耐高温酒精酵母的筛选

文章编号 1004 6410(2009)03 0026 04耐高温酒精酵母的筛选易 弋1a ,黎 娅1b ,容元平1a ,李 凯2(1.广西工学院a.生物与化学工程系b.科技处,广西柳州 545006;2.四川省中医药高等专科学校,四川绵阳 621000)摘 要:从酒精厂废液、糖厂废糖蜜、土壤及淤泥等七种不同样品中,经富集、分离、纯化,筛选得到3株耐高温酵母菌T M 6、T M 10和T M 20.实验结果表明,3株菌都能在50 的高温下生长,但高温会明显影响酵母菌的发酵能力.30 下,T M 10的发酵酒精终浓度最高,达到了7.82%(v/v).而在40 下T M 20的发酵能力要高于T M 6和T M 10,且发酵酒精终浓度仅比30 时降低了约6%.关 键 词:耐高温;酒精发酵;酵母;筛选中图分类号:T S262.2 文献标识码:A收稿日期:2009-06-05基金项目:广西工学院博士基金项目(0818001),广西工学院科学基金项目(0840202)资助.作者简介:易弋(1979-),男,四川都江堰人,广西工学院生物与化学工程系副教授,博士.0 引言自20世纪70年代发生石油危机以来,能源短缺已成为我国乃至世界各国经济发展的主要障碍.发展可再生资源以解决我国经济持续发展中的能源问题,已成为全社会的共识.燃料乙醇由于其可再生性,被认为是最有可能代替石油的液体燃料,市场潜力十分巨大.目前工业化生产酒精的发酵温度一般在30~33 左右,在这种温度下发酵需要大量的冷却水.若能使发酵在高温下进行,不但可以减少冷却水的用量,节约生产成本,而且可以从根本上解决糖化与发酵不同步的问题,缩短发酵周期,提高发酵效率[1].同时高温发酵能有效的抑制杂菌生长,减少醪液受污染的机会.但过高的温度会引起酵母细胞内脂肪酸、磷脂等成分的变化,甚至会导致蛋白质变性,这样一来就会影响细胞正常的生理活动,表现出高温对酵母细胞的毒性[2].因此,对于耐高温酒精酵母菌的选育问题一直是酒精酵母研究者的重要研究方向之一.针对这一问题,本文拟从自然界中分离出有较强温度耐受性的酵母菌,并初步研究其发酵及相关性能,为下一步的选育工作打下基础.1 材料与方法1.1 培养基酵母培养基:葡萄糖50g,酵母膏8.5g,NH 4Cl 1.0g,MgSO 4 7H 2O 0.6g ,CaCl 20.6g ,加水溶解至1000mL,调pH =4.5,115 灭菌20m in.固体培养基在液体培养基的基础上添加1.5%的琼脂.发酵培养基:葡萄糖150g ,酵母膏5g,蛋白胨5g,NH 4Cl 1.0g,M gSO 4 7H 2O 0.6g,CaCl 20.6g ,加水溶解至1000mL,调节pH= 4.5,115 灭菌20min.T TC 上层培养基[3]:葡萄糖0.5g,琼脂1.5g,加水至100mL,115 灭菌20min,待冷却至55 左右时,加入TTC(2,3,5!氯化三苯基四氮唑)0.05g.第20卷 第3期 广西工学院学报 Vol 20 No 32009年9月 JO U RNAL OF G UA NG XI U N IV ERSIT Y OF T ECHN OL OGY Sep 20091.2 酵母菌分离和纯化在以前的研究中,从柳州市7个不同地点(酒精厂废液,糖厂废糖蜜,果园土壤,农田土壤,湖水淤泥,2个白酒厂的发酵醪液)采集样品,经分离纯化得到了23株具有典型酵母菌特征的菌株,编号为TM1~23[4].1.3 耐高温酒精酵母菌的筛选将分离得到的23株酵母菌涂布于固体培养基上,于42 下培养.待长出菌落后,倒入一层TTC上层培养基,继续培养2~3h.结束后挑选7株长势好、红色较深的菌落备用.TTC可以和细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应,生成红色的甲月赞,由此可判断酵母细胞中呼吸酶活力的大小,即酵母产酒精能力的高低[5]. 将挑选出的酵母菌接种至液体培养基,分别于42 、44 、46 、48 、50 、52 下培养,根据其生长情况选出3株耐高温特性较强的菌株进行下一步实验.1.4 部分发酵特性的测定初始糖浓度对各菌株的影响:制备葡萄糖含量分别为20%、30%、40%、50%、55%、60%的液体培养基,接入筛选的酵母菌,28 摇床培养,通过测定OD560比较其生长情况,从而判断菌株对渗透压的耐受性.pH值对各菌株的影响:制备pH2 0,pH2 5,pH3 0,pH3 5,pH4 0和pH4 5的液体培养基,接入筛选的酵母菌,培养及检测方法同上.