单 倍 体 培 养

(2) 物理、化学诱变：花粉失去受精能力，
卵细胞在花粉刺激下孤雌生殖 (3) 多胚种子，例如裸子植物、芒果等
(4) 花药和花粉培养：产生单倍体胚
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二、单倍体培养的应用
（一）遗传应用
数量遗传研究，创制非整倍体材料，Байду номын сангаас变体筛选,
遗传转化
（二）育种学应用 1. 缩短育种年限：单倍体加倍形成纯合二倍体 2. 提高选择效率 加倍后纯合二倍体其等位基因相同，没有显隐性
1. 自发加倍：随机性强，烟草1~2%，不会出现
畸形。
2. 人工药剂加倍：秋水仙碱，使细胞核分裂中期延
长或停止，阻碍或破坏纺锤丝形成和发展，使分裂
的染色体停留在赤道板上无法形成新的核膜，染色 体分裂而细胞未进行分裂。
（1） 培养细胞处理：培养基中添加一定浓度的秋
水仙素。 （2） 试管苗处理：培养基中的单倍体幼苗取出， 浸泡在0.2~0.4%灭菌秋水仙素溶液中24~48h， 再转接到新鲜培养基上。
前者起源于二倍体物种，后者起源于多倍体。 2．单倍体培养 将单倍体个体接种到人工培养基上培养，并获 得再生单倍体植株。包括花药培养、小孢子培养、
未受精子房及卵细胞培养等方面。
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（二）单倍体的发生形成
1. 自发产生
生理不正常，胚胎发生时期死亡 2. 诱导产生： (1) 远缘杂交：远缘花粉诱导卵细胞在未受 精情况下受刺激发育成胚
体培养基悬浮---离心---清洗2~3次---花粉密度
103~104/ml液体培养
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（三）花粉培养方法
1. 液体培养 花粉悬浮液（104/ml）在培养皿中形成约 1mm后的薄层，用封口膜密封后进行培养。 2. 固体培养 用液体培养基溶解低熔点琼脂或琼脂糖保 温在40℃条件下使其保持液体状态，将含有花
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四、花粉培养（小孢子培养） （一）概念 花粉培养及游离小孢子培养（isolated microspore culture）属于细胞培养的范畴，它是通过人工培养游离花 粉或小孢子，改变其形成花粉管和精细胞的发育途径，诱 导其形成单倍体植株。
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优点：
（1）可以消除花丝、花药壁等二倍体组织的干
扰，得到的愈伤组织、胚状体或再生植株纯粹是配 子体起源的，可以省却对其来源进行鉴定的步骤。 （2）不存在花药壁等相关组织的影响，可以更 好的调节支配核发育的各种因素，实验的可控性加
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a,b：球形胚, 胚的表面粘连在花粉粒外壁上；c, d：心形胚；e,f： 鱼雷形胚
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A：从裂开的花药中长出胚状体; B、C：从药室中直接长出的幼苗; D、E：具有根、茎、叶的小苗; F：小苗发达的根系
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（二）花药培养基本程序
1. 取材
供体植株最好栽种在温光可控条件下，以保证花的发育 条件稳定，试验具有可重复性。花药应取自幼年植株，多数 植物以单核中央期或单核靠边期为宜。以花的外观形状来确 定采花标准，用醋酸洋红压片法或者碘-碘化钾压片法
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（四）影响单倍体培养的因素
1. 供体植株基因型与生理状态 基因型以十字花科为例，胚状体形成的容易顺序： 油菜类〉白菜类〉甘蓝类 生理状态：生长旺盛效果好，开花早期的花蕾容 易 2. 花粉发育时期
单核中期至单核晚期的花粉已形成花粉胚或花粉
愈伤组织，甜椒单核中期花粉的胚状体诱导率为
10.87 % ~ 29.11 %，而二核期花粉的胚状体诱
单倍体培养
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本章内容
1. 单倍体的概念及发生 2. 单倍体培养的应用
3. 花药培养
4. 花粉培养
5. 单倍体育种
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一、单倍体的概念及发生
