SAGE基因表达的系列分析方法
生物信息学中的基因表达数据分析方法
生物信息学中的基因表达数据分析方法在生物学研究中，基因表达数据的分析对于理解生物体内基因调控的机制和功能至关重要。
随着高通量测序技术的发展，基因表达数据的获取和分析变得更加容易和准确。
生物信息学中的基因表达数据分析方法主要包括差异表达分析、基因共表达网络分析以及功能富集分析等。
差异表达分析是基因表达数据分析的关键技术之一。
它可以识别不同基因在不同组织或条件下的表达量差异，从而帮助我们深入了解基因的功能和调控。
常用的差异表达分析方法包括基于计数数据的DESeq2和edgeR，以及基于表达量的limma等。
这些方法能够通过统计学模型和假设检验来识别不同基因的显著差异表达，并且考虑了多重比较校正和批次效应等因素的影响。
另外，基因共表达网络分析也是生物信息学中常用的方法之一。
它可以根据基因表达模式的相似性将基因划分为不同的共表达模块，从而发现基因之间的相互作用关系。
基因共表达网络分析能够帮助我们预测基因功能、发现新的基因调控模块以及揭示基因调控网络的结构和功能。
常用的基因共表达网络分析方法包括WGCNA和STRING等。
这些方法能够通过计算基因之间的相关性来构建基因共表达网络，并利用网络拓扑结构和模块发现算法来鉴定关键的共表达模块和核心基因。
此外，功能富集分析也是基因表达数据分析中重要的方法之一。
它可以识别差异表达基因集合中富集的生物学功能和通路，从而揭示基因集合在特定生物过程中的功能角色。
功能富集分析常用的方法包括基于基因本体论（Gene Ontology）的GO分析和基于KEGG通路的富集分析。
这些方法能够通过统计学假设检验来判断差异表达基因集合是否富集于特定的功能分类或通路，帮助我们深入了解基因的功能和生物学过程的调控机制。
此外，在基因表达数据的分析中，还有许多其他的方法可以用于发现和解释基因表达的模式和调控机制，比如聚类分析、GO/KEGG富集分析、差异表达基因的功能注释和生物学网络分析等。
这些方法的应用丰富了我们对基因表达数据的理解，并且为生物学研究提供了重要的信息。
分子生物学名词解释
分子生物学名词解释分子生物学考试重点一、名词解释1、分子生物学(molecular biology)：分子生物学是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学。
2、C值(C value)：一种生物单倍体基因组DNA的总量。
在真核生物中，C值一般是随生物进化而增加的，高等生物的C值一般大于低等生物。
3、DNA多态性(DNA polymorphism)：DNA多态性是指DNA序列中发生变异而导致的个体间核苷酸序列的差异。
4、端粒(telomere)：端粒是真核生物线性基因组DNA末端的一种特殊结构，它是一段DNA序列和蛋白质形成的复合体。
5、半保留复制(semi-conservative replication)：DNA 在复制过程中碱基间的氢键首先断裂，双螺旋解旋并被分开，每条链分别作为模板合成新链，产生互补的两条链。
这样形成的两个DNA分子与原来DNA 分子的碱基顺序完全一样。
一次，每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，所以这种复制方式被称为DNA 的半保留复制。
6、复制子(replicon)：复制子是指生物体的复制单位。
一个复制子只含一个复制起点。
7、半不连续复制(semi-discontinuous replication)：DNA 复制过程中，一条链的合成是连续的，另一条链的合成是中断的、不连续的，因此称为半不连续复制。
8、前导链(leading strand)：与复制叉移动的方向一致，通过连续的5W聚合合成的新的DNA链。
9、后随链(lagging strand)：与复制叉移动的方向相反，通过不连续的5\T聚合合成的新的DNA链。
10、AP位点(AP site)：所有细胞中都带有不同类型、能识别受损核酸位点的糖昔水解酶，它能特异性切除受损核昔酸上N-B糖昔键，在DNA链上形成去嘌吟或去嘧啶位点，统称为AP位点。
11、cDNA(complementary DNA)：在体外以mRNA 为模板，利用反转录酶和DNA聚合酶合成的一段双链DNA。
基因表达谱数据分析方法
基因表达谱数据分析方法基因表达谱是对生物体内基因表达情况的记录，通过对基因表达谱的分析，可以了解到基因在不同条件下的表达状态，从而揭示生命现象的本质和规律。
这对于研究基本生物现象、发现新的治疗手段等具有重要的意义。
随着高通量技术的发展，获取基因表达谱数据已经成为了常规操作。
但是，如何对这些数据进行分析和处理，是一个相当复杂的问题。
本文将介绍基因表达谱数据分析的基本方法和技巧。
我们将从预处理数据、差异分析、聚类分析、通路分析和生物信息学工具等几个方面进行论述。
一、预处理数据首先，我们需要将原始数据进行预处理，去除质量较差的数据，检查样本之间的差异和异常值等。
预处理过程旨在保证数据的准确性和可靠性，为后续的分析奠定基础。
二、差异分析差异分析是对基因表达谱数据进行质量评估和过滤的关键步骤。
常用的差异分析方法包括T检验、方差分析、Wilcoxon秩和检验等。
差异分析的目标是找出在不同实验条件下，哪些基因的表达发生了变化。
这是为了找到有生物学意义的差异基因集合并进一步进行研究。
三、聚类分析聚类分析是将基因表达谱数据中的基因和样本分别分成若干类，使得同一类中的基因或样本具有相似的表达模式，不同类之间具有较大的差异。
这样的分类结果有助于我们找出基因表达谱数据中的模式。
聚类分析常用的方法包括层次聚类和k-平均聚类等。
四、通路分析通路分析是将差异基因集合与特定生物过程或通路进行关联，以揭示差异基因集合在生物学上的意义。
