人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养
人骨髓间充质干细胞体外成骨分化过程中成骨相关基因的动态表达
人骨髓间充质干细胞体外成骨分化过程中成骨相关基因的动态表达目的：系统研究人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）体外成骨诱导分化过程中成骨相关基因的表达变化。
方法：应用密度梯度离心法分离hBMSCs，取第2代细胞通过流式检测及多向诱导分化方法进行干细胞鉴定；应用RT-PCR法对hBMSCs在体外成骨诱导不同时间点的成骨相关基因表达进行检测。
结果：第2代hBMSCs表达间充质干细胞表面标志CD44、CD90，具有成脂和成骨分化潜能。
成骨相关基因在诱导早期部分表达，中期均有表达，基因表达大部分在14天达高峰，与矿化相关的基因表达在21天达高峰。
结论：hBMSCs体外成骨诱导过程中成骨相关基因呈动态表达，其表达时序与成骨细胞生理发育基本相似。
Abstracts:ObjectiveTo investigate the osteogenic related genes expression during in vitro osteogenic differentiation of human bone mesenchymal stem cells (hBMSCs).MethodshBMSCs were isolated by density gradient centrifugation. Surface markers and cell cycle were analyzed by flow cytometry. The multiple differentiation potential of hBMSCs were identified using in vitro osteogenic and adipogenic induction. The osteogenic related genes expression of hBMSCs at different induction time point were evaluated by semiquantitative RT-PCR analysis.ResultsThe hBMSCs were derived from bone marrow and expressed CD44 and CD90, markers of mesenchymal stem cell. The second passage of hBMSCs showed adipogenic and osteogenic differentiation potential. During the osteogenic induction process,hBMSCs expressed part of osteogenic related genes in early stage, and all of them in middle stage.The peak expression of most of genes were on the 14th day, and the mineralization associated genes on the 21st day. ConclusionsThe osteogenic related gene expression of hBMSCs shows a dynamic progress during in vitro osteogenic induction, which is consistent with in vivo development of osteoblast.Key words:hBMSCs;in vitro differentiation;osteogenic genes;expression pattern骨缺损的修补和重建是修复重建外科临床面临的常见问题。
骨髓间充质细胞的提纯和分离、增殖
骨髓间充质干细胞分离及条件培养基在其培养扩增中的作用摘要：【目的】建立一种简便、快速、实用的大鼠骨髓间充质干细胞(mesenehymal stem cells，MSCs)体外分离、纯化和扩增的方法。
【方法】采用贴壁法分离纯化大鼠骨髓MSCs(rMSCs)，并对其形态学特征进行观察，培养时观察条件培养基对rMSCs生长的影响。
【结果】贴壁法能有效地分离rMSCs，采用条件培养液培养，细胞活力好，增殖能力强，对维持细胞正常形态有着重要作用。
【结论】贴壁分离法能成功地进行rMSCs的体外分离，采用爷件培养液建立的rMSCs培养方法有效可行。
关键词：骨髓问充质干细胞／分离和提纯；细胞培养骨髓间充质干细胞(MSCs)是一种成体干细胞，具有较强的可塑性，能被诱导分化为成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、成肌细胞等⋯1，同时发现MSCs还具有独特的免疫调节作用[2-4J。
细胞学、组织学及器官学的研究者均把目光投向MSCs，同时MSCs也受到药理研究者的关注。
MSCs除了可作为组织工程较理想的种子细胞外，也可作为药物作用的靶标或药理研究的工具，利用MSCs体内外生物学性质进行中药作用机理的研究已有众多报道I 。
但由于骨髓中的MSCs含量很低，1 个骨髓单核细胞中仅含有1～2个MSCs~11 J，加之MSCs主要存在于骨内膜_】，要获得满足药物研究所需的数量比较困难。
因此，采用合适的MSCs分离、纯化和扩增的方法是许多研究的重要前提。
1 材料与方法1．1 动物Sprague Dawley(SD)大鼠，性别不限，体质量100～120 g，本校实验动物中心提供，合格证号为SCXK (粤)2003．0001。
1，2 主要试剂低糖Dulbeceo改进的Eagle培养基(1ow glucose Dulbecco’s Modified Ea e Medium，LDMEM)由GIBCO 公司提供；胎牛血清(fetalbovine serum，FBS)由杭州四季青生物工程材料有限公司提供；2．5 g／L胰酶(含0．2 g／L EDTA)由吉诺生物医药技术有限公司提供；HEPES为Sigma产品，广州威佳公司分装；青霉素、链霉素由华北制药有限公司提供；兔抗大鼠CD44、CD54、I 型胶原抗体，生物素化抗生蛋白链菌素复合(Streptavidin．Biotin．Complex，SABC)试剂盒，二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色试剂盒均由武汉博士德公司提供。
