核酸的分离与纯化
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＊pH ＊温度 ＊酶
控制pH在4.0~10.0
避免高温，核酸提取一般在0℃-4 ℃
避免DNA酶对DNA的降解
避免RNA酶对RNA的降解
核酸分离的技术路线 核酸释放
核酸分 离纯化
浓缩、沉淀 与洗涤
二、技术路线的设计
1.核酸的释放
机械法
液体剪切法
固体剪切法
破碎细胞
干燥法 非机械法
溶胞法 （方法温和）
• 酚抽提法
• 甲酰胺解聚法
• 玻棒缠绕法 • 其他方法
一、酚抽提法
“酚抽提法”原理
• 溶解细胞膜和核膜，释放核蛋白，使DNA 与组蛋白分离：蛋白酶Ｋ、EDTA、SDS、 RNA酶 • 去除生物样本中的蛋白质和RNA：饱和酚、 氯仿 • 沉淀获得基因组DNA：无水乙醇 • 去除残留的试剂：70%乙醇
试剂及作用
裂解液
Tris-HCL---缓冲液 EDTA----二价金属离子螯合剂，抑制DNA酶活性 SDS-----表面活性剂，使裂解细胞膜核膜 使DNA释放，蛋白质变性
试剂及作用 蛋白酶K----消化蛋白质
RNA酶---使RNA降解 酚试剂-----分相，使蛋白质变性沉淀
试剂及作用
二、技术路线的设计
2.核酸的分离与纯化
细胞裂解物 复杂混合物 去除污染 非核酸的大分子污染物 提取核酸
非需要的核酸分子
对后续实验有影响的试剂
二、技术路线的设计
3.核酸的浓缩、沉淀与洗涤
浓缩----沉淀是最常用的方法 沉淀----有机溶剂法
乙醇、异丙醇、聚乙二醇等
洗涤----70%~75%的乙醇（去除盐）
三、核酸的鉴定与保存 （一）核酸的鉴定
完整性
凝胶电泳
核酸
浓 度 纯 度
紫外分光光度法
&
荧光光度法
（一）核酸的鉴定
1.浓度鉴定 （1）紫外分光光度法
核酸分子在260nm有最大吸收峰
C双链DNA = 50μg/ml 当A260=1 OD时 C单链DNA = 40μg/ml
C单链RNA = 40μg/ml
提取DNA的原则
纯度 尽量去除生物样本中 除核酸以外的其它分 子物质，保证提取核 酸的纯度。 完整 尽量简化操作步骤， 减少各种破坏核酸的 有害因素，保证提取 核酸的完整性。
提取DNA的原理
溶解细胞膜和核膜，释放核蛋白，并使DNA与 组蛋白分离；
去除生物样本中的蛋白质和RNA，沉淀获得基 因组DNA； 去除残留的试剂，从而获得具有一定纯度的 DNA样品
（一）核酸的鉴定
完整DNA电泳图
降解DNA电泳图
三、核酸的鉴定与保存
（二）核酸的保存
1.DNA的保存 2.RNA的保存
（二）核酸的保存
低温保存
缓冲液 避免反复冻融 小量分装
第二节 基因组DNA的分离与纯化
DNA的理化性质
• • • • • DNA为白色纤维状固体； 很长的线性分子，容易断裂； 在溶液中粘度较大，沉淀后较难溶解； 含有磷酸基团、碱基，可两性解离； 磷酸基团的酸性很强， pI较低。
2）操作者
3）实验器材
手套与口罩
一次性材料，严格消毒
4）器皿与溶液 用DEPC处理
实验一 基因组DNA的提取与纯化
注意事项！！！
• 1. 应尽量使用新鲜的实验材料，以确保提取的 基因组 DNA 不被降解。 • 2. 酚试剂具有腐蚀性及刺激性，操作时请带手 套并注意防护，避免沾染皮肤和眼睛等。 • 3.在两相分离操作中，请务必除尽带色有机相， 否则将影响 DNA的制备。 • 4. RNase A1 需在-20℃ 保存。 • 5. 基因组 DNA 需长期保存时，应在缓冲液中低 温保存。
无水乙醇--- 沉淀DNA
70%乙醇---洗涤残余盐离子
TEபைடு நூலகம்冲液---溶解DNA
核酸的分离与纯化
质粒DNA的提取与纯化
——碱裂解法、煮沸裂解法、SDS裂解法
总RNA的提取与纯化 ——异硫氰酸胍-酚氯仿 一步法
RNA制备的条件与环境
1、Rase（RNA酶）广泛存在