通常，通路分析需要利用基因注释或生物信息学数据库中的信息，将差异基因集合与通路相对应，从而找到可能受到影响的通路。
五、生物信息学工具最后，利用生物信息学工具进行综合分析和可视化。
有很多生物信息学工具可以用来对基因表达谱数据进行分析和可视化，比如R、Python、Cytoscape等。
这些工具可以帮助我们更好地理解和解释基因表达谱数据中的生物学意义。
总结：基因表达谱数据分析是序列分析的一个重要分支，广泛应用于生物信息学、系统生物学和合成生物学等领域。
gene set enrichment analysis
gene set enrichment analysisGenesetenrichmentanalysis（GSEA）是一种用于分析基因表达谱的统计方法，通过将已知的基因集和基因表达谱进行比较，从而发现和确定基因组中的具有相关性的关键基因和转录谱的结构。
GSEA是一种定向分析方法，可以用来探索实验结果中的潜在功能。
它可以帮助生物学家从大量基因表达数据中找到显著因子，进而得出更好的生物学结论。
GSEA的基本步骤包括建立原始表达数据，确定某种生物学意义下的基因集以及表达距离，定义统计量，并估计样本间变异程度。
GSEA 首先利用秩和技术来测量基因表达谱与所给基因集之间的相关程度，同时考虑表达谱中基因不间断性，从而对样本进行明确分类，最后使用聚类分析将样本聚类到与基因集相关的聚类中，并计算与基因集之间的最终相关程度。
GSEA具有一系列特点：（1）GSEA把基因表达谱和基因集构建的过程看作一个整体，它可以检测和基因集相关的少数基因的关系，而不被大量基因的影响所掩盖；（2）基因表达谱可以有效地识别表达谱中显著的基因；（3）GSEA可以分析基因表达谱中的不同细分，以探索实验结果中的潜在功能；（4）GSEA不受平均表达水平的影响，也不受表达变化的幅度和持续时间的影响；（5）GSEA可以用于多组样本间聚类分析，可以检测出能够释放聚类效应的基因。
GSEA为生物学家提供了一种全新的分析手段，进而帮助他们从大量基因表达数据中发现和挖掘出基因组中的具有相关性关键基因和转录谱的结构，从而建立和证明自然环境中的细胞行为。
GSEA的应用非常广泛，可以用于寻找复杂疾病的相关基因，而且在发现药物治疗标志物等方面也非常有效。
GSEA的应用不仅仅限于生物学领域，它也可以应用于医学、农学和农艺学等领域。
由于GSEA具有许多优点，现在很多研究人员开始使用GSEA来解决实验问题。
GSEA可以用来从大量的基因表达数据中获取更多的信息，有助于生物学家了解基因组编码的功能，从而更好地理解生物学现象。
第四节基因表达数据的聚类分析
第四节 基因表达数据的聚类分析基因表达数据主要来自于两个方面，一是基因芯片，这是最主要的表达数据来源，利用基因芯片技术可以大规模并行获取基因转录结果mRNA 的数据（Schena Eet al ，1995）。
表达系列分析SAGE 和差异显示（Kozian and Kirschbaum ，1999）、蛋白质芯片等是快速检测蛋白质及其含量的另一类技术。
聚类分析是模式识别中一种非常有吸引力的方法，特别适用于模式分类数不知道的情况。
从机器学习的角度来看，有两种基本的聚类分析（Kaufman 1990），即所谓有教师聚类和无教师聚类。
在有师聚类中，对于每一类有一个参考模式，对于一个未分类的向量，通过计算选择一个最接近的参考模式，并将该向量归入该参考模式所对应的类，这实际上是一个分类问题。
而真正的聚类分析是一种无师学习（或无监督学习），没有关于聚类的先验知识，需要聚类算法根据样本之间的距离或者相似程度进行自动分类（傅京孙，1990；李介谷等，1986）。
基因表达数据聚类分析一般包括以下几个步骤：（１）确定基因表达的数据；（２）计算相似性矩阵，各个矩阵元素代表两个基因的表达是否相似；（３）选择算法进行聚类分析；（４）显示分析结果。
以下着重讨论对表达型基因芯片实验数据的处理和分析。
在一种基因芯片上往往含有成百上千个基因探针，一次可以同时检测大量基因的表达。
利用同一种芯片在不同条件下（不同时间，不同细胞，不同外界作用）进行基因表达实验，搜集表达数据，将原始数据放在一起，形成一个数据表格。
表格的每一行代表一个基因，是一个基因在不同实验条件下表达的“快照”，而每一列则代表各个基因在同一种实验条件下的表达水平。
从数学形式上来看，表格的一行数据就是一个向量，常称其为一个基因的表达模式，而表格本身就相当于一个矩阵。
聚类分析就是将这些向量按照相似程度进行归类。
对数据进行聚类分析之前，必须将包含在基因表达矩阵中的数据进行相似程度分析，并且对分析结果进行量化。
SAGE的原理及其应用
SAGE的原理及其应用1. SAGE的原理SAGE（Serial Analysis of Gene Expression）是一种用于测量基因表达水平的高通量测序技术。
它通过截取和测序所有转录本的短片段，以定量方式评估特定基因的表达水平。
SAGE技术的原理包括以下几个步骤：1.mRNA的提取：首先从细胞中提取总RNA，然后使用酶反应将其转录成cDNA。
2.链特异性构建：cDNA片段通过特异性引物进行逆转录扩增，得到了具有统一特异序列标签的短片段。
3.连接得到SAGE标签：将短片段连接成链接链，形成校准链。
4.连接链的切割：切割连接链，得到所需的SAGE标签。
5.串联标签的测序：对SAGE标签进行测序。
6.数据分析：通过对测序结果进行比对和统计，可以得到每个基因的表达水平。
2. SAGE的应用SAGE技术由于可以高通量地测量基因表达水平，被广泛应用于基因表达研究、基因功能鉴定、疾病诊断和药物开发等领域。
2.1 基因表达研究SAGE技术可以帮助研究人员全面了解基因的表达情况，从而揭示基因表达调控的机制。
