第2讲 基因工程菌的发酵
第2讲 基因工程菌的发酵
发酵生产 目的：
1、获得大量外源基因产物 2、减少宿主细胞本身蛋白质的污染
要求外源基因高水平表达
宿主、载体和克隆基因之间的相互关系及其 所处的环境条件
1 培养基的影响
培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持重组质粒 的稳定性，使外源基因能够高效表达。
①碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖及果糖等。 ②氮源：酵母粉、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆和氨水、硫酸
素等
二、基因工程菌发酵所用设备
基因工程菌的培养设备
（1）发酵罐的组成：发酵罐体、搅拌器、温控、灭
菌系统、空气无菌过滤系统、参数测量与控制系统、以 及培养液配制及连续操作装置等。
（2）基因工程菌对发酵设备的要求：
既要防止外部微生物侵入罐内，还要不使培养 物外漏。
机械搅拌式发酵罐气升式发Βιβλιοθήκη 罐三、基因工程菌的培养工艺
基因工程菌发酵的特点：
Ø特点：
1. 发酵产物比常规菌更纯粹和单一 2. 能大幅度提高产物的含量 3. 能合成生产外源基因编码的产物
基因工程菌的应用：
• 1. 基因工程药物的生产 例如：胰岛素、干优素、乙肝疫苗、生长激素、
粒细胞巨噬细胞集落刺激因子等。
2. 其它发酵产品的制备 例如：酶制剂、氨基酸（苏氨酸、色氨酸）、抗生
思考题？
v 为什么基因工程菌的发酵液在外排之前，必须要 进行灭活处理?
谢谢聆听！
会使菌体生长过快，代谢产物累积过多，反而会抑制后期菌体的生长；
3
温度的影响
在复制水平上 在转录水平上 在其他方面
通过调控复制改变基因剂量来影响基因表达 通过影响RNA聚合酶作用来调控基因表达 在mRNA降解和翻译水平上影响基因表达
基因工程大肠杆菌发酵的研究ppt课件
• 要同时解决这两个问题是比较困难的，目前不少 基因工程研究研究室或生产厂对于这类菌的发酵 均遇到上述同类的问题，即菌体密度不高和表达 量低，他们为了得到足量菌体只好采用扩大发酵 体积，显然不是良策，因为含PL启动子的工程菌 在发酵过程中发酵体积越大（500～1000L），其 表达效率愈低，并大大增加了抽提分离表达产物 的工作量、设备投资、运转费及污水处理量。
• 三、基因工程菌 • 干扰素α-2b PL启动子氨苄青霉素抗性基因；降 钙素/JM103氨苄青霉素抗性基因；鱼生长激素 Trp启动子氨苄青霉素抗性基因.K8899/C600氨苄 青霉素抗性基因。
人干扰素α-2b
四、设备
• • 径高比：1:2~3； 装料系数: 70%； 罐体耐高温、耐酸碱、耐腐蚀的硅 硼玻璃罐与材质为进口316L的不 锈钢组合体；不锈钢内抛光精度 Ra≤0.8；特别设计的AQ保护装置， 无任怎样操作玻璃罐永不破碎； 搅拌系统：顶式机械搅拌，机械密 封。采用316L不锈钢专用搅拌轴 材料，精密加工，刚性好，长期使 用不变形； 灭菌：在位/离位灭菌；设置灭菌 程序，灭菌温度100-130℃； 接种：酒精火焰接种和插针接种； 控制系统：德国西门子PLC控制核 心+进口触摸屏；
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生产型发酵罐： 夹套：设计压力0.3 Mpa，夹套材质： 304不锈钢，用于温控、辅助灭菌；采 用优化导流设计，提高了交换效率和罐 内温度的均匀性； 进气过滤：采用一路深层通气质量流量 计显示，采用精度为0.2μm的进口除菌 过滤器，配空气分布器，防倒流装置； 确保安全并可独立灭菌，大大延长使用 寿命； 电机：采用德国汉森公司的调速电机 （加强型冷却装置，确保电机能在恶劣 的环境中长期运行）； 调 速 器：日本变频调速器 专用无菌取样阀：在位灭菌、微量取样 不染菌，无死角，不积料，使用方便； 专用无菌放料阀：在位灭菌、材质特制， 可无杂菌放料，无死角，不积料，使用 方便； 灭菌：蒸汽在位灭菌。设置灭菌程序， 灭菌温度100-130℃； 移种：316L不锈钢光亮管，隔膜阀。 在位灭菌； 控制系统： 德国西门子PLC控制核心+ 工业平板电脑；
基因工程菌发酵
成并导致减产。
温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。
（4）溶解氧的影响