2、Rase（RNA酶）活性稳定 3、避免Rase 1）空气 实验室环境
分子生物学检验技术
核酸的分离与纯化
第一节 核酸分离与纯化的设计原则
DNA 蛋白质
核酸
RNA
核蛋白
一、材料与方法的选择
1.常见的标本：血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等
2.选择原则：
＊保证核酸一级结构的完整性。 ＊尽量排除其他分子的污染，保证其纯度。
一、材料与方法的选择 3.如何保持核酸的完整性
DNA分离提取的流程（Process）
生物体组织细胞 细胞裂解蛋白质变性沉 淀降解DNA释放 前处理
酚抽提法
玻棒缠绕法 基因组 DNA粗品
甲酰胺解聚法 粗分离
AGE分离
PFGE分离 特定的DNA片段
PAGE分离
精分离 离子交换层析纯化
有机溶剂抽提 乙醇沉淀洗涤
基因组DNA纯品
提取DNA的方法(真核细胞)
污染：DNA A260/A280﹥1.8 提示有RNA污染 ﹤ 1.8 提示有蛋白质或酚的污染
（一）核酸的鉴定
2.纯度鉴定
（2）荧光光度法----用EB等荧光染料示踪核酸电泳
通常：纯的DNA 纯的RNA 污染：有杂带
分子较RNA大，迁移率低 总RNA有三条特征性区带
（一）核酸的鉴定
DNA电泳
RNA电泳
（一）核酸的鉴定
1.浓度鉴定
（2）荧光光度法
荧光染料溴化乙锭（EB）可使核酸 分子在紫外线照射下激发橙红色荧光
凝胶电泳 & 荧光光度法
（一）核酸的鉴定
2.纯度鉴定
（1）紫外分光光度法---A260/A280比值 通常：纯的DNA A260/A280=1.8 纯的RNA A260/A280=2.0
（一）核酸的鉴定
（一）核酸的鉴定
3.完整性鉴定：凝胶电泳法 完整： DNA RNA 分子较RNA大，迁移率低 总RNA有三条特征性区带
28S RNA 荧光强度为18S RNA的2倍
降解： DNA 电泳图呈拖尾状
RNA 总RNA特征性区带荧光强度改变
（一）核酸的鉴定
真核生物RNA电泳的三条特征性区带
控制pH在4.0~10.0
避免高温，核酸提取一般在0℃-4 ℃
避免DNA酶对DNA的降解
避免RNA酶对RNA的降解
核酸分离的技术路线 核酸释放
核酸分 离纯化
浓缩、沉淀 与洗涤
二、技术路线的设计
1.核酸的释放
机械法
液体剪切法
固体剪切法
破碎细胞
干燥法 非机械法
溶胞法 （方法温和）
• 酚抽提法
• 甲酰胺解聚法
• 玻棒缠绕法 • 其他方法
一、酚抽提法
“酚抽提法”原理
• 溶解细胞膜和核膜，释放核蛋白，使DNA 与组蛋白分离：蛋白酶Ｋ、EDTA、SDS、 RNA酶 • 去除生物样本中的蛋白质和RNA：饱和酚、 氯仿 • 沉淀获得基因组DNA：无水乙醇 • 去除残留的试剂：70%乙醇
试剂及作用
裂解液
Tris-HCL---缓冲液 EDTA----二价金属离子螯合剂，抑制DNA酶活性 SDS-----表面活性剂，使裂解细胞膜核膜 使DNA释放，蛋白质变性
试剂及作用 蛋白酶K----消化蛋白质
RNA酶---使RNA降解 酚试剂-----分相，使蛋白质变性沉淀
试剂及作用
二、技术路线的设计
2.核酸的分离与纯化
细胞裂解物 复杂混合物 去除污染 非核酸的大分子污染物 提取核酸
非需要的核酸分子
对后续实验有影响的试剂
二、技术路线的设计
3.核酸的浓缩、沉淀与洗涤
浓缩----沉淀是最常用的方法 沉淀----有机溶剂法
乙醇、异丙醇、聚乙二醇等
洗涤----70%~75%的乙醇（去除盐）
三、核酸的鉴定与保存 （一）核酸的鉴定
完整性
凝胶电泳
核酸
浓 度 纯 度
紫外分光光度法
&
荧光光度法
（一）核酸的鉴定
1.浓度鉴定 （1）紫外分光光度法
核酸分子在260nm有最大吸收峰
C双链DNA = 50μg/ml 当A260=1 OD时 C单链DNA = 40μg/ml
C单链RNA = 40μg/ml
提取DNA的原则
