相对荧光定量PCR的常用方法和注意事项

相对定量方法实际操作

（常用方法）

1. Comparative Delta-delta Ct法定量流程（RG6000软件设置）

1).先对样品中的目的基因与看家基因分别做标准曲线，通过标准曲线确定两个

基因的扩增效率是否一致或接近；将扩增效率优化为一致。

2).同一样品分别进行看家基因和目的基因的扩增，分列在两页中

公式：

P1 P2

F=2—

待检样品看

家基因平均

Ct值

对照组目的

基因平均Ct

值

对照组看家

基因平均Ct

值

—

待检样品目

的基因平均

Ct值

——

Comparative Delta-delta Ct法的特点、注意事项及实际应用

1). Comparative Delta-delta Ct法是很常用的一种相对定量方法，其最大特点

是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。

2). 其缺点是，每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真

实扩增情况的反映，这里势必存在一定的误差。

3). Comparative Delta-delta Ct法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基

因和看家基因做两组标准曲线。Rotor-Gene 的软件会自动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于

0.1，那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量

分析。反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。

应用实例：

如上图，将标准品进行梯度稀释后，分别对目的基因（Gene of Interest）和看家基因（Housekeeper Gene）做标准曲线。软件自动绘制标准曲线，并给出相应的参数。从上图可知，两组标准曲线的M值分别为-3.525和-3.467，两者的

差值<0.1，因此，这组看家基因和目的基因可以用Comparative Delta-delta Ct 法两进行相对定量。

在完成上述预实验之后，接下来就可以正式对待测样品进行定量分析。

在该实验中，分别对待测样品的看家基因和目的基因进行扩增，下图即为一个标准的扩增分析结果：

为进行Comparative Delta-delta Ct分析，需要对样品进行一些编辑。简而言之，即将目的基因和看家基因分别编辑在两页中（page），并将同一样品命名成相同名称。

在该实验中，分别对三个样品A、B、C进行了分析，其中1-9号管检测了看家基因，10-18号管检测了目的基因。

可通过NEW 新建一个page ，并通过Selected 选择每页中分析的对像。将两组基因分别编辑在两页中，并将相同的样品命名成同一名称后，即为下图所示：

样品编辑好后就可进行分析工作。通过进入Analysis ，分别对page1和page2进行分析。注意：由于没有标准品，软件无法自动给出阈值，需用手动设定，软件会提示需手动进行阈值设定，此时只要点中右侧按扭，在荧光曲线图中上下拖

动光标即可。

完成两页分析之后，再进入Delta Delta CT 分析界面，选择show ，此时，软件的向导界面会提示使用者一步步完成设置：

Page 2：目的基因，其中10-18号管通过YES 选中，样品分别命名为A 、B 、C ，其它未选中的样品可以不进行编辑。

Page 1：看家基因，其中1-9号管通过YES 选中，样品分别命名为A 、B 、C ，其它未选中的样品可以不进行编辑。

由上至下，依次完成各项设置。

第一项：Validation Run Performed，提示是否已验证过两个基因的扩增效率一致，可用该定量方法进行分析。选择Yes；

第二项：Gene of Interest Quantitation，选中Page 1或Page 2中编辑了目的基因的那一页；

第三项：Normaliser Quantitation，选中Page 1或Page 2中编辑了看家基因的那一页；

第四项：Calibrator Defined，选中A、B、C三个样品中用来作为对照组的一个。完成上述四项设置之后，在窗口右侧就显示相对定量结果，如图所示：

结果给出三个样品目的基因和看家基因的平均CT值，以及样品B、C中目的基因的浓度相对于对照组A的比值。

2. 双标准曲线法定量流程（RG6000软件设置）

1). 用双标准曲线法定量时，每次每个基因都需要做目的基因和看家基因的标准

曲线，必需有一组稳定的标准品。

2). 同一样品做标准曲线，分别对目的基因和看家基因做标准曲线，分列在两页

上。

公式：

（基因的浓度由软件根据标准曲线直接给出）

P1 P2

分别分析P1和P2页

选Two Standard Curve 选项

依次填入，并定义对照样品

完成分析

待测样品看家基因浓度 对照组目的基因浓度 对照组看家基因浓度

F= 待测样品目的基因浓度

双标准曲线法的特点、注意事项及实际应用

1. 双标准曲线法做相对定量分析的最大特点是，应用简便，无需像Delta-delta

CT法那样对实验进行严格的优化。

2. 其不足之处是每次实验都必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。

3. 并且，如果用于做标准曲线的标准品不同于样品，比如标准品为质粒或纯化

的PCR产物，而待测样品为cDNA，那么标准曲线的扩增效率并不能真实地反映样品的扩增情况，因此以标准曲线来计算样品的实际浓度就存在一定误差。

应用实例：

在该实验中，样品管1-6为目的基因的标准曲线，7-12为看家基因的标准曲线，待测样品A、B、C，其中15-17扩增了样品的看家基因，18-20扩增了样品的目的基因。