对于好氧发酵,溶解氧浓度是重要的参数。 好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。若 能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高发酵产率。 发酵时，随DO2浓度的下降，细胞生长减慢，ST值下 降，发酵后期下降幅度更大。 外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细胞的呼 吸作用，提高对氧的需求。 维持较高的DO2值，才能提高工程菌的生长，利于外 源蛋白产物的形成。 采用调节搅拌转速的方法,可改变培养过程中的氧供 给，提高活菌产量。
原核:包涵体,分泌型
真核:穿梭质粒
质粒(plasmid) 载体 粘粒(cosmid) λ噬菌体(λ phage)
细菌：氯化钙；电穿孔;
细胞：磷酸钙；脂质体；电穿孔；微注射；V
动物：微注射；电穿孔；精子；ESC；RT-V 核酸鉴定：PCR; Southern and Northern blot. 蛋白鉴定：SDS-PAGE; HPLC; Western blot. 功能检测：机体生理生化功能、性状的改变。
DNA接头连接法
（三）目的基因导入受体细胞
（四）转化细胞的筛选及表达产物的鉴定
1、重组体的筛选 2、表达产物的鉴定
α 互 补 的 检 测
二、基因工程菌的发酵
• 就生产流程而言，从发酵到分离、纯化目
标产物，工程菌和常规微生物并无太多的 差异。但工程菌在保存过程中及发酵生产 过程中表现出不稳定性，以及安全性等问 题，使得工程菌的培养有着自身所特有的 特点。
（一）质粒的稳定性
1、质粒不稳定的类型
• 分离性不稳定：这是由于在细胞分裂过程 中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质 粒丢失。 • 结构性不稳定：这是由于重组质粒DNA发 生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化
《发酵工程》课程教学大纲
《发酵工程》课程教学大纲（Ferment Engineering）课程编号：1913022课程类别：专业课适用专业：生物技术先修课程：微生物生物学、生物化学、遗传学后续课程：生物工程下游技术总学分：2 其中实验学分：0总学时：32教学目的与要求：生物技术在21世纪会成为带动人类社会经济发展的关键技术之一，这是国内外各界人士得到的共识。
其中，微生物的生物技术由于其发展迅速，给人类带来巨大经济利益，以及对其他生物技术的重要影响，一直处于生物技术的领先地位。
随着微生物技术快速发展，微生物技术已走出了曾给其带来里程碑转折的发酵罐时期，广泛用于发酵罐以外形式的环境保护、细菌冶金、细菌勘探和能源开发等领域，特别是基因工程菌的大量产生和使用，因而用“发酵工程”一词更能准确地概括所有微生物的应用领域。
发酵工程的主体是利用微生物生长代谢活动产生的各种生理活性物质来生产商业产品。
这项工程需要微生物学、生物化学、化学工程学、遗传学和市场营销学等相关学科来共同营建。
面对21世纪市场经济发展的大潮，需要有更多交叉学科知识的人才来参加发酵工程的研究、开发、生产和市场营销。
在本科生的教学中，发酵工程课程起到掌握专业技能的作用，即把微生物学、生物化学、化学工程学、遗传学和市场营销学等相关学科的原理和方法综合运用到生命科学的研究上。
课程以课堂讲授为主，主要阐明发酵工程的基本原理、基本方法；阐明发酵工艺过程控制、发酵产物的提取与精制工程；阐明发酵工程常用设备；阐明发酵工程中的清洁生产与发酵工程废水净化。
通过该课程学习，力求使学生系统地掌握发酵工程的基本知识、基本原理和基本规律，并能运用这些知识和手段解决生产中的理论问题和实际问题，同时，为学好相关专业课程奠定必要的基础。
教学内容与学时安排导言（2学时）一、发酵工程概念与研究范围二、现代发酵工程与生物工程的关系三、发酵工程的产业领域四、发酵工程的未来教学基本要求：了解第一章发酵的基础知识（5学时）第一节发酵方法的类别与发酵流程一、方法的类别厌氧和有氧发酵。
基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术
基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术生物工程下游技术实验模块实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术创建人：时间：2013-04-17 【点击数： 482】实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术1．实验目的（1）掌握工程菌大规模培养及高密度发酵技术的原理。