临床研究用人间充质干细胞质量评价
临床研究用人间充质干细胞质量评价一、引言人间充质干细胞（MSCs）由于其多向分化潜能、免疫调节特性以及易于体外培养等特点，被广泛用于临床研究。
在众多疾病的治疗中，MSCs 都展现出了巨大的潜力。
然而，要确保其在临床研究中的有效性，首先需要对MSCs的质量进行严格控制和评价。
本文将探讨如何评价临床研究用MSCs的质量。
二、MSCs的质量评价标准1、细胞的纯度和活性：这是MSCs质量评价的核心指标。
纯度是指MSCs中目标细胞的比例，而活性则是指MSCs的增殖能力和分化能力。
2、细胞的遗传稳定性：通过基因测序等方法，可以检测MSCs是否存在基因突变，以及是否存在潜在的致癌风险。
3、细胞的免疫调节特性：MSCs具有免疫调节特性，可以通过抑制免疫反应来降低排斥反应的风险。
因此，评价MSCs的免疫调节特性也是非常重要的。
4、细胞的来源和生产过程：MSCs的来源和生产过程也会对其质量产生影响。
例如，来自患者的自身MSCs可能比来自捐献者的MSCs更适合用于治疗。
同时，生产过程中的质量控制，如无菌操作、细胞培养基的质量等，也会影响MSCs的质量。
三、MSCs质量评价的方法1、细胞形态观察：通过观察MSCs的形态，可以初步判断其是否具有正常的形态学特征。
2、生长曲线测定：通过绘制MSCs的生长曲线，可以评估其增殖能力。
3、细胞表面标志物检测：通过检测细胞表面标志物，可以确定MSCs 的纯度和活性。
4、染色体核型分析：通过染色体核型分析，可以评估MSCs的遗传稳定性。
5、免疫调节特性检测：通过检测MSCs对免疫反应的调节作用，可以评估其免疫调节特性。
6、生产过程质量控制：通过监控生产过程中的关键控制点，可以确保MSCs的生产过程符合质量标准。
四、结论人间充质干细胞（MSCs）在临床研究中的应用前景广阔，但其质量评价是关键环节。
通过对MSCs的纯度、活性、遗传稳定性、免疫调节特性以及生产过程的质量控制等多方面的评价，可以确保其满足临床研究的需求。
人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的分离、体外培养及诱导分化
万方数据
万方数据
人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的分离、体外培养及诱导分化
作者：丛姗， 宋瑾， 张惠娟， 李岩， 白立恒， 曹贵方， CONG Shan， SONG Jin， ZHANG Hui-Juan， LI Yan， BAI Li-Heng， CAO Gui-Fang
作者单位：丛姗,宋瑾,张惠娟,李岩,曹贵方,CONG Shan,SONG Jin,ZHANG Hui-Juan,LI Yan,CAO Gui-Fang(内蒙古农业大学兽医学院/动物组织胚胎学与发育生物学实验室,呼和浩特,010018)， 白立恒,BAI Li-Heng(内蒙古
妇幼保健医院妇产科,呼和浩特,010020)
刊名：
农业生物技术学报
英文刊名：Journal of Agricultural Biotechnology
年，卷(期)：2015,23(1)
引用本文格式：丛姗.宋瑾.张惠娟.李岩.白立恒.曹贵方.CONG Shan.SONG Jin.ZHANG Hui-Juan.LI Yan.BAI Li-Heng.CAO Gui-Fang 人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的分离、体外培养及诱导分化[期刊论文]-农业生物技术学报 2015(1)。
骨髓间充质干细胞的分离与培养：本刊中文部
７ 建 立 大 鼠骨 髓 间 充质 千 细胞 稳 定 分 离培 养
体 系 与鉴 定
２ 密度 梯 度 离 心与 贴 壁 筛选 法 体 外 分离 培 养 胎 儿骨 髓 间充质 干细 胞
杨丽（ 暨南 大学药 学院 中药 学教研 室 ，广 东省 广
州市 ５１ ６３ ） ０ ２
王 美华（ 解放 军军事 医学科学院附属 医院消化
ｄ ｉ ０３ ６ ／ｉ ｎ ６ ３８ ２ ．０ ０ ６ ３ ｏ ｌ ９ ９ ｓ ． ７ —２ ５ １ ． ． ９ ： ｊ ｓ １ ２ ０ ０
中图分类 号： ３ ４２ 文献标识码： Ｒ９ Ｂ 文章编 号： ６ ３８ ２ （０ ００ —１ ３ ・４ １ ７ —２ ５２ １ ）６０ ４ ０ １
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骨髓 间充质 干细 胞 的分 离与培 养 ：本刊 中文部
１ 改 良小 鼠 骨髓 问 充 质干 细 胞 培养 方 法 及 长 效 荧光标 记 的可行 性
异 性 磷 脂 酶 Ｄ 的活 性 与 ｍＲ Ａ 变 化 一 致 ， Ｎ
其表达水平与急性 白血病类型及急性髓系白
血 病 患 者 有 无 肝 脾 和， 淋 巴结 肿 大 有 关 。 或
摘要
背景 ：据作者查新检索 ，国内外有关 急性 白 血病骨髓单个核细胞糖基化磷脂酰肌醇特异 性磷脂酶 Ｄ活性及 ｍＲ Ａ 表达与 白血病类 Ｎ 型 、患 者 肝 脾 淋 巴结 肿 大 关 系 的 报 道 罕 见 。
人骨髓间充质干细胞的培养与鉴定
人骨髓间充质干细胞的培养与鉴定目的分离培养人骨髓间充质干细胞（human bone marrow-derived mesenchymal stem cells，hBMSCs），体外观察其生长特性。
方法采用密度梯度离心结合贴壁培养法自脐血中分离间充质干细胞，倒置显微镜下观察其形态及生长情况；流式细胞仪分析细胞周期并检测细胞表面标志物。
结果纯化的hBMSCs 贴壁生长，呈均一梭形，具有较强的增殖能力，流式细胞仪分析P3代hBMSCs 稳定表达间充质干细胞表面抗原标志CD73，CD90和CD105等。
结论本实验分离培养的hBMSCs具有较强的增殖能力，表达间充质干细胞的表面标记。