研究人员可以通过比较不同组织、不同发育阶段或不同生理状态下的基因表达谱，发现相关的调控网络和信号通路。
2.2 基因功能鉴定SAGE技术可以帮助研究人员快速筛选出在特定生理或病理条件下表达的基因，并对这些基因进行进一步的功能验证。
通过与已知功能的基因表达谱进行比对，可以预测新基因的功能，并进一步验证其在生物学过程中的作用。
2.3 疾病诊断SAGE技术可以帮助研究人员发现与疾病相关的基因表达谱，从而为疾病的诊断、治疗和预后评估提供依据。
通过对疾病样本和正常对照样本的基因表达谱进行比对，可以发现特异性的疾病标记物，并使用这些标记物进行早期诊断和预测疾病进展的风险。
2.4 药物开发SAGE技术可以帮助研究人员评估候选药物对基因表达的影响，从而为药物的开发提供依据。
通过比较药物处理组和对照组的基因表达谱，可以发现受药物调控的基因，进而揭示药物的作用机制和潜在的副作用。
基因表达系列分析法_SAGE_的改进及其在植物功能基因组研究中的应用
基因组学与应用生物学，2009年，第28卷，第6期，第1204－1210页Genomics and Applied Biology,2009,Vol.28,No.6,1204－1210专题介绍Review基因表达系列分析法(SAGE)的改进及其在植物功能基因组研究中的应用张振乾谭太龙肖钢官春云﹡湖南农业大学农学院,国家油料改良中心湖南分中心,长沙,410128*通讯作者,guancy2000@摘要基因表达系列分析方法(SAGE)是一种新的基因表达分析方法，与基因芯片技术一样具有高通量的特点，可测定特定组织的基因表达水平，在全基因组水平上同时定量检测数万个基因表达模式；可在未知目的基因的前提下，分析来自一个细胞的全部转录本信息；对已知或未知基因表达进行定性和定量分析。
目前，虽然在疾病、发育、细胞凋亡、药物筛选等多个领域已有利用SAGE 方法进行的研究，但该方法在植物功能基因组研究中的应用相对较少。
本文主要综述了该方法在RNA 用量、PCR 循环次数、SAGE 效能和可靠性、标签长度和未知标签分析等方面的改进及其在植物中构建SAGE 文库、筛选新基因、基因表达图谱分析等方面的应用，从而为其在植物功能基因组研究中的进一步应用提供理论参考。
关键词基因系列分析方法(SAGE),功能基因组,基因表达图谱分析The Modification of Serial Analysis of Gene Expression (SAGE)and its Ap-plication in Plant Functional Genome ResearchZhang ZhenqianTan Tailong Xiao Gang Guan Chunyun ﹡Hunan Agricultural University,Hunan Branch of National Oilseed Crops Improvement Centre,Changsha,410128*Corresponding author,guancy2000@ DOI:10.3969/gab.028.001204Abstract Serial analysis of gene expossion (SAGE)is a kind of innovative gene expossion analysis method ,which possesses the same characteristic of high throughput as Genechip.This techniques can determine the level of gene expression in some special tissues and can quantitatively detect expression patterns of thousands of genes simultaneously on the whole genome level.And it also can be used to analyze all transcripts information from a cell without knowing target gene.Furthermore,This analytical method can carry out the qualitative and quantita-tive analysis for the expression of known or unknown genes.At present,SAGE has been widely used in many fields,such as disease,development,apoptosis and drug screening etc.,whereas it is relatively less been applied in plant functional genome research.In this paper,we mainly reviewed the modification of this approach on RNA dosage,PCR cycles,the efficacy and reliability of SAGE,the label length and unknown label analysis and so on.At the same time,we also summarized its application in plant functional genome research,for instance,the con-struction of SAGE library,screening