耐高温酒精酵母的筛选

文章编号 1004 6410(2009)03 0026 04

耐高温酒精酵母的筛选

易 弋1a ,黎 娅1b ,容元平1a ,李 凯2

(1.广西工学院a.生物与化学工程系b.科技处,广西柳州 545006;

2.四川省中医药高等专科学校,四川绵阳 621000)

摘 要:从酒精厂废液、糖厂废糖蜜、土壤及淤泥等七种不同样品中,经富集、分离、纯化,筛选得到3株耐高温酵母菌T M 6、T M 10和T M 20.实验结果表明,3株菌都能在50 的高温下生长,但高温会明显影响酵母菌的发酵能力.30 下,T M 10的发酵酒精终浓度最高,达到了7.82%(v/v).而在40 下T M 20的发酵能力要高于T M 6和T M 10,且发酵酒精终浓度仅比30 时降低了约6%.关 键 词:耐高温;酒精发酵;酵母;筛选中图分类号:T S262.2 文献标识码:A

收稿日期:2009-06-05

基金项目:广西工学院博士基金项目(0818001),广西工学院科学基金项目(0840202)资助.作者简介:易弋(1979-),男,四川都江堰人,广西工学院生物与化学工程系副教授,博士.

0 引言

自20世纪70年代发生石油危机以来,能源短缺已成为我国乃至世界各国经济发展的主要障碍.发展可

再生资源以解决我国经济持续发展中的能源问题,已成为全社会的共识.燃料乙醇由于其可再生性,被认为是最有可能代替石油的液体燃料,市场潜力十分巨大.

目前工业化生产酒精的发酵温度一般在30~33 左右,在这种温度下发酵需要大量的冷却水.若能使发酵在高温下进行,不但可以减少冷却水的用量,节约生产成本,而且可以从根本上解决糖化与发酵不同步的问题,缩短发酵周期,提高发酵效率[1]

.同时高温发酵能有效的抑制杂菌生长,减少醪液受污染的机会.但过高的温度会引起酵母细胞内脂肪酸、磷脂等成分的变化,甚至会导致蛋白质变性,这样一来就会影响细胞正常的生理活动,表现出高温对酵母细胞的毒性[2].因此,对于耐高温酒精酵母菌的选育问题一直是酒精酵母研究者的重要研究方向之一.

针对这一问题,本文拟从自然界中分离出有较强温度耐受性的酵母菌,并初步研究其发酵及相关性能,为下一步的选育工作打下基础.

1 材料与方法

1.1 培养基

酵母培养基:葡萄糖50g,酵母膏8.5g,NH 4Cl 1.0g,MgSO 4 7H 2O 0.6g ,CaCl 20.6g ,加水溶解至1000mL,调pH =4.5,115 灭菌20m in.固体培养基在液体培养基的基础上添加1.5%的琼脂.

发酵培养基:葡萄糖150g ,酵母膏5g,蛋白胨5g,NH 4Cl 1.0g,M gSO 4 7H 2O 0.6g,CaCl 20.6g ,加水溶解至1000mL,调节pH= 4.5,115 灭菌20min.

T TC 上层培养基[3]

:葡萄糖0.5g,琼脂1.5g,加水至100mL,115 灭菌20min,待冷却至55 左右时,加入TTC(2,3,5!氯化三苯基四氮唑)0.05g.

第20卷 第3期 广西工学院学报 Vol 20 No 3

2009年9月 JO U RNAL OF G UA NG XI U N IV ERSIT Y OF T ECHN OL OGY Sep 2009

1.2 酵母菌分离和纯化

在以前的研究中,从柳州市7个不同地点(酒精厂废液,糖厂废糖蜜,果园土壤,农田土壤,湖水淤泥,2个白酒厂的发酵醪液)采集样品,经分离纯化得到了23株具有典型酵母菌特征的菌株,编号为TM1~23[4].

1.3 耐高温酒精酵母菌的筛选

将分离得到的23株酵母菌涂布于固体培养基上,于42 下培养.待长出菌落后,倒入一层TTC上层培养基,继续培养2~3h.结束后挑选7株长势好、红色较深的菌落备用.TTC可以和细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应,生成红色的甲月赞,由此可判断酵母细胞中呼吸酶活力的大小,即酵母产酒精能力的高低[5]. 将挑选出的酵母菌接种至液体培养基,分别于42 、44 、46 、48 、50 、52 下培养,根据其生长情况选出3株耐高温特性较强的菌株进行下一步实验.

1.4 部分发酵特性的测定

初始糖浓度对各菌株的影响:制备葡萄糖含量分别为20%、30%、40%、50%、55%、60%的液体培养基,接入筛选的酵母菌,28 摇床培养,通过测定OD560比较其生长情况,从而判断菌株对渗透压的耐受性.

pH值对各菌株的影响:制备pH2 0,pH2 5,pH3 0,pH3 5,pH4 0和pH4 5的液体培养基,接入筛选的酵母菌,培养及检测方法同上.

酒精对各菌株的影响:制备含不同酒精浓度分别为3%、5%、7%、9%、11%、13%(v/v)的液体培养基,接入筛选出的酵母菌,培养及检测方法同上.

1 5 酒精发酵能力的测定

于500mL的三角瓶中加入200mL发酵培养基,按10%的比例接入活化后的酵母菌种,分别于30 和40 下静置发酵,每4h测定一次CO2失重,CO2失重小于0 1g时认为发酵结束.发酵结束后测定发酵醪液酒精浓度、残糖和总酸,测定方法见参考文献[6].

2 实验结果

2 1 耐高温酵母菌的筛选

通过在42 下培养及T TC筛选,从23株酵母菌中选出了7株有一定高温耐受性,且酒精发酵能力较强的酵母菌,其编号及形态特征见表1.

表中所列7株菌均具有典型的酵母菌形态,而且经TT C筛选,7株菌都具有较好的酒精发酵性能.为了进一步比较这几株菌的耐高温特性,我们将7株菌分别置于不同高温下培养,实验结果见表2.

表1 耐高温酵母菌的初筛

菌株编号 菌落形态 菌体形态

T M1菌落大,圆形,边缘锯齿形,高凸起,不透明,表面粗糙,不闪光,乳白色圆形/椭圆,出芽生殖

T M6菌落大,圆形,边缘整齐,高凸起,不透明,表面光滑,闪光,灰白色圆形,出芽生殖

T M10菌落中等,圆形,边缘有齿,高凸起,较透明,表面光滑,闪光,灰白色圆形/椭圆,出芽生殖,芽成串T M15菌落大,圆形,边缘整齐,低凸起,不透明,表面光滑,闪光,乳白色圆形/椭圆,出芽生殖

T M16菌落大,圆形,边缘不齐,低凸起,较透明,表面光滑,闪光,乳白色椭圆,略长,出芽生殖

T M20菌落中等,圆形,边缘整齐,高凸起,不透明,表面光滑,闪光,乳白色椭圆,出芽生殖

T M22菌落大,圆形,边缘整齐,低凸起,不透明,表面光滑,闪光,灰白色椭圆,出芽生殖

表2 耐高温酵母菌的复筛

菌株

温度/

42444648 50 5254

T M1++++++++---T M6++++++++++++++++-T M10+++++++++++++++-T M15++++++++---T M16++++++++++---T M20+++++++++++++--T M22++++++++---- 注:∀+#表示酵母菌生长情况,∀+#越多,表示生长越好,下同.27

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