Abstract：Objective To isolate and culture human bone marrow derived mesenchymal stem cells（hBMSCs），and to observe biological characteristics of hBMSCs. Methods Bone marrow mononuclear cells were separated by the method of density gradient centrifugation and MSCs were obtained by adhere culture.The cell morphology and their growth characteristics in vitro were observed under an inverted phase contrast microscope and the cell cycles were tested by flowing cytometry. Mesenchymal like stem cells were identified by surface marker with flow cytometry.Results hBMSCs were adhered like a fibroblast morphology and with pool like growth alinement.Flow cytometry showed that the third passage cells were positive for CD73，CD90and CD105 expression.Conclusion The MSCs from bone marrow in this study show great capability of proliferation.Key words：Bone marrow mesenchymal stem cells；Separation；Culture and identification间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是来源于中胚层的具有多向分化潜能的干细胞。
骨髓间充质干细胞培养方法大全
一、四种方法简介及优缺点：骨髓间充质干细胞主要有4种体外分离方法：贴壁筛选法，密度梯度离心法，流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法。
贴壁筛选法是利用细胞贴壁时间及贴壁牢固性的不同逐步将非贴壁细胞和其它杂质细胞去除的一种简单易行的培养MSCS的方法。
贴壁分离培养法分离的MSCS能在体外培养条件下生长良好、可连续传代，体外培养扩增能力较强，其缺点是细胞纯度较低。
此方法简便，冲出骨髓直接培养，然后利用骨髓MSCS 贴壁生长特性，更换培养液逐步去处漂浮生长的造血系细胞即可获得较纯化的MSCS；而且骨髓中的造血干细胞能分泌生长因子和促贴壁物质，可促进MSCS 贴壁生长，因此全骨髓贴壁法更为可取。
密度梯度离心法梯度离心法的核心主要是基于密度梯度离心技术。
梯度离心法是根据骨髓中细胞成分的比重不同，使用淋巴细胞分离液提取单个核细胞，再进行贴壁培养，从而达到分离、纯化MSCS的目的。
Pittenger等的研究发现通过密度梯度离心分离培养的间充质干细胞在第一代时纯度可以达到95%。
常用的分离方法免疫磁珠法，是利用免疫学的技术分离MSCS，分离细胞的纯度高。
Phinney 用一种免疫耗损技术精确地将造血细胞系和内皮细胞系从基质细胞中分离出来，提供了一种能高效的分离纯化间充质干细胞的方法，但目前仍未筛选到真正特异性的细胞表面标记;而且，这两种分离方法的操作对细胞活性都有较大影响，造成MSCS损伤，出现增殖缓慢等问题，这些技术问题很大程度上限制了这两种方法的应用。
因此，如何能简便高效地获得均质性的间充质干细胞和细胞群仍需要继续探索。
分离细疫磁珠分离和流式细胞仪筛选的方法，不仅对细胞活性影响较大，而且操作复杂，价格昂贵。
然而，这些纯化间充质干细胞的方法比较复杂，一般仅限于在各自的实验室应用。
二、具体实验流程1. 免疫磁珠法分离纯化骨髓间充质干细胞：1 实验动物Sd大鼠2 试剂和仪器BSA、荧光标记小鼠抗体x、PE磁珠试剂盒、抗生物素磁珠、MiniMACS分离器及MS分离柱。
人骨髓间充质干细胞体外培养及鉴定
２ ０ ０ ７年 ５月
论
著
・
人 骨 髓 问充 质 干 细 胞 体 外 培 养 及 鉴 定
梁 雪 ， 粟永萍 ， 孔佩艳 ， 陈幸华 ， 彭 贤贵 ， 徐 辉 ， 曾 东风 ， 艾 国平
（ Ｉ ． 第 三军 医大 学附 属新 桥 医院血 液科 ， 重庆 ４ ０ ０ ０ ３ ７ ； ２ ． 预 防 医学 院解 放 军 复 合伤 研 究 所创 伤 、 烧 伤与 复合 伤 国家重 点实 验室 ， 重庆 ４ ０ ０ ０ ３ ８ ）
（ １ ．Ｄ ｅ ｐ ａ ｒ ｔ ｍ ｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｈ ｅ ｍａ ｔ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ，Ｘ ｉ ｎ ｑ ｉ ａ ｏ Ｈ ｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ，Ｔ ｈ ｅ ｈｉ Ｔ ｒ ｄ Ｍｉ ｌ ｉ ｔ ａ ｒ ｙ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ，Ｃ ｈ ｏ ｎ ｇ ｑ ｉ ｎ ｇ ４ ０ ０ ０ ３ ７ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ； ２ ．Ｓ ｔ ａ ｔ ｅ Ｋ ｅ ｙ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｙ ｒ ｏ ｆ Ｔ ｒ ａ ｕ ｍ ａ， Ｂ ｕ ｒ ｎ Ｉ ｎ ｊ ｕ ｒ ｙ ａ ｎ ｄ Ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎ ｅ ｄ Ｉ ｎ ｊ ｕ ｒ ｙ ， Ｍｉ ｌ ｉ ｔ ａ ｒ ｙ Ｃ ｏ ｎ— ｒ ｂ ｉ ｎ ｅ ｄ Ｉ ｎ ｊ ｕ ｙ ｒ Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ， Ｐ ｒ ｅ ｖ ｅ ｎ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ Ｃ ｏ ｌ ￣ ｇ ｅ ， Ｃ ｈ ｏ ｎ ｇ ｑ ｉ ｎ ｇ ４ ０ ０ ０ ３ ８ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
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骨髓间充质干细胞的分离纯化与鉴定
