR仪的设置：根据实验需要设置PCR仪的温度、时间和周期数等参数。

确保PCR过程中的温度和时间的准确性和稳定性。

5. 试管或板的选择：根据实验需要选择合适的试管或板，确保样品和试剂能够均匀混合和扩增。

6. 试管或板的密封：在PCR反应过程中，确保试管或板的密封性良好，避免反应液的蒸发和外界污染的影响。

三、仪器的维护保养1. 清洁仪器：定期清洁PCR仪的工作台面、加热盖和仪器外壳，避免灰尘或油污对实验结果的影响。

2. 更换滤芯：定期更换PCR仪的滤芯，避免污染源对仪器和实验结果的影响。

3. 定期校准：定期校准PCR仪的温度和时间等参数，确保仪器的准确性和稳定性。

4. 仪器的存放：在不使用PCR仪时，将仪器存放在干燥、无尘和适宜的温度环境中，避免受潮或过热对仪器的影响。

5. 仪器的保养：定期对PCR仪进行保养，包括清洁、更换耗材和维修等，确保仪器的正常运行。

总结：使用荧光定量PCR仪需要在实验前做好准备工作，包括样品准备、引物设计、反应体系的准备和试剂储存等。

荧光定量PCR注意点

荧光定量PCR注意点
1. 按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。

开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件，进行实验。

关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。

2. 应该定期备份您的实验数据，备份频率推荐每周一次，用光盘刻录。

同时您也应该备份定量PCR仪的各种纯荧光光谱校正文件、背景文件和安装验证实验数据，这些文件所在的目录是C：/Appliedbiosystems/SDS Document。

3. 良好的实验室环境有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。

推荐做到以下几个方面：
电源：推荐配备合适的UPS或稳压器。

通风：仪器的通风应该没有阻挡。

温度：推荐实验室配备空调，温度应该控制在10-30°C之间。

湿度：20-80%；对于潮湿的省份，推荐实验室配备除湿机。

空间：易于操作，安全。

4. 怎样判断定量PCR仪的样本加热块是否被污染？怎样清除污染
一个办法是运行背景校正反应板，当一个或多个反应孔连续显示出不正常的高信号，则表明该孔可能被荧光污染物。

另外一种办法是在不放任何物品到样本块上的前提下，执行ROI的校正，当某个孔的信号明显高出其他孔时，则表明该孔被污染。

清除样本加热块污染的步骤如下：用移液器吸取少量乙醇并滴入每个污染的反应孔中。

吹打数次。

将废液吸入废液杯中。

重复以上步骤：乙醇三次，去离子水三次。

确认反应孔中的残留液体蒸发完。

荧光定量PCR实验及数据分析

荧光定量PCR实验及数据分析一、概述荧光定量PCR（Quantitative Realtime PCR，简称qPCR）是一种结合了PCR技术的高灵敏度和荧光探针技术的实时定量特性的分子生物学分析方法。

该方法通过实时监测PCR反应过程中荧光信号的变化，对模板DNA或RNA的初始浓度进行定量分析。

荧光定量PCR技术在基因表达研究、病原体检测、基因突变分析以及药物疗效评估等领域具有广泛的应用价值。

在荧光定量PCR实验中，通常使用特异性引物和荧光探针来识别并扩增目标序列。

荧光探针的设计是关键步骤之一，它必须能够与目标序列特异性结合并在PCR过程中产生可检测的荧光信号。

实验过程中还需严格控制反应条件，包括温度、时间、引物和探针的浓度等，以确保实验的准确性和可重复性。

数据分析是荧光定量PCR实验不可或缺的一部分。

通过对实验数据的收集、整理和分析，可以获取目标序列的初始浓度信息，进而对实验结果进行解读和评估。

数据分析方法包括相对定量和绝对定量两种，前者通过比较不同样本间目标序列的相对表达量来评估差异，后者则通过标准曲线法或质粒拷贝数法等方法来确定目标序列的绝对浓度。

荧光定量PCR技术是一种高效、灵敏且特异的分子生物学分析方法，对于研究基因表达、病原体检测等领域具有重要意义。

通过不断优化实验操作和数据分析方法，可以进一步提高荧光定量PCR实验的准确性和可靠性，为科学研究和临床实践提供有力支持。

1. 荧光定量PCR技术的概述荧光定量PCR技术，是一种基于DNA聚合酶链式反应的分子生物学技术，它通过引入荧光标记，实时监测PCR过程中目标DNA片段的扩增情况，从而实现对特定基因拷贝数的精确量化。