纯度 尽量去除生物样本中 除核酸以外的其它分 子物质，保证提取核 酸的纯度。 完整 尽量简化操作步骤， 减少各种破坏核酸的 有害因素，保证提取 核酸的完整性。
提取DNA的原理
溶解细胞膜和核膜，释放核蛋白，并使DNA与 组蛋白分离；
去除生物样本中的蛋白质和RNA，沉淀获得基 因组DNA； 去除残留的试剂，从而获得具有一定纯度的 DNA样品
（一）核酸的鉴定
完整DNA电泳图
降解DNA电泳图
三、核酸的鉴定与保存
（二）核酸的保存
1.DNA的保存 2.RNA的保存
（二）核酸的保存
低温保存
缓冲液 避免反复冻融 小量分装
第二节 基因组DNA的分离与纯化
DNA的理化性质
• • • • • DNA为白色纤维状固体； 很长的线性分子，容易断裂； 在溶液中粘度较大，沉淀后较难溶解； 含有磷酸基团、碱基，可两性解离； 磷酸基团的酸性很强， pI较低。
2）操作者
3）实验器材
手套与口罩
一次性材料，严格消毒
4）器皿与溶液 用DEPC处理
实验一 基因组DNA的提取与纯化
注意事项！！！
• 1. 应尽量使用新鲜的实验材料，以确保提取的 基因组 DNA 不被降解。 • 2. 酚试剂具有腐蚀性及刺激性，操作时请带手 套并注意防护，避免沾染皮肤和眼睛等。 • 3.在两相分离操作中，请务必除尽带色有机相， 否则将影响 DNA的制备。 • 4. RNase A1 需在-20℃ 保存。 • 5. 基因组 DNA 需长期保存时，应在缓冲液中低 温保存。
无水乙醇--- 沉淀DNA
70%乙醇---洗涤残余盐离子
TEபைடு நூலகம்冲液---溶解DNA
核酸的分离与纯化
质粒DNA的提取与纯化
——碱裂解法、煮沸裂解法、SDS裂解法
总RNA的提取与纯化 ——异硫氰酸胍-酚氯仿 一步法
RNA制备的条件与环境
1、Rase（RNA酶）广泛存在
2、Rase（RNA酶）活性稳定 3、避免Rase 1）空气 实验室环境
分子生物学检验技术
核酸的分离与纯化
第一节 核酸分离与纯化的设计原则
DNA 蛋白质
核酸
RNA
核蛋白
一、材料与方法的选择
1.常见的标本：血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等
2.选择原则：
＊保证核酸一级结构的完整性。 ＊尽量排除其他分子的污染，保证其纯度。
一、材料与方法的选择 3.如何保持核酸的完整性
DNA分离提取的流程（Process）
生物体组织细胞 细胞裂解蛋白质变性沉 淀降解DNA释放 前处理
酚抽提法
玻棒缠绕法 基因组 DNA粗品
甲酰胺解聚法 粗分离
AGE分离
PFGE分离 特定的DNA片段
PAGE分离
精分离 离子交换层析纯化
有机溶剂抽提 乙醇沉淀洗涤
基因组DNA纯品
提取DNA的方法(真核细胞)
污染：DNA A260/A280﹥1.8 提示有RNA污染 ﹤ 1.8 提示有蛋白质或酚的污染
（一）核酸的鉴定
2.纯度鉴定
（2）荧光光度法----用EB等荧光染料示踪核酸电泳
通常：纯的DNA 纯的RNA 污染：有杂带
分子较RNA大，迁移率低 总RNA有三条特征性区带
（一）核酸的鉴定
DNA电泳
RNA电泳
（一）核酸的鉴定
1.浓度鉴定
（2）荧光光度法
荧光染料溴化乙锭（EB）可使核酸 分子在紫外线照射下激发橙红色荧光
凝胶电泳 & 荧光光度法
（一）核酸的鉴定
2.纯度鉴定
（1）紫外分光光度法---A260/A280比值 通常：纯的DNA A260/A280=1.8 纯的RNA A260/A280=2.0
（一）核酸的鉴定
（一）核酸的鉴定
3.完整性鉴定：凝胶电泳法 完整： DNA RNA 分子较RNA大，迁移率低 总RNA有三条特征性区带
28S RNA 荧光强度为18S RNA的2倍
降解： DNA 电泳图呈拖尾状
RNA 总RNA特征性区带荧光强度改变
（一）核酸的鉴定
真核生物RNA电泳的三条特征性区带