骨髓间充质干细胞的分离纯化与鉴定骨髓间充质干细胞是一类非常重要的细胞种类，它们具有广泛的应用前景，主要用于组织工程、再生医学和免疫治疗等领域。
然而，要在这些应用中实现骨髓间充质干细胞的有效利用，就必须先进行骨髓间充质干细胞的分离纯化与鉴定，以保证获取的细胞具有较大的纯度和生物活性。
骨髓间充质干细胞的分离纯化骨髓间充质干细胞的分离纯化方法主要包括直接培养法、贴壁法、悬浮式培养法等。
其中，直接培养法是一种直接将骨髓细胞培养在培养皿中的方法，通过贴壁式培养，使不同种类的细胞在培养皿上生长，最终使骨髓间充质干细胞附着在培养皿底部，其他细胞则浮于培养液中，从而达到分离骨髓间充质干细胞的目的。
贴壁法则是利用骨髓间充质干细胞具有较好的贴壁性质，将其分离于不贴壁的其他细胞种类中，一般会在6~8小时内附着于培养皿的底部，形成典型的纤维形状。
悬浮式培养法则是将骨髓间充质干细胞分散在培养液中悬浮生长，并加入一些特定因子，使其在悬浮状态下生长和增殖，最终达到分离目的。
骨髓间充质干细胞的鉴定骨髓间充质干细胞的鉴定是指对所分离的骨髓间充质干细胞进行鉴定和确认。
其主要包括形态学、生物学、遗传学和免疫学等多个方面的检测方法。
形态学方面的检测方法主要是通过显微镜观察骨髓间充质干细胞的形态、生长状态和细胞密度等指标进行判断。
生物学方面的检测方法主要包括蛋白质组学、基因组学、代谢学等多个层面的检测指标，以确定其代谢状态、生长状态、分化能力和功能表达等信息。
骨髓间充质干细胞在临床应用中的应用前景骨髓间充质干细胞广泛应用于组织工程、再生医学和免疫治疗等领域。
其中，在组织工程领域，骨髓间充质干细胞可用于修复或重建骨组织、肌肉组织、软骨组织等，并可通过工程化的方法向特定的细胞类型分化，以进一步提高治疗效果。
在再生医学领域，骨髓间充质干细胞可以通过再生医学的手段，促进身体的再生或再生，重建病变组织或器官等。
在免疫治疗领域，骨髓间充质干细胞可以作为免疫干预剂，通过调节机体免疫状态，对肿瘤、自身免疫性疾病等疾病产生治疗效果。
人骨髓间充质干细胞提取方法
人骨髓间充质干细胞提取方法
人骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）的提取方法主要有以下几种：
1. 离心沉积法：通过采集骨髓样本后，使用离心机进行离心，将骨髓中的红白细胞分离，并将沉积在离心管底部的间充质干细胞收集。
2. 粘附法：将骨髓样本放入培养皿中，使细胞在培养皿内粘附并扩增，再通过培养基的更换来去除非粘附的细胞，最终收集纯化的间充质干细胞。
3. 感应细胞培养法：将骨髓样本中的间充质细胞进行体外培养，通过特定的培养基和生长因子的添加，促使间充质细胞分化为间充质干细胞。
4. 密度梯度离心法：通过将骨髓样本在密度梯度离心离心离心，将不同密度的细胞分离，并收集到含有骨髓间充质干细胞的层。
这些方法都可以用于提取人骨髓间充质干细胞，具体选择哪种方法取决于具体实验需求和实验室条件。
人骨髓间充质干细胞体外不同分离与培养方法的比较
作 者 简 介 ： 贤华 ， ，９ １年 出生 。博 士 ， 管 技 师 。 主 要 从 事 临床 刘 女 １７ 主
分子生物学检验专业 。
作 者 单 位 ：０ ０ ９ 北 京 ， 警 总 医 院 ：． 验 科 ，． １０ ３ 武 １检 ２ 医学 工 程科 ，． ３ 烧 伤 整 形 科 通讯作者 ： 白晓 东 ， ｍａ ：ａ ｉ ｔ ｕ ｙｈｏ ＣＷ ．ｎ Ｅ— ｉ ｂｉ ａ ｍ ＠ ａｏ．Ｏ１ ｃ ｌ ｘｏ
Ｃ ２ 、 Ｄ ４表 达 为 阳性 。 Ｃ Ｄ ９Ｃ ４ ｏ照 射 处 理 的 培 养 瓶 结合 采 用 全 骨 髓 贴 壁 法 分 离 培 养 法 获 得 的 骨 髓 干 细 胞 活 性 高 ， 殖 力 强 ， 增 克
隆形 成早 ， 传代时间短。结论
全骨髓 贴壁法和密度梯度离心法均可获得高纯度贴壁 生长 的骨髓 干细胞 ， 中 ｃ 照射处理 其 ｔ ，
成人骨髓间充质干细胞体外培养及其生物学特性鉴定
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人骨髓间充质干细胞的分离、培养和体外定向诱导成类软骨细胞的实验研究
２ １ １ 原 代培 养 ： ． ． 骨髓 单 个 核 细胞 刚接 种 时 ， 细胞 分散 ， Ｃ ＭＳ ｓ与周 围 的血 细胞 相 混 杂 ， 易 区 分 。骨 不 髓 单 个 核 细胞 接 种 ３ｄ ， 壁 ＭＳ ｓ的形 态 逐 渐延 ，贴 Ｃ 伸 成 梭形 ， 即成 纤 维样 细 胞 。８ｄ后 ， Ｃ ＭＳ ｓ进 一 步 伸展 、 增殖 ， 见 ＭＳ ｓ 成 集 落 ， 可 Ｃ 形 随着 集 落 不 断扩 大， 细胞呈放 射状 向周 围扩 展 ， 逐渐 与 邻近 集 落 相汇
—
ｐ ／ 转 铁 蛋 白、 霉 素 １ ０ｐ ｍｌ 链 霉 素 １ ０ ／ ． ｍｌ ｇ 青 ０ ． 、 ／ ０
ｍ１诱 导第 二代 、 四代 、 ） 第 第六 代 ＭＳ ｓ 在倒 置 显微 Ｃ， 镜下 观察均 比较 相 似 ， 导 １ ， Ｃ 变 成 圆形 或 诱 ４ｄ ＭＳ ｓ
多边 形 ， 清晰 ， 核 核周 可见 密集 的黑 色颗 粒 。对 照组 ＭＳ ｓ 明显改 变 。 Ｃ 无
结 论 不 同代 的 ＭＳ ｓ 导 率 无 明 显 差异 ； ＧＦ 浓 度 为 ５ｎ ／ 组 Ⅱ型胶 原 弱 阳 性 ， 适 合 作 为 组 Ｃ 诱 Ｔ 一８ ｇ ｍｌ 不
织 工 程 种 子 细胞 ； 导软 骨 Ｔ 一目 最 适 浓度 为 １ ｇ ｍｌ２ ｇ ｍｌ 诱 ＧＦ ０ｎ ／ 、０ ／ ｎ 【 键 词 】 人 骨髓 间 充质 干 细胞 生 物 学特 性 分 化 关 软 骨 ＴＧ 一口 Ｆ
化成 软骨 细胞 ， 为组 织工程 提供 软骨 种子 细胞 。
１ 材 料 与 方 法 １ １ 材料 ．
２１２ 传代培养 ： ．． 刚传 代 的 细胞 呈 圆形 ， 很快 贴 壁
逐 渐 变 成 长 梭 形 ， 壁 细 胞 均 匀 分 布 ， 态趋 于 同 贴 形
人骨髓间充质干细胞体外分离培养及向血管内皮样细胞分化的研究
（ Ｅ Ｆ ｎ ａｉ ｆ ｒｂａｔｇｏ ｔ ｃｏ ｂ Ｇ Ｖ Ｇ ）ａ ｄｂｓｃｉ ｏｌ ｒｗｈｆ ｔｒ（ Ｆ Ｆ）ｗｔｉ ｎ ｏｈ ｌ ｌ ｅ ｒｗ ｄｕ （ ＭＥ ｂ ｓ ａ ｉ ｎｅｄ ｔｅｉ ｌ ｇｏ ｔ ｍｅ ｉｍ Ｄ Ｍ）ｗ ｒ ｓｄｔ ｄ ｃ ＭＳ ｓｄｆ ｒｎｉｔ ｎ ｈ ａｃｌ ｈ ｅｅｕｅ ｉ ｕ ｅｈ Ｃ ｉｅｅｔ ｉ ｏｎ ａｏ
