第十章 维生素的测定

⑤样品中维生素A是否提净的检验法：取最 后一次的醚提取液2mL置于试管中，加少 许三氯化锑。如无蓝色反应，说明维生素A 已经提净。按本实验室经验，样品中含维 生素A1100国际单位时用40mL乙醚提取5-6 次即可提净；样品含量低着提取3-4次即可。 ⑥抽干的时候应尽速加入三氯甲烷，因维生 素A在干燥状态下极易被氧化破坏。 ⑦研磨时不要用太多硫酸钠，否则会在以后 用乙醚提取时形成大量很细的混悬物，不 好分离。如果样品在冰冻的状态下就开始 研磨，需用的硫酸钠要少些，磨得也快些。
四、维生素D的测定
维生素D是指含有抗佝偻病活性的一类物质， 具有维生素D活性的化合物约有l 0种，其中最重 要的是维生素D2、维生素D 3及其维生素D原。维 生素D 2无天然存在，维生素D2只存在于某些动 物性食物中。但它们都可由维生素D原(麦角固醇 和7一脱氢胆固醇)经紫外线照射形成。
维生素D2 药片吃多了中毒。
3．耐热性、耐氧化性： 耐热性 VA 好，能经受煮沸氧化性 易被化（光、热 促进其氧化）
VD VE
好，能经受煮沸 好，能经受煮沸
不易被氧化 在空气中能慢慢被氧化 （光、热、碱促进其 氧化）
根据上述性质．测定脂溶性维生素时，通常：
皂化样品 水洗去除类脂物 提取脂溶性维生素(不皂化物) 溶于适当的溶剂 测定。 有机溶剂 浓缩
在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解， 常加入抗氧化剂(如焦性没食子酸、维生素C等)。
对于A、D、E共存的样品，或杂质含量高的 样品，在皂化提取后，还需进行层析分离。
国际单位： IU （International Unit) 1 IU = 0.3μg VA = 0.025 VD = 1.79 μgβ-胡萝卜素 = 1.1mg α- VE = 3 μg VB
我们在评价食品的营养价值，开发利用高 含量维生素的食品资源，指导人们合理调整膳食 结构，指导制定加工工艺或贮存条件，最大限量 地保留各种维生素，还要控制强化食品中加入量， 防中毒，都离不开分析检测工作。
维生素分类：脂溶性（A、D、E、K） 水溶性两类（B族、C）
测定方法
生物鉴定法
优点
不用详尽分离
• a 皂化: 根据试样中维生素A含量的不同，准 确称取0. 5 -5 g试样于三角瓶中，加入10 mL 氢氧化钾(1+1)及20 -40 mL乙醇，于电热板 上回流30 min，至皂化完全为止。 • b 提取: 将皂化瓶内混合物移至分液漏斗中， 以30 mL水洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗(如 有渣子，可用有脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗 内）。用50 mL乙醚分二次洗皂化瓶，洗液 并入分液漏斗中。振摇并注意放气，静置分 层后，水层放入第二个分液漏斗内。皂化瓶 再用约30 mL乙醚分二次冲洗，洗液倾入第 二个分液漏斗中。振摇后，静置分层，水层 放入三角瓶中，醚层与第一个分液漏斗合并。 重复至水液中无维生素A为止。
本法适用于维生素A含量较高的各种样品(高
于 5—10 μ g ／g )，对低含量样品，因受其他脂
溶性物质的干扰。不易比色测定; 该法的主要缺点是生成的蓝色络合物的稳定 性差。比色测定必须在 6秒钟内完成，否则蓝色 会迅速消退，将造成极大误差。
