大豆蛋白的提取与含量测定

由于蛋白质中含有带酚基的酪氨酸还原呈兰色，溶液 兰色的深浅与蛋白浓度成正比。因此用Folin酚法测定 蛋白质含量，灵敏度较高。 样品中含酚类化合物及柠檬酸均有干扰作用，如果样 品酸度较高则显色较浅，要提高碳酸钠一氢氧化钠的 浓度。此法也可测定溶液中酪氨酸和色氨酸的浓度。 Folin酚法有不少个别改进的操作方法，但基本原理都 是一个，只是在各溶液的浓度及填加量上、保温的温 度及保温时间上有所不同而已，本实验所介绍的是本 室常用的，灵敏度较高的操作方法。
4
4
4
4
4
4
立即摇匀，在55℃恒温水浴中保温5min，用流水冷却1min后，测A650
A650值
0
0.184
Байду номын сангаас
0.317
0.425
0.536
0.668
？
2、样品测定：取三支试管（平行）各加入待测的蛋白质样品液1ml和空
白 ，如下操作：
试管号
蛋白质稀释液（ml） （mg)
PH7.8的buffer（ml）
4、Folin试剂乙：在2升磨口回流装置的烧瓶内，加钨酸钠 （ NaWO4· 2H2O）100g，钼酸钠（ NaMoO· 2M2O）25g， 蒸馏水 700ml，85%的磷酸 50ml，浓盐酸 100ml，充分 混合后，小火回流 10 小时，再加硫酸锂（ Li2SO4）150g， 蒸馏水50ml及数滴溴。然后开口沸腾15min，以驱除过量 的溴，冷却后定容到1000ml，过滤后呈金黄色，于棕色瓶 中保存，可使用多年。 上述制备的 Folin试剂乙的贮备液浓度一般在2mol/L左右， 几种操作方案都是把 Folin试剂乙稀释至1mol/L的浓度作为 应用液，我们是把贮备液于作用前稀释 18 倍，使之浓度为 0.1mol/L 略高。这种稀释 18 倍后的 Folin 试剂乙就是下文称 之为应用液， Folin试剂乙贮备液浓度的标定，一般是以酚 酞 为 指 示 剂 ， 用 Folin 试 剂 乙 去 滴 定 1 mol/L 左 右 的 标 准 NaOH溶液，当溶液颜色由红变为紫灰色，再突然变成黑绿 既为终点。如果用 NaOH 去滴定 Folin 乙，终点不太好掌握， 溶液的颜色是由浅黄色变为浅绿色，再变为灰紫色为终点。
空白
0
1 1
0 1 4
2 1
0 1 4
1 Folin-甲试剂 （ml） 1
3、器材：
试管10支 试管架一个 移液管：（5ml、1ml） 移液管架 洗瓶 恒温水浴 723型分光光度计
Folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作：
取6支试管（干燥的）按下表顺序分别加入各种试剂并进行反应和测定 K=0.308 B=--0.009 R*R=0.9909
试管号
蛋白质标准液（ml） （mg)
实验原理
大豆中含有丰富的蛋白质、根据提取方法及其其性质的不同， 可以分为水溶蛋白、盐溶蛋白、醇溶蛋白、碱溶蛋白。将豆粉依 次用上述溶剂提取，并用有机溶剂沉淀，可制得各部分蛋白质的 干粉。本实验主要是水溶提取大豆蛋白。 称出提出蛋白质的重量，已知原料重量，可以求出蛋白质的收 率。
试剂和器材
1、试剂 （1）10%Nacl （2）0.2%NaoH （3）75%乙醇 （4）6mol/L HCL （5） 1mol/L HCL （6）1 mol/L NaoH 2、器材 （1）离心机 （2）烧杯 （3）滴管 （4）PH试纸等
0
0 0
1
0.2 0.04
2
0.4 0.08
3
0.6 0.12
4
0.8 0.16
5
1.0 0.2
S
提取的样品液（ml）
PH7.8的buffer（ml）
0.8
1 1 0.8 1 0.6 1 0.4 1 0.2 1 0 1 0.2 1
Folin-甲试剂 （ml
）
于室温下不停地振荡10min
Folin-乙应用液（ml）
试剂和器材
1、材料： 本实验所提取大豆蛋白水提取液，经合适稀释至可测 定范围。 2、试剂： （1）0.03mol/L PH7.8的磷酸缓冲液。 （2）200μg/ml的标准酪（牛血清）蛋白溶液。 （3）Folin试剂甲：（俗称碱性铜试剂）：10g NaoH溶于400ml水中，再加50gNa2CO3； 称 取 0 . 5 g 酒 石 酸 钾 钠 溶 于 8 0 mlH2O 中 ， 再 加 0.25gCuSO4；以上两溶液混合定容到 500ml，冰箱 保存可用一个月。
操作方法
1、水抽提 将豆粉5g用约50毫升左右的蒸馏水少量多次的添加 搅 拌 ， 常 温 下 搅 拌 抽 提 1 5 min， 3800r/min 离 心 15min，取上清液，如上清液不清澈再经过滤。取上 清液1毫升稀释100倍留做蛋白测定。 其余上清液加入等体积在冰箱中预冷的丙酮，用滴 管少量多次慢慢滴加（搅拌），用6mol/L和1 mol/L HCL， 调 PH4.5~5.0，3800r/min， 离 心 1 5 min， 收集沉淀物，反复用丙酮搅拌洗涤离心2次，放入表面 皿上， 60 度烘干，得到粉末状蛋白质干粉，称重，计 算粗产率。
大豆蛋白的提取与含量测定
指导老师 赵建军 曲宁 夏婷
孟繁新
蛋白质性质与应用技术关系图
肽 氨基酸
疏 水 性 纸 层 析 亲 水 性 极性
酸 碱
酶 离子交换层析 电荷 电泳
蛋白质
形 状
分 子 量
离 心
凝 胶 层 析
一、大豆蛋白的提取
目的要求
1、掌握大豆蛋白的提取原理和方法 2 、计算粗提产率 2、学习计算蛋白质收率
蛋白质产物重量 蛋白质产率= ×100% 原料总重量
Folin酚法测定蛋白质浓度见第二实验部分
二、Folin酚法测定蛋白质含量
目的要求
掌握Folin酚法测定蛋白浓度的原理和方法
实验原理
蛋白质浓度可以从它们的物理化学性质，如比重、紫外 吸收，折射率等测定而得知；或用化学方法，如定氮、双缩脲 反应，Folin酚试剂反应等方法来计算。其中双缩脲法和Folin 酚法是一般实验室中常用的方法，它们操作简便，迅速，不需 要复杂而昂贵的仪器。 Folin 酚法灵敏度高，比双缩脲法灵敏 100倍。 Folin酚法所用试剂是由两部分组成，试剂甲相当于双缩 脲试剂，可与蛋白质中的肽链起显色反应。试剂乙中的磷钼酸 和磷钨酸在碱性条件下不稳定，易被酚类还原而呈兰色（钼兰 和钨兰混合物）。