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ｄｆｅ ｅ ｔａ ｉｎ ｉ ｏ ｂ ｏ ｄ ｖ ｓｅ ｎ ｔ ｅｉ ｌ１ｋ ｅｌ ｎ ｖｔｏ ｉ ｒ ｎ ｉｔｏ ｎｔ ｌｏ ｅ ｓ ｌｅ ｄｏｈ ｌ －ｉ ｅ ｃ ｌ ｉ ｉｒ ａ． ｓ
Ｆ Ｎ ａ—ａ ， Ｉ ｕ Ｆ ，Ｈ Ｎ ａ Ｍｉ ． ｈ ｅｏｄＨ ｓｉ ｌｆＳａ ｘ Ｍ ｄ ａ ｎ ｅ ｉ Ｔｉ ａ Ｅ ＧＨ ｉ ｈ ＬＵ Ｒ ｉ ｅ Ｚ Ａ ＧＫ ｉ 鸭 ＴｅＳｃｎ ｏ ｔ ｈｎ ｉ ｅｉ ｌ ｉ ｒｔ ａｙ ｎ Ｙ — — ｐａｏ ｃ Ｕ ｖ ｓｙ， ｕ
ｏ ｓ Ｔ ｅ ｈ Ｃ ｅｅ ｉ ｌｔｄ ｂ ｅ ｓ ｙ ｇ ａ ｉｎ ｅ ｔ ｆｇ ｔ ｎ ａ ［ ｃ ｔｄ ａ ｄ ｉｅ ｔ ｃ ｔｄ ｉ ｉ ｏ Ｖａｃ ｌ ｒ ｅ ｄ ｔ ｅｉ ｒｗ ｈ ｆｃｏ ｄ ： ｈ ＭＳ ｓ ｗ ｒ ｓ ａｅ ｙ ｄ ｎ ｉ ｒｄ ｅ ｔ ｃ ｎｒ ｕ ａｉ ， ｍｐ ｉ ａｅ ｎ ｄ ｎｉ ａｅ ｎ ｖｔ ． ｓ ｕａ ｎ ｏｈ ｌ ｌ ｇｏ ｔ ａ ｔｒ ｏ ｔ ｉ ｏ ｉ ｆ ｉ ｆ ｒ ａ
骨髓间充质干细胞的体外培养
Ａ ｌ ｔ ｏ ｉｌｆＬｚｏ ｅｉ ｌ ｏｏ ｅ Ｌｚｏ ． ｉ ｕｎ６ ６０ ， ｈｎ ｆ ｉｅ Ｈ ｓ ｔ ｕ ｕＭ ｄ ａ Ｃｌｇ ，ａｈｕ Ｓ ｈａ ０ ０ Ｃ ｉ ｉ ｆ ａｄ ｐａ ｏ ｈ ｃ ｌ ｃ ４ ａ 【 ｂｔ ｃ】 Ｏ ｊｃｖ Ｔ ｓｂｉ ｆ ｓ ｌ ｍ ｔ ｄｗ ｉ ｐｒ ｅａｄｐｒｙｂｎ ａ ｏ ｅ ｎｈｍｌｓ ｍ ｃｌ （ Ｓ ｓ Ａ ｓ ａｔ ｒ ｂｅｔ ｅ ｏｅ ａｌｈａ ｅ ｉｅ ｅ ｏ ｈ ｈｓ ａａ ｎ ｕｉ ｏｅｍ ｒ ｗｍ ｓ ｅｙ ａ ｔ ｅｓＭ Ｃ ） ｉ ｔ ｓ ａｂ ｈ ｃ ｅ ｔ ｆ ｒ ｅ ｅ
・
ｌ Ｏ２ ・ ６
川 学 ２０ ０８年 ｌ 第 ２ （ １ ） Ｓ ｈａ ｅｉ ｌ ｏｒ ｌ２０ ，ｏ．９ Ｎ ．２ ２月 ９卷 第 ２期 ｉ ｌＭ ｄｃ ｕｎ ，０８ Ｖ１２ ． ｏ １ ｃ ｔｌ ａＪ ａ
论 著
红 ， 昌平 ， 晓琳 杜 李 钟
（ 州 医 学 院 附 属 医 院 消 化 内科 ， 川 泸 州 ６６０ ） 泸 四 ４００
【 摘要 】 目的 建立骨髓 问充质干 细胞（ Ｃ） ＭＳ ｓ体外分 离纯化 的方法 ， 索 Ｍ Ｃ 体外培 养的最佳方法 ， 探 Ｓｓ 为细胞工程 学提供 细胞来源。方 法 ①Ｍ Ｃ 的分 离、 Ｓｓ 培养 ： 在无茵条件下取 ３— ４周龄 Ｗｉａ 雄性大鼠四肢骨的骨髓细胞 ， ｓｒ ｔ 采用裂解
及 荧光 染料 后 见 Ｃ ４ 、 Ｄ ０染 色呈 阳 性 ，Ｄ ５染 色呈 阴性 反 应 。 结 论 采 用 裂 解 红 细 胞 与 贴 壁 培 养 法相 结 合 分 离 、 Ｄ４ Ｃ ｇ Ｃ４ 纯
化 Ｍ Ｃ， Ｓ ｓ 可得 到 活 性 和 纯 度 均较 好 的 Ｍ Ｃ 。 Ｓ ｓ
人羊膜间充质干细胞培养方法的改进
人羊膜间充质干细胞培养方法的改进崔冬冰;范安然;何志旭【摘要】目的：建立一种高效分离培养人羊膜间充质干细胞的方法。
方法：分别用酶消化法、传统组织块贴壁法和改进的组织块贴壁法分离出hAMSCs，观察3种方法所获得hAMSCs细胞形态、获得时间，流式细胞学检测其免疫表型；并用不同的诱导体系将hAMSCs向成骨细胞、成神经细胞进行诱导分化，鉴定其分化潜能。
结果：改进的组织块贴壁法获得hAMSCs细胞的纯度更高，传代次数更多，相同的培养时间里，获得的细胞数量是酶消化法的3~4倍，是传统组织块贴壁法的1~2倍；hAMSCs细胞高表达CD73、CD90、CD44和CD105，不表达CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR；茜素红染色和神经元特异性烯醇化酶检测证实hAMSCs细胞可诱导分化为成骨细胞和神经细胞。
结论：改进的hAMSCs分离培养方法可获得较大数量细胞，且保留了向神经细胞或成骨细胞可分化潜能。
%[ Abstract]Objective:To investigate and improve the method of human amnion mesenchymal stem cellsseparation and culture( hAMSCs). Methods:The hAMSCs were established with the methods oftrypsin,collagenase II,traditional and improved tissueattachment,respectively. The cell morphology and the growth time of hAMSCs were observed,and the immunophenotype were also detected with flow cytometry. In addition,hAMSCs were induced to differentiate into osteoblast and neuroblast with dif-ferent system and the derived osteoblast and neuroblast were identified then. Results:The hAMSCs obtained with the improved separation method obtain higher purity and can be passaged more times, and the quantity of obtained hAMSCs can bereached up to 3~4 times of enzyme digestion,and 1~2 times of traditional tissue attachment method within the same culture time;furthermore,the obtained hAMSCs highly express CD73,CD90,CD44 and CD105 while did not express CD11b,CD19,CD34, CD45 and HLA-DR;the alizarin staining and neuron-specific enolase detection demonstrated that hAMSCs could be induced into osteoblast and neuroblast. Conclusions:The methods of hAMSCs sepa-ration and culture are improved and will provide the basis for the research and application of hAMSC.