（2）学习工程菌高密度发酵的技术方法。
2．实验原理重组大肠杆菌的高密度培养是增加重组蛋白产率的最有效的方法，高密度发酵在增加菌密度的同时提高蛋白的表达量，从而有利于简化下游的纯化操作。
重组大肠杆菌高密度培养受表达系统、培养基、培养方式、发酵条件控制等多种因素的影响，在实际操作中需要对各种因素进行优化，建立最佳的发酵工艺。
发酵工艺优化的研究可通过每次改变一个因素或同时改变几个参数来进行，然后运用统计学分析寻找它们之间的相互作用。
工程菌提高分裂速度的基本条件是必须满足其生长所需的营养物质，因此，培养基成分和浓度的选择就成为首要解决的问题，在成分选择上，要尽量选取容易被工程菌利用的营养物质，例如，普通培养基中一般是以葡萄糖为碳源，而葡萄糖需经过氧化和磷酸化作用，生成1，3-二磷酸甘油醛，才能被微生物利用，即用甘油作为培养基的碳源可缩短工程菌的利用时间，增加分裂增殖的速度。
目前，普遍采用6g/L的甘油作为高密度发酵培养基的碳源。
另外，高密度发酵培养基中各组分的浓度也要比普通培养基高2～3倍，才能满足高密度发酵中工程菌对营养物质的需求。
当然，培养基浓度也不可过高，因为过高会使渗透压增高，反而不利于工程菌的生长。
补料的流加方式直接影响着发酵的效果。
分批补料培养的特点是，在培养过程中不断补充培养基，使菌体在较长时间里保持稳定的生长速率，从而达到高密度生长。
但是在补料流加过程中既不能加入得过快，也不能加入得过慢。
过慢则无法满足逐渐增加的菌体生长需要，同时也使培养过程中产生的抑制性副产物大量积累；而过快则使携带目的蛋白的质粒没有充裕的时间复制，降低目的蛋白的表达量；而且快速的细菌生长还易引发质粒的不稳定性。
基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术
生物工程下游技术实验模块实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术创建人：时间：2013-04-17 【点击数： 482】实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术1．实验目的（1）掌握工程菌大规模培养及高密度发酵技术的原理。
（2）学习工程菌高密度发酵的技术方法。
2．实验原理重组大肠杆菌的高密度培养是增加重组蛋白产率的最有效的方法，高密度发酵在增加菌密度的同时提高蛋白的表达量，从而有利于简化下游的纯化操作。
重组大肠杆菌高密度培养受表达系统、培养基、培养方式、发酵条件控制等多种因素的影响，在实际操作中需要对各种因素进行优化，建立最佳的发酵工艺。
发酵工艺优化的研究可通过每次改变一个因素或同时改变几个参数来进行，然后运用统计学分析寻找它们之间的相互作用。
工程菌提高分裂速度的基本条件是必须满足其生长所需的营养物质，因此，培养基成分和浓度的选择就成为首要解决的问题，在成分选择上，要尽量选取容易被工程菌利用的营养物质，例如，普通培养基中一般是以葡萄糖为碳源，而葡萄糖需经过氧化和磷酸化作用，生成1，3-二磷酸甘油醛，才能被微生物利用，即用甘油作为培养基的碳源可缩短工程菌的利用时间，增加分裂增殖的速度。
目前，普遍采用6g/L的甘油作为高密度发酵培养基的碳源。
另外，高密度发酵培养基中各组分的浓度也要比普通培养基高2～3倍，才能满足高密度发酵中工程菌对营养物质的需求。
当然，培养基浓度也不可过高，因为过高会使渗透压增高，反而不利于工程菌的生长。
补料的流加方式直接影响着发酵的效果。
分批补料培养的特点是，在培养过程中不断补充培养基，使菌体在较长时间里保持稳定的生长速率，从而达到高密度生长。
但是在补料流加过程中既不能加入得过快，也不能加入得过慢。
过慢则无法满足逐渐增加的菌体生长需要，同时也使培养过程中产生的抑制性副产物大量积累；而过快则使携带目的蛋白的质粒没有充裕的时间复制，降低目的蛋白的表达量；而且快速的细菌生长还易引发质粒的不稳定性。
基因工程菌发酵操作流程
基因工程菌发酵操作流程1.检查发酵车间是否达到发酵要求(所以设备处于待用状态)。
2.通知蒸汽车间按时送符合要求蒸汽。
3.种子罐基础培养基的领料及定容配制。
4.种子罐的PH、DO电极的校正安装和补料口堵头更换。
5.种子罐进料，调PH。
6.种子罐基础培养基在位灭菌，同时灭移种管道上段。