of new genes and gene expression profiling analysis,which would provide theory reference for its further application in plant functional genome research.Keywords Serial analysis of gene expression (SAGE),Functional genome,Gene expression profiling analysis /doi/10.3969/gab.028.001204基金项目：本研究由国家973计划(2006CB101600)资助利基因表达系列分析方法(serial analysis of gene expression,SAGE)是基于poly A +RNAs 剪切得到的短标签和标签末端间的两两连接组成的串联体分析方法(Richards et al.,2004)。
医学分子生物学重点名词解释问答（2）
医学分子生物学重点名词解释问答（2）医学分子生物学重点名词解释问答复制方式称为DNA的半保留复制。
DNA的半不连续复制（semi-discontinuous replication）：在DNA复制过程中，前导链的复制是连续的，而后随链的复制是中断的、不连续的。
DNA复制体(replisome)：在复制叉附近，形成了以两套DNA聚合酶Ⅲ全酶分子、引发体和解链酶构成的类似核糖体大小的复合体，称为DNA复制体。
AP位点（AP site）：糖苷水解酶特异性切除受损核苷酸上的糖苷键，在DNA链上形成的去嘌呤或去嘧啶位点。
转座\移位（transposition）：遗传信息从一个基因座转移至另一个基因座的现象称为基因转座，是由可移位因子介导的遗传物质重排。
转座子（transposon，Tn）：存在于染色体DNA上可自主复制和移位的基本单位。
由于它可以从染色体基因组上的一个位置转移到另一位置，甚至在不同染色体之间跃迁，因此有时也称为跳跃基因(Jumping gene)。
插入序列(insertion sequence，IS)：最简单的不含有任何宿主基因的转位因子。
片段长度700—2500bp。
复合转座子(composite transposon)：是一类携带某些与转座无关的抗性基因(或其它宿主基因)的转座子。
分子量＞2000bp。
启动子（promoter）：能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。
核心启动子（core promoter）：指保证RNA聚合酶Ⅱ转录正常起始所必需的、最少的DNA序列。
包括转录起始点及其上游-25/-30bp处的TATA盒。
RNA剪接（RNA splicing）：一个基因的外显子和内含子共同转录在一条转录产物中，将内含子去除而把外显子连接起来形成成熟RNA分子的过程。
RNA的选择性剪接：用不同的剪接方式从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。
RNA的编辑（RNA editing）：转录后的RNA插入、删除或取代一些核苷酸残基，导致DNA所编码的遗传信息发生改变。
第6章 分子生物学研究方法(下)
④具有良好的机械性能
非特异吸附少
4.2 常用的固相支持物 ①硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是DNA分子结合不牢固 ②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸 纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 ③化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同 大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低
（2）电转法 利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到 固相支持物上。
（3）真空转移法
此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝
胶在上的方式将其放臵在一个真空室上，利用真空作用
将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真 空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或
硝酸纤维素膜上。
各种转移方法的比较：
6.1.2 RNA选择性剪接技术
RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从 一个mRNA前 体产生不同的mRNA剪接异构 体的过程。可分为：平衡剪 切、 5’ 选择性剪切、 3’ 选择性剪切、外显子遗漏型剪切及 相互排斥性剪切。常用RT-PCR法研究某个基 因是否存在 选择性剪切。 果蝇 Dscam 基 因可 以通过可变 剪接产生38000多 种 可 能 的 mRNA 异构体
Illumina Solexa 测序 Workflow
Illumina Sequencing Technology
有参考基因组序列生物信息分析
• 基因结构优化
• 鉴定基因可变剪接 • 预测新转录本 • SNP 分析 • 基因融合鉴定
5.4.1 RACE 法克隆基因全长 (Rapid Amplification of cDNA Ends)