酒精对各菌株的影响:制备含不同酒精浓度分别为3%、5%、7%、9%、11%、13%(v/v)的液体培养基,接入筛选出的酵母菌,培养及检测方法同上.1 5 酒精发酵能力的测定于500mL的三角瓶中加入200mL发酵培养基,按10%的比例接入活化后的酵母菌种,分别于30 和40 下静置发酵,每4h测定一次CO2失重,CO2失重小于0 1g时认为发酵结束.发酵结束后测定发酵醪液酒精浓度、残糖和总酸,测定方法见参考文献[6].2 实验结果2 1 耐高温酵母菌的筛选通过在42 下培养及T TC筛选,从23株酵母菌中选出了7株有一定高温耐受性,且酒精发酵能力较强的酵母菌,其编号及形态特征见表1.表中所列7株菌均具有典型的酵母菌形态,而且经TT C筛选,7株菌都具有较好的酒精发酵性能.为了进一步比较这几株菌的耐高温特性,我们将7株菌分别置于不同高温下培养,实验结果见表2.表1 耐高温酵母菌的初筛菌株编号 菌落形态 菌体形态T M1菌落大,圆形,边缘锯齿形,高凸起,不透明,表面粗糙,不闪光,乳白色圆形/椭圆,出芽生殖T M6菌落大,圆形,边缘整齐,高凸起,不透明,表面光滑,闪光,灰白色圆形,出芽生殖T M10菌落中等,圆形,边缘有齿,高凸起,较透明,表面光滑,闪光,灰白色圆形/椭圆,出芽生殖,芽成串T M15菌落大,圆形,边缘整齐,低凸起,不透明,表面光滑,闪光,乳白色圆形/椭圆,出芽生殖T M16菌落大,圆形,边缘不齐,低凸起,较透明,表面光滑,闪光,乳白色椭圆,略长,出芽生殖T M20菌落中等,圆形,边缘整齐,高凸起,不透明,表面光滑,闪光,乳白色椭圆,出芽生殖T M22菌落大,圆形,边缘整齐,低凸起,不透明,表面光滑,闪光,灰白色椭圆,出芽生殖表2 耐高温酵母菌的复筛菌株温度/42444648 50 5254T M1++++++++---T M6++++++++++++++++-T M10+++++++++++++++-T M15++++++++---T M16++++++++++---T M20+++++++++++++--T M22++++++++---- 注:∀+#表示酵母菌生长情况,∀+#越多,表示生长越好,下同.27第3期 易 弋等:耐高温酒精酵母的筛选酵母菌的正常生长温度在30 左右,当温度超过35 时,其生长和发酵能力大大减弱[7].目前所筛选的耐高温酒精酵母一般在38~40 还有较高的酒精产率,如沈睿等人[8]筛选的耐高温酵母菌YH4.该菌的最适生长温度为35~38 ,最高生长温度为47 .从图中可以看出7株菌都能在46 下生长,说明它们均有一定的高温耐受性.TM6、TM10和T M20的耐高温能力要明显强于其他4株,其中TM6、TM10的耐高温能力最强,能在52 下生长;T M20次之,能在50 下生长.因此,选择这3株菌进行了后续的实验.2 2 部分发酵特性的测定通过筛选,得到了3株具有较强耐高温特性酵母菌.鉴于酵母菌的渗透压耐受性能、耐酸能力以及酒精耐受性在实际生产中是至关重要的,我们测定了3株菌在这几方面的能力,结果见表3、表4和表5.表3 初始糖浓度对各菌株生长的影响菌株葡萄糖含量/%203040505560TM6++++++++++++-TM10+++++++++++--TM20+++++++++++--表4 pH对各菌株生长的影响菌株培养基初始pH值4 54 03 53 02 52 0 TM6+++++++++++--TM10+++++++++++++++-TM20++++++++++++++-2 2 1 初始糖浓度对各菌株影响培养基中的糖浓度对酵母菌生长的影响非常大,糖浓度较低会使酵母菌因营养不足而生长缓慢,糖浓度过高又会因渗透压的增大而抑制酵母菌的增殖.提高初始糖浓度可以提高发酵醪的酒精含量,因此生产用的酵母菌都需要有一定的渗透压的耐受能力.从表3中可以看出当初糖浓度达到40%时,3株菌的生长均受到了明显的抑制.糖浓度达到50%时,生长变得缓慢.相对而言T M6对糖渗透压的耐受性要略高于TM10和T M20,它能在55%的初始糖浓度下缓慢生长.2 2 2 培养基pH值对各菌株生长的影响在酵母菌酒精发酵的实际生产当中,发酵醪液的pH值非常重要,因为较低的pH值可以抑制杂菌的生长,从而提高发酵的效率.酵母菌正常的生长pH在4 5~5 5之间,而如今某些糖蜜酒精厂为了防止发酵过程中杂菌的污染,已将发酵醪液的pH调低至3 2~3 4,这就要求生产菌有非常好的耐酸特性.从表4中可以看出pH4 0以上,3株菌的生长情况都非常良好.当pH降至3 5时,TM6受到了较严重的抑制,它最低生长的pH为3 0.而TM10和TM20的耐酸能力略强于TM6,能在pH2 5的培养基上生长.2 23 酒精对各菌株生长的影响在发酵过程中,酵母自身产生的酒精达到一定浓度时,会对酵母本身产生毒性,影响其生长、细胞发育,以及酒精发酵的能力[9],进一步提高酒精浓度,酵母的发酵便会停止.