该技术结合了PCR的高效扩增能力与荧光信号的灵敏检测，使得微量DNA分子的检测成为可能，并在遗传学、分子生物学、医学诊断等领域中发挥着重要作用。

荧光定量PCR技术主要依赖于特异性引物和探针的设计，使得PCR扩增过程具有高度的特异性。

荧光定量PCR实验使用方法

第一部分一、基本步骤：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；2、引物、探针的设计；3、引物探针的合成；4、反应体系的配制；5、反应条件的设定；6、反应体系和条件的优化；7、荧光曲线和数据分析；8、标准品的制备；二、技术关键：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；从/网点的genbank中下载所需要的序列。

下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。

保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。

然后，再打开DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“import”，打开后点击“save”，保存为“.seq”文件。

另一种直接用DNAstar 软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“open entrez sequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。

然后要对所有的序列进行排序。

用DNAstar软件中的Seqman软件，点击“sequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq”的所有文件，点击“add”或“add all”，然后点击“Done”导入要比较的序列，再点击“assemble”进行比较。

横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。

有时要设定比较序列的开始与结尾。

有时因为参数设置的原因，可能分为几组(contig)，若想全部放在一组中进行比较，就调整“project”菜单下的“parameter”，在“assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为80，可调低即可。

再选择几个组，点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。

选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下，尽量提高“minimum math percentage”的值。

荧光定量ＰＣＲ中的相对定量和绝对定量

荧光定量ＰＣＲ中的相对定量和绝对定量绝对定量的⽬的是测定⽬的基因在样本中的分⼦数⽬，即通常所说的拷贝数。

相对定量的⽬的是测定⽬的基因在两个或多
个样本中的含量的相对⽐例，⽽不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。

举例来说，如果研究项⽬中包括处理过的和未经处理的对照样本，通常可以将未经处理的样本指定为基准，规定其⽬的基因浓度为100%，将经处理的样本的定量结果除以对照样品的定量结果，就可以计算各个处理样本的基因含量相对于未处理样品的百分⽐。

绝对定量实验必须使⽤已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。

相对定量可以做标准曲线，也可以不做标准曲线。

相对定量实验有两种⽅法：标准曲线法和C T值⽐较法。

如果使⽤标准曲线法，可以使⽤绝对标准品，也可以使⽤相对标准品，⽽且相对标准品在实验操作上更为简便易⾏。

相对标准品是只知道样品中DNA或RNA的稀释⽐例⽽不需要知道其分⼦数⽬的标准品，典型的做法是将⼀个已知pg数的样品做⼀系列梯度稀释。

C T值⽐较法是利⽤C T值与起始DNA浓度的对数成反⽐的数学关系，来计算不同样本之间的相对百分⽐，其计算公式是
绝对定量的数据易于理解，但是绝对标准品的制备和测定其DNA含量⽐较困难。

有许多商业性的标准品试剂盒供选购，可以解决这种困难。

相对定量的标准品容易在实验室⾥⾃⼰制备，但是数据处理⽐较⿇烦，对实验数据的解释有⼀定难度。

荧光定量 PCR 要点解析

荧光定量PCR要点解析一、荧光定量PCR 原理荧光定量PCR（Real-time PCR），是指在PCR 扩增反应体系中加入荧光基团，通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

以探针法荧光定量PCR 为例：PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

开始时，探针完整地结合在DNA 任意一条单链上，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号；PCR 扩增时，Taq 酶将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步。

传统的PCR 进行检测时，扩增反应后需要进行染色处理及电泳分离，并且只能作定性分析，不能准确定量，易造成污染出现假阳性，使其应用受到限制。

实时定量PCR 技术不仅实现了对模板的定量，且具有灵敏度高、特异性和可靠性更好、自动化程度高和无污染的特点，使得荧光定量PCR 逐渐取代常规PCR。

在PCR 扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即是基线，这条线是可以自动生成也可以手动设置的。

之后反应会进入指数增长期，这个期间扩增曲线具有高度重复性，在该期间，可设定一条荧光阈值线，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般会将荧光阈值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。

每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数被称为CT 值，这个值与起始浓度的对数成线性关系，且该值具有重现性。

Ct 值最大的意义就是用来计算目的基因的表达量，此时就有两个概念容易被提及，那就是绝对定量和相对定量，绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。

相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。