4.3 Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法
基因表达水平的计算和分析方法
基因表达水平的计算和分析方法基因表达是生命活动的基础，每个细胞都依赖于基因表达来维持正常的生理功能。
随着高通量技术的发展，越来越多的基因表达数据积累，如何从这些数据中提取有价值的信息成为生物数据分析领域的重要研究方向之一。
基因表达数据分析的核心是基因表达水平的计算和分析方法。
一、基因表达水平的计算方法基因表达水平的计算方法有三种：基于芯片、基于RNA-seq和蛋白质组学分析法。
1.基于芯片的计算方法基于芯片的基因表达计算方法是通过DNA芯片技术，采用荧光信号分析技术来计算基因表达水平。
基本上分为以下步骤：首先将RNA转化为cDNA，并标记为荧光物质并打上芯片；通过荧光信号分析技术对荧光素的强度进行检测，并将强度值转换为基因表达水平。
这种方法已经被广泛应用，但是具有一定的局限性。
芯片技术复杂、成本高昂、对特定基因有选择性和检测范围有限等缺点，限制了其在大规模研究和应用中的应用。
2.基于RNA-seq的计算方法RNA-seq技术是最新的一种高通量测序技术，可同时检测所有共同的基因表达和新的转录本，以及所有SNP和突变等分子标记，分子分类和转录水平分布。
它可以使有限的生物材料得到有效和高精度的序列，并在不断更新的转录本数据库中分析和基因注释。
RNA-seq可以直接测量RNA转录本的量，并不是通过荧光信号而是通过量化RNA-seq文库中测序reads的数目来计算基因表达的水平。
可以检测很少的RNA，扩大了涉及的基因范围和研究范围，大大提高了检测效率和准确率。
3.蛋白质组学分析法蛋白质组学方法是一种更直接的基因表达水平测量方法。
蛋白质是基因表达的最终产物，是表达的直接结果，可以反映基因表达水平的真实状态。
蛋白质组学方法通过进行质谱分析，测量蛋白质的多肽序列，进而实现对基因表达水平的定量。
二、基因表达水平的分析方法基因表达水平的分析方法可以分为两个方面：一是对数据进行预处理并分析数据的结构，二是基于分析的结果进行生物学的解释和计算。
基因表达轮廓(gene expressed profile)技术(2)
基因表达轮廓（gene expressed profile）技术(2)经过这轮ＲＤＡ过程,Tester中的目的DNA将得到第一次富集。
将第一轮产物更换新接头,进行第二轮RDA过程,目的DNA可得到进一步的富集。
该技术假阳性很低。
但仍不能解决个体mRNA在丰度上存在巨大差异的问题,当靶序列浓度较低时,其富集受抑制。
3：抑制消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）技术是Diatchenko于1996年建立的另一种应用PCR方法的消减杂交技术.该技术是反转合成testercDNA和drivercDNA, RsaⅠ或HaeⅢ酶切成为短片段T和D,将T分为两份加不同的接头1（A1）和2(A2)(均为44/10 bp5’脱磷双链，5’脱P可保证只有接头中的长链可以与cDNA的5’-末端连接，分别具有一段反向末端重复序列，具体序列见实验),将T1和T2分别与过量的D杂交,第一轮杂交后,两组杂交产物混合,将这些产物再与D进行第二轮杂交,产生如下杂交体：T1/T2;T1/T1;T2/T2;T1/D;T2/D;D/ D。
杂交产物补平后作为模板,用A1和A2作为引物进行PCR扩增。
在上述杂交体中T1/T2双链两端带有不同接头序列，因此可以指数扩增；T1/D和T2/D因只有一个引物配对序列所以只能线形扩增，而T1/T1和T2/T2尽管双链两端均带有接头，但由于其双链带的接头为同类，在末端补平后形成长反向重复序列，并且链内退火优于链间退火，因此在退火时产生“锅柄样”结构，无法与引物配对，不能扩增（此即为抑制PC R）；而D/D因没有引物配对序列则无法扩增，因此经过两次杂交及PCR后只有T1/T2复合体才能得到扩增。
这样仅在目标样品中表达而在驱动样品中不表达的基因转录产物被差显。
SSH与cDNA-RDA相比除具有假阳性低，稳定性好的共性外，还解决了mR NA丰度差异的问题。
基因表达系列分析(SAGE)及其在生命科学中的应用
Ａ Ｅ标 签 的粘性 末端 ， 这 些分 别含 有接 口分 子 ＳＧ 并将
达 丰度 的数量 信息 ， 而且 还可 以 比较不 同时 、 空条 件 下 基 因表达 的差 异 ， 有假 阳性 率 低 、 具 可重 复性 强 、 实验周期 相 对较 短 、 量数 据 可 用 于 多 重 比较 等 诸 大 多优点 ， 目前 成为 基 因 表达 定 量 和 定 性研 究 的一 种
包文斌 ， 国宏Ｈ ， ．陈 一 束婧 婷 吴圣龙 （． ， １ 扬州大学 动物科技学院， 扬州 ２５ｏ ；． 江苏 ２ｏ９２ 安徽农业大学 动物
科技学 院，安徽 合肥 ２０３ ） ３０６
关键词 ： 因 达 系列分析 ； 基 表 差异表达 ； 用 应
中 图 分 类 号 ：７ ９ Ｑ ８ 文献标识码 ： Ａ 文章 编 号 ：０ ５４４ （０８０ －１６０ １０—５５ ２０ ）１ １ － ０３ ５
２ ＳＧ Ａ Ｅ技 术 的发 展
自 １９ ９５年 ， 瘤 分 子 学 家 Ｖ ｌ ｌｓ 肿 ｅａ ｃ ｕ ｅ ｕ等… 建 立 １ ＳＧ Ａ Ｅ技 术 以来 ，Ａ Ｅ技 术 取 得 了 飞速 的发展 。 最 ＳＧ 初的 Ｓ Ｇ Ａ Ｅ方 法 对 ｍ Ｎ 的 量 要 求 比 较 高 ， 要 ＲＡ 需
１ Ｓ Ｇ 的原 理 和 方 法 Ａ Ｅ
．