因此,酵母菌的酒精耐受能力对于能否大幅度的提高酒精发酵终浓度至关重要,是评价酒精酵母菌种好坏的重要指标.从表5可以看出,酒精对酵母菌生长的影响是非常明显的.当酒精浓度提高到5%时,3株菌的生长都受到了明显的抑制.TM10和TM20的酒精耐受性略强于TM6,在含酒精9%的培养基中表现出了微弱的生长.2 3 酒精发酵能力的测定测定了三株菌的部分发酵特性后,按1 5所述的方法比较了各株菌的酒精发酵能力,实验结果如表6所示.表5 酒精对各菌株生长的影响菌株培养基酒精浓度/%,v/v 35791113TM6+++++++---TM10+++++++++--TM20++++++++++--表6 发酵结果菌株酒精浓度/%,v/v残糖/g L-1总酸发酵时间/h30 40 30 40 30 40 30 40 TM66 825 870 380 265 234 854856 TM107 836 340 250 204 515 034452 TM207 226 810 300 345 024 774852从表6中可以看出不管在30 还是在40 下,3株菌对糖的利用率都较高,残糖的含量均低于0 4g/ L.从发酵时间来看,高温下的发酵时间比常温下略长,TM10的发酵速度最快,常温下在44h内就完成了发28广西工学院学报 第20卷酵.常温下TM 10的发酵酒精终浓度最高,达到了7 82%,发酵效率约为84 1%,是一株极具潜力的酒精酵母菌.虽然3株菌在40 下的发酵能力均明显逊于30 ,但值得注意的是TM 20在40 下的发酵酒精终浓度只比30 降低了约6%,是3株菌中降低幅度最小的.这说明TM 20体内与酒精合成相关的酶受高温的影响不大,是一株值得进一步研究的耐高温酒精酵母菌.3 结论经菌种富集、分离、纯化,从自然界中筛选到了3株具有较强高温耐受性的酵母菌TM 6、T M10和T M20.3株菌均能在50 的高温下生长,在耐渗透压、耐酸、耐酒精以及发酵能力方面各有优缺点.同前期的实验结果相比较,发现本次实验筛选出的酵母菌发酵能力均优于之前筛选出的菌株[4].经分析认为本次实验由于在筛选过程中加入了TT C 筛选,因此在初筛的时候就将发酵能力弱的菌株淘汰掉了,这说明TTC 的确是一种筛选酒精高产酵母菌的有效方法,值得推广和研究.虽然TM 20在高温下的生长情况不如TM 6和TM 10,而且常温下TM10的发酵能力也远高于TM 20,但TM20在高温下的发酵能力要明显优于T M6和T M10.此外TM 20在30 和40 下的发酵能力仅相差6%,这说明TM20的发酵能力受温度的影响不大,是一株有潜力的耐高温酒精酵母菌.在后续实验中,希望通过诱变、驯化等方法进一步提高其酒精发酵的能力.参 考 文 献:[1]王瑞明,关凤梅,马霞,等.固态发酵高产酒精酵母菌株的选育[J].酿酒科技,2002(1):20 21.[2]王灏,王航,孟春,等.基因组改组技术选育耐高温、耐高乙醇酿酒酵母菌株的研究[J].微生物学通报,2007,34(4):705 708.[3]毛志群,张伟,檀建新,等.高产酒精酵母的筛选及鉴定[J].食品与发酵工业,2003,29(3):50 53.[4]易弋,伍时华.酒精耐受性酵母菌的筛选[J].广西工学院学报,2008,19(3):42 46.[5]王梅,张彭湃,帅桂兰,等.T T C 在黄酒酵母选育中的应用[J].酿酒,2001,28(5):62 64.[6]王福荣.酿酒分析与检测[M ].北京:化学工业出版社,2005.[7]蒋亚平,蔡金芝,杨宝玉,等.耐高温酵母W VHY8的生物学特性及应用[J].微生物学通报,1992,19(6):328 331.[8]沈睿,诸葛健.固态发酵用耐高温酿酒酵母YH4的筛选及其特性研究[J].食品与发酵工业,1991,4(4):8 15.[9]Pina C,Couto J A ,Hogg T.Inferring ethanol tolerance of Saccharomyces and non Saccharomyces yeasts by progressive inactivation[J].Biotechnol Lett.,2004,26(19):1521 1527.Study on screening of thermotolerant yeast strainsYI Yi 1a ,LI Ya 1b ,RONG Yuan ping 1a ,LI Kai 2(1a.Biological &Chemical 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