• （三）分析步骤 （1）试样处理 根据试样性质，可采用皂化法或研磨法。 1）皂化法 • 适用于维生素A含量不高的试样，可减少脂 溶性物质的干扰，但全部试验过程费时，且 易导致维生素A损失。 • 皂化 提取 洗涤 浓缩
⑾如果样品中含β-胡萝卜素（如奶粉、禽蛋 等食品）干扰测定，可将浓缩蒸干的样品 用正己烷溶解，以氧化铝为吸附剂，丙酮、 乙烷混合液为洗脱剂进行柱层析。 ⑿比色法除用三氯化锑做显色剂外，还可用 三氟乙酸、三氯乙酸做显色剂。其中三氟 乙酸没有遇水发生沉淀而使溶液混浊的缺 点。
三、β—胡萝卜素的测定
（GB/T 5009.83—2003 ）第一方法是HPLC； 第二方法为纸层析法。 胡萝卜素是一种广泛存在于有色蔬菜和水果 中的天然色素，有多种异构体和衍生物，总称为 类胡萝卜素，其中在分子结构中含有 β一紫罗宁 残基的类胡萝卜素，在人体内可转变为维生素A， 故称为维生素A原。如α、β、γ胡萝卜素，其中 以β—胡萝卜素效价最高。
• 试样测定 于一比色管中加入10m L三氯甲烷，加 入1滴乙酸酐为空白液。另一比色管中加入 1mL三氯甲烷，其余比色管中分别加入1 mL试样溶液及1滴乙酸酐。其余步骤同标 准曲线的制备。
• 结果计算：
c 100 X (mg / 100 g ) V m 1000
• • • • • X试样中维生素A的含量，mg/100g c—由标准曲线查得试样中维生素的含量，µ g/mL m—试样质量，g V —提取后加三氯甲烷定量之体积，mL 计算结果保留三位有效数字
2）研磨法 • 适用于每克试样维生素A含量大于5-10 ug试 样的测定，如肝的分析。步骤简单，省时， 结果准确。 研磨 提取 浓缩
• a、研磨:精确称2-5g试样，放入盛有3-5倍试 样质量的无水硫酸钠研钵中，研磨至试样中 水分完全被吸收，并均质化。
• b、提取:小心将全部均质化试样移入带盖的 三角瓶内，准确加入50 -100 mL乙醚。紧压 盖子，用力振摇2 min，使试样中维生素A 溶于乙醚中。使其自行澄清(大约需1 -2 h)， 或离心澄清(因乙醚易挥发，气温高时应在 冷水浴中操作。装乙醚的试剂瓶也应事先放 入冷水浴中)。 • c、浓缩:取澄清的乙醚提取液2 -5 mL，放 入比色管中，在70 --80℃水浴上抽气蒸干， 立即加入1 mL三氯甲烷溶解残渣。
分析方法中较好的是比色法和高效液相色谱法。 是AOAC选定的正式方法。
(一)三氯化锑比色法 • 原理：在三氯甲烷溶液中，维生素D与三氯 化锑结合生成一种橙黄色化合物，呈色强度 与维生素D的含量成正比。 • 样品处理：同维生素A的测定。食品中维生 素D的含量一般很低，而维生素A、维生素E、 胆固醇、速甾醇等成分的含量往往大都超过 维生素D，严重干扰维生素D的测定，因此 测定前必须经柱层析除去这些干扰成分。
⑧乙醚为溶剂的萃取体系，易发生乳化现象。 在提取、洗涤操作中，不要用力过猛，若 发生乳化，可加几滴乙醇破乳。 ⑨所用氯仿中不应含有水分，因三氯化锑遇 水会出现沉淀，干扰比色测定。故在每毫 升氯仿中应加入乙酸酐1滴，以保证脱水。 另外，由于三氯化锑遇水生成白色沉淀， 因此用过的仪器要用稀盐酸浸泡后再清洗。 ⑩由于三氯化锑与维生素A所产生的蓝色物 质很不稳定，通常生成6S后便开始比色， 因此要求反应在比色管中进行，产生蓝色 后立即读取吸光度。
第十章 维生素的测定 第一节 概 述