ＳＧ Ａ Ｅ技术 的主要 理 论 依据 有 ３个 ：１来 源 于 （） 转 录体特 定位 置 的 ９一ｌ ｐ的核 苷 酸 序 列 包 含 足 ３ｂ 够 的信 息 ， 确定一 个转 录体 ， 以作 为区别 转 录体 能 可 的标 签 （ａ） （ ） 些 分 离 自不 同转 录体 的标 签 可 ｔ ；２ 这 ｇ 以被 串连 成一 定 长度 的多 联体 ｃｎａ ｍ ｒ， 隆 入 ｏｃｔ ｅ）克 ｅ 载 体进行 测序 ；３ 同一标 签 的重复 次数 代表该 转 录 （）
基因表达谱分析技术
基因表达谱分析技术1、微阵列技术( microarray) 这是近年来发展起来的可用于大规模快速检测基因差别表达、基因组表达谱、DNA 序列多态性、致病基因或疾病相关基因的一项新的基因功能研究技术。
其原理基本是利用光导化学合成、照相平板印刷以及固相表面化学合成等技术,在固相表面合成成千上万个寡核苷酸探针”(cDNA、ESTs或基因特异的寡核苷酸)，并与放射性同位素或荧光物标记的来自不同细胞、组织或整个器官的DNA 或mRNA 反转录生成的第一链cDNA 进行杂交，然后用特殊的检测系统对每个杂交点进行定量分析。
其优点是可以同时对大量基因，甚至整个基因组的基因表达进行对比分析。
包括cDNA芯片(cDNA microarray)和DNA 芯片( DNA chips)。
cDNA 芯片使用的载体可以是尼龙膜，也可以是玻片。
当使用尼龙膜时，目前的技术水平可以将20000份材料点在一张12cmxi8cm的膜上。
尼龙膜上所点的一般是编好顺序的变性了的双链cDNA 片段。
要得到基因表达情况的数据，只需要将未知的样品与其杂交即可。
杂交的结果表示这一样品中基因的表达模式，而比较两份不同样品的杂交结果就可以得到在不同样品中表达模式存在差异的基因。
杂交使用的探针一般为mRNA的反转录产物，标记探针使用32PdATP。
如果使用玻片为载体，点阵的密度要高于尼龙膜。
杂交时使用两种不同颜色的荧光标记不同的两份样品，然后将两份样品混合起来与一张芯片杂交。
洗去未杂交的探针以后，能够结合标记cDNA 的点受到激发后会发出荧光。
通过扫描装置可以检测各个点发出荧光的强度。
对每一个点而言，所发出的两种不同荧光的强度的比值，就代表它在不同样品中的丰度。
一般来讲，显示出来的图像中，黄色的点表示在不同的样品中丰度的差异不大，红色和绿色的点代表在不同样品中其丰度各不相同。
使用尼龙膜为载体制作cDNA 芯片进行研究的费用要比玻片低，因为尼龙膜可以重复杂交。
第六章：分子生物学研究方法(下全文编辑修改
人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交
4. 基因定点突变技术
• 通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码 的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨 基酸残基 对蛋白质结构功能的影响。
二、基因敲除技术
• 基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，通 过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行 精确的定点修饰和基因改造。
方法: • 以9~11bp作为标签（tag）＝49＝262144组合 • 串联tag并通过两端接头PCR扩增 • 扩增产物进行测序 • 每个tag通过Genebank或EST数据库进行比对 • 确认tag代表的基因表达情况
2. RNA的选择性剪接从一个 mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。
2.凝胶阻滞试验 ➢ 是用于研究DNA与蛋白质相互作用的一种
特殊的凝胶电泳技术。
➢ 当DNA与蛋白质结合时，在电泳中会受到阻滞， 说明可能与某种特殊蛋白结合了。
3. DNAase足迹试验 ➢ 蛋白质结合在DNA片段上，能保护结合部位不被
DNAase水解，电泳中对应于结合部位没有条带。
• 常用RT-PCR法研究某个基因是否存在选择性剪切。
3.原位杂交技术( In Situ Hybridization，ISH)
• 用标记的核酸探针，在组织、细胞上对核酸进行 定位和相对定量研究的一种手 段。
• 探针标记用同位素或地高辛、生物素荧光标记等。
地
同
高
位
辛
素
标
标
记
记
染色体原位杂交
三、蛋白质与RNA、DNA相互作用
1. 酵母单杂交系统 • 将待测转录因子cDNA与表达载体导入酵母细胞，
该基因产物如 果能够与顺式作用元件相结合，就 能激活启动子，使报告基因得到表达。
基因表达研究技术
1、基因表达系列分析技术（Serial Analysis of Gene Expression，SAGE）是以DNA序列测定为基础分析全基因组表达模式的技术。
任何长度超过9-10个碱基的核苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产物，因此，根据某个序列占总标签数的比例可分析所对应基因的表达频率。
2、原位杂交(In Situ Hybridization，ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段，分为RNA原位杂交和染色体原位杂交。
3、RNA原位杂交：用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定性定量分析。
4、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH).首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。
5、基因定点突变(site-directedmutagenesis).通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。