【期刊名称】《贵阳医学院学报》【年(卷),期】2016(041)004【总页数】5页(P414-417,426)【关键词】人羊膜间充质干细胞;细胞培养;鉴定;诱导【作者】崔冬冰;范安然;何志旭【作者单位】贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心，贵州贵阳 550004;贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心，贵州贵阳 550004;贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心，贵州贵阳 550004【正文语种】中文【中图分类】R329.3间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有高度增殖和多向分化潜能的成体干细胞，来源广泛，可从多个器官或组织中分离获得，因具有低免疫原性等特点，而成为细胞疗法的主要种子细胞，有着广阔的应用前景[1]。
人骨髓间充质干细胞的体外连续传代及鉴定
广西 中医学 院学 报
人骨髓间充质干细胞 的体外连续传代及鉴定
岑妍 慧 ， 何国珍 ， 文文 ， 郭 陈 芳， 肖燕 子 ， 玉光 强 ５ ０２ ） ３０ １ （ 广西 医科 大 学 ， 西 南宁 广
摘
要 ： 目的］ ［ 将成人 骨髓 间充质干细胞（ Ｍ ｃ ） ｈ ｓ ｓ进行体 外连 续传代并对其进行干细胞 特性 的鉴定 。 方 法］ 用不连续密 ［ 采
１ 材 料与 方 法
１１ 材 料 ．
１１１ 实验 材料 ．．
骨髓标 本取 自本院 骨髓 检查正 常 的志愿
的培养瓶 中 ， 此时的细胞称为 Ｐ 代细胞。同法进行以后各 代 ｌ 细胞 的传代培养直至传 至 Ｐ 代 。采用 倒置显微镜下逐 日观 ５
察细胞形态 。
者， 性， 男 年龄 ２ ， ２岁 供者对 实验 知情 同意 。 １１ 主要试剂 ．． ２ ＬＤ Ｅ － Ｍ Ｍ培养基 、 Ｄ Ｍ培养基和胎牛 Ｈ— ＭＥ 血清均购 自美 国 Ｇ ｂｏ 司 ；胰蛋 白酶 、 Ｄ Ａ、 一 ｉｃ 公 Ｅ Ｔ Ｂ 甘油 磷酸 钠 、一 丁基一 一 ３异 １ 甲基 黄嘌呤 、 塞米松 、 地 维生素 ｃ均为美 国 Ｓｇ ａ公司产 品 ；ＩＣ标 志 的抗 Ｃ ４ Ａ ２ 抗 Ｃ ０ ｍ ｂ ｉ ｍ ＦＴ Ｄ ４ｍ ｂ 、 Ｄ１５ Ａ 、 抗 Ｃ ２ ｍ ｂ和抗 Ｃ ｇ ｍ ｂ及 其 同型 阴性 对照均 购 自美 国 Ｄ９ Ａ ＤＯ Ａ
ｅｉｓｉｎｅ 司 。 ｂｏｃｅｃ 公
ＭＳ ｓ并通过 观察其形态 学特征 和生长特性 、 Ｃ， 检测 细胞 表面 分子标 志物 的表达情况和验证细胞 向成骨细胞和脂肪细胞分
待原代培养细胞贴培养瓶底 面积达 ６％～０ ０ ７％左右 时 ， 吸
人骨髓间充质干细胞体外分离培养及其生物学特性
Ｔｈ ｓ ｌ ｔｏ ｎ ａ ａ ｔ ｒｚ ｔｏ ｆ Ｈｕ ａ ｎ ａ ｒ ｗ ｅ ｅ ｈ ｍａ ｔ ｍ ｌｓ Ｚ ｅ Ｉ ｏ ａ ｉ ｎ ａ ｄ Ｃｈ ｒ ｃ ｅ ｉ ａ ｉ ｎ ｏ ｍ ｎ Ｂｏ ｅ Ｍ ｒ ｏ Ｍ ｓ ｎｃ ｙ ｌＳ ｅ Ｃｅｌ ＨＥＮ
方法分离人 Ｂ Ｃ ，经传 代后细胞形态呈梭形 ，均匀一致 。② Ｍ 法测 定细胞增 殖和生长 曲线 ＭＳ ｓ 分析结果显示 Ｂ Ｃ 在传代后经历潜伏期 、 ＭＳ ｓ 对数 生长期和平台期 。 流式细胞仪检测显示所获 ③
得的 Ｂ Ｃ 表面抗原标记高度一致 。④ Ｂ Ｃ 细胞周期 检测结果 为 ＭＳ ｓ ０Ｇ 期 １ ２ ．
ｏ ｍｅｅ ｃ ｙ ｌｔｍ ｅｌ ｄ ｒｖｄｆ ｍ ｈ ｍａ ｏ ｅｍａ ｏ ｈ ｆ ｓｎ ｈ ｍａ ｅ ｅ ｌ ｅｉｅ ｒ ｓ ｓ ｏ ｕ ｎｂ ｎ ｌ ｗ（ ＢＭＳ ｓ） Ｓ ｓｏｐ ｖ ｈ ｗａ ｏ ａｃ ｉｇ Ｔ Ｃ ， Ｏａ ｔ ａ ｅｔｅ ｙｆｒ ｅ ｒｈｎ ｓ
ｔ ｅｎ ｗ ｕ ｃ ｆ ｅ ｄ ｃ ｌ ｏ ｅｔ ｓ ｅｅ ｇ ｎ ｅ ｉ ｇＭｅｈ ｄ Ｂ ｎ ｒｏ ｒ ｓ ｉ ｄｆｏ ｉ ｕ ｏ ｈ ｅ ｓ ｒ ｅｏ ｅ ｅｌ ｉ ｂ ｎ ｓ ｕ ｎ ｉｅ ｒｎ ． ｔ ｏ ｓ ｏ ｓ ｓｎ ｉ ｏ ｅｍａ ｒ ｗ ｗｅ ｅｉ ｐ ｒ ｍ ｉ ｍ ｆ ｎ ｅ ｒ ｌ
ｄ ｎ ｔｒ ， ｎ ｎ ｃｅ ｒ ｅ ｌ ｗｅ ｅ ｓ ｌｔｄ ｂ ｅ ｓｔ ｒ ｄ ｅ ｔ ｅ ｔ ｆ ｇ ｔ ｎａ ｄｃ ｈ ｒ ｄｉ ｉ ｏ Ｔ ｅｈ ｇ ｅ ｏ ａｏ ｓ ｍｏ ｏ ｕ ｌ ａ ｌ ｒ ｏａ ｅ ｙｄ ｎ ｉ ｇ ａ ｉ ｎ ｎ ｆ ｕ ａｉ ｎ ｕ ｕ ｅ ｖｔ ． ｈ ｉｈ ｒ ｃ ｓ ｉ ｙ ｃ ｉ ｏ ｎ ｒ ｐ ｒ ｙｏ ｕ ｔ ｆ ｉ ＢＭＳ ｓ ｒ ｂ ａｎ ｄｂ ｅ ｐ ｎ ｅ ｄ ｅ ｅ ｔ ｅｌ ｎ ｍｏ ａ ｆ ｏ ａ ｈ ｒ ｎ ｅｌ ｒｐ ａｅ ｌ ． ３ Ｃ ｅ ｔｉ ｅ ｙｋ ｅ ｉ ｇｔ ｈ ｒ ｎ ｌ ａ ｄｒ ｗｅ ｏ ｈ ａ ｃ ｓ ｅ ｖ ｌ ｎ ｄ ｅｅ ｔ ｌ ｅ ｔｄｙ Ｐ ｏｎ ｃ ｓｅ
骨髓间充质干细胞分离与培养技术
上述四种分选方法中，由于FACS和MACS分选 法的细胞通量较低,难以满足临床BMSCs应用研究
中细胞用量较大的需要，同时经过了磁场或电场的 作用难以评估对细胞功能的影响程度。所以，目前
在临床试验中应用的BMSCs分离技术还是以差速 贴壁法和梯度离心法为主［I2］o
2骨髓间充质干细胞的鉴定
低氧环境会降低BMSCs体外生长时细胞内氧化应 激物浓度、减少DNA损伤、延缓细胞衰老并维持细 胞分化能力[26] 0
3.2接种、传代及冻存:细胞接种密度是BMSCs体
外扩增时的重要问题。在骨髓细胞悬液的初代培养
中,差速贴壁法分离时一般多以1 X106 ~2x106个/ cm2进行接种[2-3]，密度梯度离心法分离时以约1 x
取合适的技术才能最大程度地减少BMSCs研究的 差异性0
1.1差速贴壁法：差速贴壁法是传统的BMSCs分 离方法，它利用了 BMSCs与骨髓中其他细胞的贴壁
性能差异及酶消化敏感性差异而逐步达到纯化扩增
［基金项目］国家自然科学基金青年项目(81701856) ［作者单位］1•中国人民解放军空军军医大学基础医学院学员一大
1.2密度梯度离心法:密度梯度离心法是针对骨髓