维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类 天然有机化合物。其种类很多，目前已确认的有30 余种，其中被认为对维持人体健康和促进发育至关 重要的有20余种。这些维生素结构复杂，理化性质 及生理功能各异，有的属于醇类，有的属于胺类， 有的属于酯类，还有的属于酚或醌类化台物。
β—胡萝卜素的结构如下：
胡萝卜素原只存在于植物性食品中，但以含 有胡萝卜为食物的家禽、兽类、水产动物及其加 工产品，以及为着色而添加胡萝卜素的食品，当 然也含有胡萝卜素。
胡萝卜素对热及酸、碱比较稳定，但紫外线 和空气中的氧可促进其氧化破坏。因系脂溶性维 生素，故可用有机溶剂从食物中提取。 胡萝卜素本身是一种色素，在450 nm 波长 处有最大吸收，故只要能完全分离，便可定性和 定量。但在植物体内，胡萝卜素经常与叶绿素、 叶黄素等共存，在提取 β一胡萝卜素时，这些色 素也能被有机溶剂提取，因此在测定前，必须将 胡萝卜素与其它色素分开。常用的方法有纸层析、 柱层析和薄层层析法。
维生素都具有以下共同特点：
这些化合物或其前体化合物都在天然食物中 存在；它们不能供给机体热能。也不是构成组织 的基本原料，主要功用是通过作为辅酶的成份调 节代谢过程，需要量极小；它们一般在体内不能 合成，或合成量不能满足生理需要，必须经常从 食物中摄取；长期缺乏任何一种维生素都会导致 相应的疾病。
• 步骤：
样品皂化 提取 浓缩 色谱分析
二、比色法测定VA的含量
（GB/T 5009.82—2003中第二法） （一） 原理 在氯仿溶液中，VA与三氯化锑可生成蓝 色可溶性络合物，在 620 nm 波长处有最大吸 收峰，其吸光度与VA的含量在一定的范围内 成正比，故可比色测定。
（二）适用范围及特点
缺点
费时（21 天）费力（要 动物饲料）
微生物法
选择性高，主要用于水 操作繁琐，耗时过长， 溶性 V 要有专门人员
仪器分析（紫外法、 灵敏、快速、有较好的 荧光法） 选择性 各 种 色 谱 法 （ 柱 、 高分离效能，可分离、 纸、薄层层析） 纯人、定性、定量 可同时完成多种 V 及其 现代高压液相色谱 异构体的自动分离、检 和气相色谱 测 化 学 分 析 法 （ 比 色 简便、快速、不需特殊 法和 仪器）
• 注意事项： ①试剂配制时注意，盛过三氯化锑的比色管应先用盐 酸洗，然后用水洗。如此时仍有白色沉淀产生，仍 须用盐酸洗，因三氯化锑易水解，生成不溶解于水 的白色沉淀。 ②维生素A极易被光破坏，实验操作应在微弱光线下 进行，或使用棕色玻璃仪器。 ③所用氢氧化钾溶液中所含氢氧化钾的质量至少应为 样品质量的一半。 ④回流时间因样品而异。测验皂化是否已经完全，可 加少许水于皂化瓶中，振荡后如有混浊现象，表示 皂化尚未完全，应继续加热。皂化完毕时以10mL水 冲洗冷凝管，洗液并入皂化瓶，然后冷却至室温。
(二) 液相色谱法 它的的灵敏度较比色法高30倍以上，且操 作简便，精度高，分析速度快。是目前分析 维生素D的最好方法。 • 原理 试样在焦性没食子酸的保护下皂化，以 石油醚萃取后，用正相色谱柱提取富集，用 反相色谱柱进一步分离，紫外检测器定量测 定。 • 试剂 ① 10% 焦性没食子酸：抗氧化剂，试剂焦性 没食子酸容易变性，应购买近期生产的试剂。
一、维生素A和维生素E的测定
维生素A存在于动物性脂肪中，主要来 源于肝脏、鱼干油、蛋类、乳类等动物性食 品中。植物性食品中不合VA，但在深色果蔬 中含有胡萝卜素，它在人体内可转变为VA， 故称为VA原。