6、基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。
7、基因敲除分为：完全基因敲除：是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性条件型基因敲除：（又称不完全基因敲除），是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。
sci中gsea结果描述
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Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) 是一种用于解释基因
表达数据的方法，它可以帮助我们理解基因集在不同生物学条件下
的富集程度。
在科学研究中，GSEA 结果的描述通常包括以下几个方面：
1. 数据来源和处理，首先，需要描述使用的基因表达数据集的
来源，包括样本数量、实验条件、处理方法等。
此外，还需要说明
数据的预处理步骤，如数据归一化、批次效应的校正等。
2. 分析方法，接下来，需要描述使用的 GSEA 分析方法，包括
所选用的基因集数据库（如KEGG、GO等）、统计检验方法（如基于
秩和的检验）、显著性阈值的设定等。
3. 结果解释，对于显著富集的基因集，需要描述其在生物学功
能和通路上的解释，以及与研究问题的关联性。
同时，也需要对于
未显著富集的基因集进行解释，说明可能的原因和潜在的生物学意义。
4. 结果展示，最后，需要将 GSEA 结果以图表的形式进行展示，
如富集通路的富集曲线、基因集的热图等，以便读者直观地理解分
析结果。
总的来说，描述 GSEA 结果需要综合考虑数据来源、分析方法、结果解释和展示方式，以全面且清晰地呈现研究所得的富集分析结果。
基因表达系列分析（SerialAnalysisofGeneExpression,SAGE）技术
SAGE 技术MRNA 结合到微珠子上(Microscopic Bead and mRNA)mRNA 转录成DNA(mRNA binds to bait and is copied into DNA)用酶切开DNA的一小段(An enzyme cuts the DNA)另一个酶定在DNA末端以便切下一小段(An enzyme locks onto the DNA and cuts off a short tag),这一小段就被视为这个基因的标签两个标签连在一起(Two tags are linked together)在末端的定位分子被切掉(Enzymes cut off the "Docking Molecules")都连成一条线(Di-Tags are combined into large concatemers)DNA上所携带的遗传信息，需要通过RNA为中介体，合成出组织和正常生理功能所需要的蛋白质，这个过程被称为基因的表达。
在生物体中不同的组织和器官所表达的基因群是不一样的，我们把基因群的表达状况称为基因表达谱。
目前，高通量地研究基因表达谱的方法主要有两种，即生物芯片和基因表达串联分析（serial analysis of gene expression, SAGE）。
基因芯片所能检测的基因必须是已知的基因，放在芯片上几种基因的探针就只能检测这几种基因的表达谱；相比之下，SAGE能以远高于DNA芯片的精确度和重复性来检测在病理条件下基因表达谱的改变，而不必考虑所检测的基因是已知的还是未知的。
因此在检测疾病相关的新基因，特别是无法用基因芯片进行检测的低表达量致病基因时，SAGE是目前的最佳手段，无可取代。
SAGE技术为Genzyme公司所拥有的专利技术。
其技术简介如下：SAGE技术得以建立的理论基础首先，一段来自于任一转录本特定区域的"标签"（Tag），即长度仅9-14bp的短核苷酸序列，就已包含足够的信息以特异性地确定该转录本。
基因表达中值gsea
基因表达中值gsea
基因表达中值（GSEA）是一种用于分析基因表达数据的方法，其基本思想是使用预定义的基因集，将基因按照在两类样本中的差异表达程度排序，然后检验预先设定的基因集合是否在这个排序表的顶端或者底端富集。
GSEA分析不需要指定明确的差异基因阈值，算法根据实际整体趋势分析，从基因集的富集角度出发，更容易囊括细微但协同变化对生物通路的影响，尤其是差异倍数较小的基因集。
这种方法比较适用于传统分析方法筛选后样本过少的数据集。
总的来说，GSEA可以用来识别并分析基因表达数据中的模式和趋势。
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息，对已知基因进行量化分析。SAGE也能应用于寻找新基因。虽然SAGE的标签仅 包括9个碱基，但加上锚定酶的位点序列（4个碱基）共可确认13碱基序列。
2、SAGE可用于定量比较不同状态下的组织细胞的特异基因表达。 Stephen· L等（1997）
•
利用SAGE技术比较小鼠胚囊纤维细胞基因表达。小鼠胚囊纤维细胞能产生对温度 敏感的P53肿瘤抑制蛋白，就可通过SAGE分析，比较两种不同温度下基因表达的 差异。从约15 000个分析的基因中，发现有14个基因的表达依赖于P53蛋白，有3 个基因的表达与P53蛋白的失活显著相关。
3、由于SAGE能够同时最大限度的收集一种基因组的基因表达信息，转录物的分析数据可 用来构建染色体表达图谱（Chromosomal expression map）。 利用基因的表达信息
•
与基因组图谱融合绘制的染色体表达图谱，使基因表达与物理结构连系起来，更利 于基因表达模式的研究。