中不同细胞的大小和密度差异进行分选。骨髓细胞
梯
面，
使得不
同类型细胞沉降至其等密度点，然后吸取特定位置
富集的细胞。在离心分层时,红细胞及多核细胞因
比重(1.080 g/mL)较大而沉降于底部，其次是单个
核细胞(包括BMSCs、造血干细胞、单核细胞等)，悬
浮密度位于(1.053 -1.075 )g/mL,血浆及其溶解物
分别以电场和磁场形式施加作用力而分离目的细
胞。在实际应用中.MACS操作简单而快速,细胞通 量高，成本相对低，对细胞活性影响低，但是无法同
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万方数据ＩＳＳＮ１６７３—８２２５ＣＮ２１．１５３９／Ｒ赵凌云，等人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养ｗｗＭ．ｚｇｌｃｋｆ，ｃｏｍｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ０引言骨髓间充质干细胞是具有形成骨、软骨、脂肪、神经和成肌细胞能力的多种分化潜能的细胞亚群，取材方便，易于体外扩增，可进行自体移植，而不存在组织配型和免疫排斥的问题，被认为是骨组织工程中最佳的种子细胞。
本实验目的在于建立一种可行的骨髓间充质干细胞取材和分离扩增的培养方法。
１材料和方法设计：开放性实验。
单位：解放军济南军区总医院脊髓修复科。
材料：实验于２００６—０２／１２在解放军济南军区总医院脊髓修复科完成。
骨髓来源于解放军济南军区总医院脊髓修复科收治的脊髓完全性损伤患者，对本实验均知情同意。
基础培养液由含体积分数为０．１５胎牛血清和低糖仪一ＭＥＭ配置。
低糖ｄ－ＭＥＭ培养基（Ｈｙｃｌｏｎｅ）；淋巴细胞分离液（密度１．０７７ｇ／ｍＬ，上海试剂二厂生产）；胰蛋白酶，胎牛血清（Ｇｉｂｉｃｏ）；Ｃ０２培养箱（上海力申科学仪器有限公司，ＨＦ９０）；生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司，ＨＦｓａｆｅ一１２００／ｃ）；倒置显微镜（Ｌｅｉｃａ）；离心机（ＪＯＵＡＮＢ４ｉ多功能台式机）。
设计、实施、评估者：设计、实施为第一作者，评估为第二、三作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。
方法：骨髓间充质干细胞的分离及传代培养：在无菌条件下，以含５ｍＬ肝素钠生理盐水的２０ｍＬ注射器，于患者髂后上棘穿刺抽取骨髓组织６ｍＬ，移入含５ｍＬ肝素钠生理盐水的试管内，混匀，而后沿管壁缓慢加入含１０ｍＬ淋巴细胞分离液的离心管中，２０００ｒ，ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，小心吸取界面层细胞，用Ｄ—Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液洗２次，２０００ｒ／ｍｉｎ离心８ｍｉｎ，加入基础培养液，血细胞计数板计数，调整细胞的浓度，将细胞悬液按１０９—１０１０Ｌ－１接种于培养瓶，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２饱和湿度孵箱中培养。
于培养后的两三天更换培养液，并用Ｄ－Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液冲洗２次，以去除未贴壁的造血细胞，以后每３ｄ换液一次，进一步去除未贴壁的细胞。
观察细胞生长情况，待细胞融合成片、长满培养瓶底部后，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶流过所有细胞表面，盖好瓶盖，将培养瓶放在倒置显微镜下观察，发现细胞变圆，部分脱壁，控制消化时间不超过３ｍｉｎ，立即加入２ｍＬ有血清培养液终止消化，用弯头吸管轻轻吹打细胞生长区域，吹打过程中不要用力，结束后再用少量培养液漂洗一遍，然后加入适５６５０量培养液计数，分别接种在新的培养瓶内。
骨髓间充质干细胞的生长曲线的绘制：取第３代生长状态良好的细胞，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种至２４孔培养板，３孔／组，细胞１×１０４／孔，每孔加入培养液１ｍＬ，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２孵箱中培养。
以细胞数为纵坐标，时间为横坐标，绘制细胞生长曲线。
骨髓间充质干细胞贴壁率的测定：取第３代生长状态良好的细胞，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种至２４孔培养板，３孔／组，细胞１×１０４／孔，每孔加入培养液１ｍＬ，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２孵箱中培养，每隔２ｈ进行细胞贴壁率检测。
主要观察指标：①骨髓间充质干细胞的形态学观察。
②骨髓间充质干细胞的生长曲线。
③骨髓间充质干细胞的贴壁率。
统计学分析：由第一作者采用ＥＳＡ４．０软件进行统计处理，数据以娃ｓ表示。
２结果２．１骨髓间充质干细胞的形态学观察倒置显微镜下，骨髓间充质干细胞接种１ｄ即贴壁，２ｄ时贴壁细胞较多。
经冲洗和换液去除悬浮细胞后，贴壁细胞继续培养３ｄ开始增殖，伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等（图１）。
至１４ｄ细胞密集在集落中心，基本铺满瓶底，第３～５代细胞呈均匀一致的长梭型，排列成旋涡状或放射状（图２）。
图１原代培养的骨髓间充质干细胞贴壁后３ｄ开始增殖，伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等（倒置显微镜，ｘ２０）２．２骨髓间充质干细胞的生长曲线骨髓间充质干细胞传代后３ｄ内处于潜伏期，３ｄ后进入生长期，７ｄ后进入平台期。
第３代骨髓间充质干细胞生长曲线见图３。
Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１２００。
Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０００４ｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍｗｗｗ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ 万方数据 万方数据人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养作者：赵凌云， 钱淑琴， 赵廷宝， Zhao LY， Qian SQ， Zhao TB作者单位：解放军济南军区总医院脊髓修复科,山东省济南市,250031刊名：中国组织工程研究与临床康复英文刊名：JOURNAL OF CLINICAL REHABILITATIVE TISSUE ENGINEERING RESEARCH年，卷(期)：2007，11(28)被引用次数：1次1.Lisignoli G.Remiddi G.Cattini L An elevated number of differentiated ostteoblast colonies can be obtarined from rat bone marrow stromal cells using a gradient isolation procedure 2001(01)2.张本斯.王凡.邓力大鼠骨髓间充质干细胞的分离纯化与初步鉴定[期刊论文]-中国组织化学与细胞化学杂志2003(02)3.Zohar R.Sodek J.Mcculloch CA Characterization of stromal progenitor cells enriched by flow cytometry 1997(09)4.Encina NR.Billotte WG.Hofmann MC Immunomagnetic isolation of osteoprogenitors from human bone marrow stroma 1999(04)5.刘晓丹.郭子宽.李秀森人骨髓间充质干细胞分离与培养方法的建立[期刊论文]-军事医学科学院院刊 20006.Hattan N.Kawaguchi H.Ando K Purified cardiomyocytes from bone marrow mesenchymal stem cells produce stable intracardiac grafts in mice 2005(02)7.李秀森.郭子宽.刘晓丹人间充质干细胞的培养及向软骨细胞分化[期刊论文]-解放军医学杂志 2002(12)8.付文玉.路艳蒙.朴英杰人骨髓间充质干细胞的培养及多能研究[期刊论文]-中华血液学杂志 2002(04)9.冯凯.裴雪涛间充质干细胞--现代组织工程的新资源 2000(06)10.艾国平.粟永萍.闫国和骨髓间充质干细胞的分离与培养[期刊论文]-第三军医大学学报 2001(05)11.付文玉.路艳蒙.朴英杰人骨髓间充质干细胞的分化与端粒酶活性[期刊论文]-第一军医大学学报 2001(11)12.李秀森.郭子宽.杨靖清骨髓间充质干细胞的生物学特征[期刊论文]-解放军医学杂志 2000(05)13.路艳蒙.付文玉.朴英杰人骨髓间充质干细胞的培养及性质鉴定[期刊论文]-第一军医大学学报 2001(08)14.D'lppolito G.Schiller PC.Perez-Stable C Cooperative actions of hepatocyte growth factor and 1,5-dihydroxyvitamin D3 in osteoblastic differentiation of human vertebral bone marrow stromal cells 2002(02)15.Stamm C.Westphal B.Kleine HD Autologous bone-marrow stem-cell transplantation for myocardial regeneration 2003(9351)16.郭子宽.刘晓丹.李秀森人骨髓间充质干细胞体外分化为神经元样细胞[期刊论文]-中国实验血液学杂志2001(01)nge C.Bassler P.Lioznov MV Hepatocytic gene expression in cultured rat mesenchymal stem cells 2005(01)18.Wang D.Park JS.Chu JS Proteomic profiling of bone marrow mesenchymal stem cells upon transforming growth factor beta1 stimulation 2004(42)1.学位论文袁军正常及再障模型小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定2007目的：骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMMSCs)是骨髓中造血干细胞之外的另一类干细胞。
它具有极高的横向分化和复制能力，在不同诱导条件下具有多向分化潜能。
目前常用于培养骨髓间充质干细胞的方法主要有全骨髓培养法和密度梯度分离法。
前者简单易行，将骨髓全部接种，利用干细胞贴壁时间短，通过换液达到分离、纯化的目的；后者是将淋巴细胞分离液分离出的单个核细胞接种。
目前尚无一种标志物能作为MSCs的身份特征，国际上通常采用多种CD分子的组合综合界定。
MSCs是正常造血功能赖以存在和发挥功能的必要支持，因而在再生医学领域中有着广泛的应用前景。
本实验以小鼠骨髓为MSC来源，旨在摸索有效、可行的骨髓间充质干细胞的分离、培养方法，对所培养的BMMSC进行鉴定，并检测这种培养法的产率。
临床上恶性血液病患者经反复放、化疗，常出现骨髓造血恢复延迟，有较长时间的低细胞期。
研究表明：骨髓恢复延迟可能与骨髓基质损伤有关。
BMMSC是骨髓基质的组成之一，故我们利用小鼠研究BMMSC损伤时的分离、培养，并观察此时小鼠BMMSC的状况，为临床治疗方面提供新的思路。
方法：1、动物：选用清洁级4～6周龄BALB/c(H-2<'d>)小鼠(雌雄各半)为骨髓细胞来源。
清洁级4～6周龄DBA/2(H-2<'d>)小鼠(雌雄各半)为免疫细胞来源，饲养于无菌层流柜中。
2、MSC的分离和培养全骨髓培养贴壁筛选法：将BALB/c小鼠颈椎脱臼处死，超净台内无菌分离小鼠股骨及胫骨，以CCM(完全培养基，为F12-DMEM培养液，含青霉素100μg/ml、链霉素100μg/ml、hEPES液0.03mol/L以及10％FBS)冲洗骨髓腔，轻柔吹打冲洗液，制成单细胞悬液，直接接种于25cm<'2>一次性无菌塑料培养瓶中，为P0(Passage 0)代。