核酸提取技术(CDC培训)

主要内容


核酸提取的目的意义
核酸提取的一般程序 微生物核酸提取的方法原理 核酸提取质量的鉴定 核酸提取的注意事项
核酸提取的意义
从生物材料中分离制备核酸，研究其结构与 功能，对于了解生命活动的规律，揭示生命现 象的本质有重大意义。 医学检验需要：是分析标本中包含的分子 信息的前提条件，对于精确诊断疾病具有重 要意义。
前 言
核酸是遗传信息的携带者，是基因表达的物质 基础。在生物的生长、发育和繁殖等生命活动 中起着十分重要的作用。
因此无论是进行核酸结构与功能的研究，还是 进行基因工程、蛋白质工程，首先需要对核酸 进行分离和纯化，核酸样品的质量将直接关系 到实验的成败。核酸的提取是分子生物学实验 技术中最重要、最基本的操作 。
基因组DNA－SDS法
SDS法流程图
标 本、 细菌培养物 裂解抽提
上层溶液
离心洗涤
酒精沉淀
干燥溶解
DNA溶液
基因组DNA－其它方法
根据细胞裂解方式的不同有：
物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法

生物方式：酶法
基因组DNA－其它方法
根据核酸分离纯化方式的不同有：
高盐低pH值结合核酸，低盐 高pH值洗脱。 快捷高效。
吸附材料结合法：
• •
Hale Waihona Puke Baidu
硅质材料
低盐高pH值结合核酸，高盐 低pH值洗脱。 适用于纯度 要求高的实验。
阴离子交 换树脂
基因组DNA－其它方法

浓盐法：
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离

有机溶剂抽提法：
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
微生物核酸提取的方法原理
2. 有机溶剂法
原理：利用酚、氯仿的混合液与含核酸和 蛋白质的水溶液一起振摇时形成乳状液， 蛋白质因充分接触酚和氯仿而变性，与核 酸分开。离心后可分为两相，一般上层为 含核酸的水相，下层为有机相，交界处是 变性凝聚的蛋白质层。
微生物核酸提取的方法原理
3. 酶法
原理：利用蛋白酶消化降解蛋白质，达到去除 蛋白质的目的。
DNA提取的方法


基因组DNA的提取
CTAB法 SDS法 其它

非基因组DNA的提取——质粒 DNA 碱裂解法
煮沸法
基因组DNA－ CTAB法
原理
CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide， 十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂， 可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物 在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通 过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质 后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
核酸提取质量的鉴定
DNA
纯度
OD260/OD280 = 1.8（1.6~1.9） ＞1.9，RNA污染 ＜1.6，蛋白、酚污染
浓度
OD260 = 1 时，DNA = 50μg/ml
1cm
完整性 电泳观察条带情况
核酸提取质量的鉴定
RNA
纯度
OD260/OD280 = 2.0（1.7～2.0） ＞2.0，异硫氰酸残留 ＜1.7，蛋白、酚污染
DNA和RNA都是极性化合物，溶于水，不溶 于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离 酸易溶于水。在酸性溶液中，DNA、RNA易水 解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 真核生物中，DNA主要存在于细胞核的染色 体中，RNA则主要存在于细胞质中；原核生物 中，DNA主要存在于核质区，RNA则主要存在 于细胞质中；而非细胞形式存在的病毒和噬菌 体，往往只含DAN或只含RNA。
蛋白质的去除可以选择酶法、去污剂
法或有机溶剂法或联合运用上述方法。
微生物核酸提取的方法原理
1. 阴离子表面活性剂法
原理：利用SDS等阴离子表面活性剂与蛋 白质带正电荷的侧链结合，从而使核酸与 蛋白质分开。然后加入浓醋酸钾溶液，使 SDS-蛋白质复合物沉淀，并使多余的 SDS转化为溶解度小的钾盐而同时沉淀
基因组DNA－SDS法
原理
SDS在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞， 使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐 (KAc 或 NH4Ac) 浓度并降低温度（冰 浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除 去沉淀； 上清液中的 DNA 用酚 / 氯仿抽提，反复抽提 后用乙醇沉淀水相中的DNA。
细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁
细菌有坚硬的细胞壁，裂解细胞有三种方法：
①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法； ②化学试剂法：用SDS处理细胞； ③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，可使细胞壁破碎。
核酸的分离纯化

细胞裂解后，核酸与大量杂质在一起，必须 进行分离纯化。
蛋白质
多糖
关键：蛋白质的去除
细胞的裂解方法：
一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破
碎或用超声波处理破碎。
植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果
胶等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适 当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处 理也能达到目的。
的骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊 状大分子，非常坚韧。

密度梯度离心法：
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物
质粒DNA－碱裂解法
浓度
OD260 = 1 时，RNA = 40μg/ml
1cm
完整性 电泳观察条带情况
核酸提取的注意事项
为了确保核酸的完整性，实验应注意：
① 温度不宜过高； ② 控制一定的pH值范围（ pH5～9），过酸 或过碱均能破坏核酸链中磷酸二酯键； ③ 保持一定的离子强度，有助于维持核酸的 空间构型； ④ 减少物理因素对核酸的降解机械剪切力， 如强力高速振荡、搅拌、样品反复冻贮等。
基因工程的需要：基因工程疫苗和药物。
核酸提取的一般程序
核酸的提取一般分为两个阶段：
① 裂解细胞：使样品中的核酸游离在裂
解体系中。
② 分离纯化：使核酸与裂解体系中的其
它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻 底分离。
细胞的裂解
分离提取核酸，首先要求核酸从原来的 组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保 持原来的天然状态，不丢生物活性。因此应 选择适当的方法将组织和细胞破碎。但若材 料是体液（如血）或生物体分泌到体外的分 泌物，则不必进行组织细胞的破碎