• 4、SAGE能够接近完整地获得基因组表达信息，能够直接读出任何一种类型细胞或组织的 基因表达信息。
• 4、cDNA片段与接头（Linker）的连接 接头包括4条链：Linker 1A、
• 5、标签酶酶切释放标签序列 标签酶是一种Ⅱ类限制酶，它能在距识别位
• 6、连接形成双标签（Ditages） 将含有Linker 1和Linker 2的标签在连接
酶的作用下连接形成Linker1、2的双标签。
常规 SAGE方法的操作步骤及原理
cDNA 互补脱氧核糖核酸
为具有与某mRNA(信使RNA)链呈互补的碱基序列的单链DNA即 complementary DNA之缩写，或此DNA链与具有与之互补的碱基 序列的DNA链所形成的DNA双链。与RNA链互补的单链DNA，以 其RNA为模板，在适当引物的存在下，由依赖RNA的DNA聚合酶 （反转录酶）的作用而合成，并且在合成单链cDNA后，在用碱处 理除去与其对应的RNA以后，以单链cDNA为模板，由依赖DNA的 DNA聚合酶或依赖RNA的DNA聚合酶的作用合成双链cDNA。真 核生物的信使RNA或其他RNA的cDNA，在遗传工程方面广为应用。 在这种情况下，mRNA的cDNA，与原来基因的DNA（基因组 DNA，genomic DNA）不同而无内含子；相反地对应于在原来基 因中没有的而在mRNA存在的3′末端的多A序列等的核苷序列上， 与exon序列、先导序列以及后续序列等一起反映出mRNA结构。 cDNA同样可以被克隆。
SAGE的原理
SAGE的主要依据有两个:
• 1、一个9～10碱基的短核苷酸序列标签包含有足够的信息， 能够唯一确认一种转录物。例如，一个9碱基顺序能够分 辨262144个不同的转录物，而人类基因组估计仅能编码 80000种转录物，所以理论上每一个9碱基标签能够代表 一种转录物的特征序列。
• 2、如果能将9碱基的标签集中于一个克隆中进行测序，并 将得到的短序列核苷酸顺序以连续的数据形式输入计算机 中进行处理，就能对数以千计的mRNA转录物进行分析。
采用12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳回收6bp的片段，即得双标签。
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• 9、双标签随机连接形成串联子（Concatemers） 纯化的
双标签采用连接酶使之成锁链状形成不同大小的串联子。8%的聚丙 烯酰胺凝胶电泳回收一定片段长度的串联子。
• 10、克隆串联子、测序 将串联子克隆至含Sph Ⅰ酶切位点的
pZero载体中，测定串联子的序列。
• 11、计算机辅助分析 测序结果采用SAGE软件包进行分析，获得
标签序列及其丰度信息，每个标签可通过与Genbank数据库或者EST 数据库数据进行对比，从而可确认其代表的基因。
SAGE的优点和应用
SAGE是一项快捷、有效的基因表达研究技术，任何具备PCR和手动测序器具的实验室都能 使用这项技术，结合自动测序技术能够在3个小时内完成1000个转录物的分析。另外使用不 同的锚定酶（识别5～20碱基的Ⅱ类核酸内切酶），使这项技术更具灵活性。 • 1、SAGE可应用于人类基因组研究。 SAGE能够快速、全范围提取生物体基因表达信
• 7、PCR扩增（Ditages） PCR扩增依据Linker 1和Linker 2序列
设计。只有含有Linker 1和Linker 2的双标签才能得到有效的扩增。采 用12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化PCR产物，回收102bp的扩增片段。
• 8、分离纯化双标签 采用锚定酶酶切回收的扩增产物，酶切产物
• • • •
Linker 1A：5’TTTGGATTTGCTGGTGCAGTACAACTAGGCTTAATAGGGACATG3’ Linker 1B：5’TCCCTATTAAGCCTAGTTGTACTGCACCAGCAAATC3’ Linker 2A：5’TTTCTGCTCGAATTCAAGCTTCTAACGATGTACGGGGACATG3’ Linker 2B：5’TCCCCGTACATCGTTAGAAGCTTGAATTCGAGCAG3’
常规 SAGE方法的操作步骤及原理
• 1、生物体特定阶段组织或细胞中全部mRNA的制备。 • 2、cDNA的双链的合成 以biotinylated oligo(dT）为引物将mRNA反转录
合成cDNA 。
• 3、锚定酶酶切 锚定酶具有4bp的识别位点，常用的锚定酶如：NlaⅢ，其
酶切位点为CATG 4个碱基序列。酶切后产物通过生物素磁珠（链霉素抗生物 素蛋白珠）分离含polyA尾的cDNA片段，将此产物平均分为2份。 Linker 1B、Linker 2A、Linker 2B。将Linker 2A以及Linker 2B末端去磷酸化， 并与相应的Linker 1A以及Linker 1B进行退火形成接头Linker 1和Linker 2.（接 头末端含有锚定酶以及标签酶酶切位点）。 点约20碱基的位置切割DNA双链。
SAGE
基因表达系列分析 Serial Analysis Of Gene Expression
• 是通过快速和详细分析成千上万个EST （express sequenced tags）来寻找出表达 丰富度不同的SAGE标签序列。 • 主要应用：全基因组基因表达分析、寻找 差异基因、发现新基因。
• 能同时对大量的转录物进行定性和定量的分析，可以同时 反映正常或异常等不同功能状态下细胞整个基因组基因的 全貌，特别对低丰度表达基因有较高的检测结果。它不但 能快速详细的分析成千上万个基因转录子的丰富信息，还 能发现新的基因。