（一）概念 1．单倍体（haploid） 单倍体指具有配子染色体数目的个体，即体细 胞染色体数目为n。单倍体包括一倍单倍体
（monohaploid）和多倍单倍体（polyhaploid），
粉粒的液体培养基与琼脂（糖）培养基混合，
使花粉粒均匀分布在培养基中，在培养皿中铺
一个薄层，凝固后用封口膜密封进行培养。
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3.夹层培养
固体培养基+花粉悬浮液+未凝固培养液
4. 看护培养
Sharp（1972），将番茄完整的花药置于
固体培养基上，在花药上覆盖一张滤纸圆片，
用吸管吸取一滴花粉悬浮液滴在滤纸上进行培 养，利用了花药中游离成分，提高雄核发育诱 导率。
花药切片显微观察
单核靠边期
四分体时期
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2. 灭菌及预处理
未开放的花蕾，常规灭菌后直接取出花药在
4~5℃条件下冷处理2~4d，易产生胚状体。
3. 接种
尽量不使花药损伤并去除花丝，排除二倍体 组织对单倍体植株再生的影响。
4. 培养
常用培养基有MS、B5、Nitsch、White等， 3~8周后花粉中形成了胚状体或愈伤组织。先暗 培养诱导愈伤组织，再转至25℃，光照 2000lx/14h条件下促进分化。
基因相互遮盖
3. 获得纯雄株等特殊育种材料
4. 选育自交系
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三、花药培养 （一）概述 花药培养属于器官培养范畴，一定发育时期 的花药在适当条件下可通过两种途径发育成单倍 体植株。 1. 胚发生途径 花粉---原胚---胚状体---单倍体植株 例如： 甜椒、茄子、大白菜、油菜 2. 不定器官发生途径 花粉---单倍体愈伤组织---诱导器官分化---单 倍体植株 花药培养存在的问题：培养过程中可能受到药 壁组织干扰，可能存在二倍体再生植株，需要进 行倍性鉴定。
导率则仅有4.03%
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3. 预处理 低温处理可以促进花粉形成胚状体，对 于不同作物，所需处理温度与处理时间有所 不同。高温预处理可以促进雄核发育，油菜 花药在培养前置于35℃条件下处理24h，再 放回25℃条件下培养，花粉胚的形成频率可 由0.5%提高到1%
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4. 培养条件 （1） 培养基：MS、B5、White、N6、C17、 W14等 （2） 蔗糖：提供碳源，调节渗透压。一般认为较 高浓度的蔗糖可以抑制花药中体细胞愈伤组织的增 殖，促进花粉愈伤组织和胚状体形成。例如十字花 科作物的蔗糖用量一般为10~13%，其中诱导孢 子体分裂阶段浓度为20%，诱导花粉胚生长浓度为 10%，再生浓度为3%。 （3）激素：2，4-D对启动分裂和愈伤组织增殖 往往有刺激作用，对分化有抑制作用。IAA+BA有 利于花粉直接形成胚状体。
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（3）成株处理：0.2~0.4%秋水仙素调和 在羊毛脂中，涂抹在植株侧芽或顶芽上，处 理24~48h后用清水冲掉。 3. 离体培养加倍：将单倍体植株进行离体培 养
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强。
（3）可以观察到单个花粉或小孢子雄核发育的 过程，因而是研究雄核发育过程及其影响因子的理 想实验系统。
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（二）花粉与小孢子的分离 1. 自然释放法（散落花粉法）：Sunderland
（1977）
2. 机械分离法：Nitsch（1974），烟草 花蕾消毒---取出花药---液体培养基---挤压、研磨 花药---尼龙筛网过滤---收集滤液---500 ~ 800 rpm离心3~5min---弃上清液---沉淀的花粉用液
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五、单倍体育种
花药及花粉培养的再生植株并非全是单倍体，通
常由胚状体途径得到的再生植株多是单倍体，而由愈 伤组织分化而来的再生植株有单倍体、二倍体、三倍 体、四倍体甚至非整倍体，需要对再生植株进行根尖 或茎尖染色体数目检查。
单倍体植株无法正常繁殖，必须进行染色体加倍
后，形成二倍体方可开花结实。
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