7.种子罐冷却后可连接酸、碱、消泡剂补料瓶。
8.种子罐培养基温度、PH(需进一步校准)、罐压、消泡达到发酵条件。
通知菌种室准备菌种转接。
9.无菌操作将种子罐所需MgSO4、Amp转入菌种转换罐。
10.种子罐扩增培养发酵阶段需平稳控制罐压、PH、DO、温度、消泡。
11.大罐基础培养基领料及配制。
12.大罐PH、DO电极校正安装及补料口堵头的更换。
13.大罐进料、定容、调PH；碱罐碱液的配制。
14.大罐基础培养基在位灭菌，同时对移种管道、进料管道、补料管道、碱罐及碱管道上段的灭菌。
15.大罐基础培养基温度降至发酵温度后再次校准PH、DO。
连接补料瓶调节至发酵条件。
16.无菌操作将大罐所需MgSO4、Amp转入菌种转换罐并转入种子罐。
17.利用压力差将种子罐里的种子液移接到大罐。
18.补碱时，将管道上阀门打开。
程序设为自动，控制流量。
19.补料罐补料培养基的领料定容配制。
20.补料罐补料培养基在位灭菌，同时对管道上段灭菌。
21.补料时，将管道上阀门打开。
程序设为自动，设置流量。
22.诱导剂领料，在配料罐中加水配制定容。
23.将诱导剂打入种子罐，灭菌后保持罐压。
24.利用压力差将种子罐里的诱导剂移接到大罐。
25.一段时间后，大罐的PH、DO呈上升形态即为发酵结束，可放罐离心。
芽孢杆菌发酵操作流程1.检查发酵车间是否达到发酵要求(所以设备处于待用状态)。
2.通知蒸汽车间按时送符合要求蒸汽。
3.种子罐基础培养基的领料及定容配制。
4.种子罐的PH、DO电极的校正安装和补料口堵头更换。
5.种子罐进料，调PH。
6.种子罐基础培养基在位灭菌，同时灭移种管道上段。
基因工程菌的高密度发酵研究
基金项目 作者简介
收稿日期
山西农业大学青年创新基金项目（ ２００５０７） 。 尹淑琴（ １９７９－ ） ， 女， 山西兴县 人， 硕 士， 助 教， 从事 生物 化学 与 分 子 生 物 学 研 究 。＊ 通 讯 作 者 ， 教 授 ， 硕 士 生 导 师 。Ｔｅｌ： ０３５４－ ６２８６９０８， Ｅ－ ｍａｉｌ： ｃｈａｎｇｈｏｎｇ５２３＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ。 ２００７! ０１! １１
普通培养基中一般是以葡萄糖为碳源， 葡萄糖浓度过 高抑制细胞的生长。李寅等在高密度生产谷胱甘肽中考察 了 ＷＳＨ ＫＥ１ 对葡萄糖 浓度 的 耐 受 性 及 其 对 葡 萄糖 的 消 耗 能力， 发现初糖浓度超过 ２０ ｇ／Ｌ 即对 ＷＳＫ ＫＥ１ 细胞生长和 ＧＳＨ 合成起抑制作用［４］。洒荣波等在重组菌 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ的 培养中发现当葡萄糖浓度大于 ４ ％时， 菌体密度随其浓度 的 升 高 而 降 低 ［５］。同 时 已 有 人 用 甘 油 代 替 葡 萄 糖 作 为 细 菌 生 长的碳源， 以减少代谢抑制物质— ——乙酸的积累， 更易达到 重组菌的高密度和外源蛋白的高表达。用甘油作为培养基 的碳源可缩短工程菌的利用时间， 增加分裂繁殖的速度。 ＮＯ３－ 、胰蛋 白 胨（ Ｔｒ） 、酵 母 提 取 物（ Ｙｅ） 作 为 氮源 有 利 于 细 胞 的生长。比如， 在硅藻类（ Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ ｌａｅｖｉｓ） 高密度培养过程中 提 高 十 二 碳 五 烯 酸 ＥＰＡ 的 产 量 时 ， ＮＯ３－∶Ｔｒ∶Ｙｅ 的 最 佳 比 例 为 １∶２．６∶１．３， Ｇｌｕ∶ＮＯ３－ 的最佳比例为 ３２∶１［１］。有些营养物质在 高密度培养过程中可以控制细胞的死亡率， 曾有报道在非 洲绿猴肾成纤维细胞系培养过程中， 加入半乳糖和谷胱甘 肽 可 以 阻 止 细 胞 程 序 性 死 亡 ［６］。
基因工程菌发酵
基因工程菌发酵、表达与纯化
一、原理
基因工程菌是利用基因重组技术构建的生物工程菌，带外源基因的重组载体，通过生物工程菌的发酵获得大量的外源基因产物,并尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染，所以需要对影响外源基因表达的因素进行分析,探索出一套适于外源基因高效表达的发酵、表达和纯化工艺。
二、仪器
发酵罐、SDS-PAGE电泳仪
三、试剂
LB培养基（包括Yeast Extract、Polypeptone等）、琼脂、甘油
四、实验步骤
1. 在LB 培养基中加入细菌培养用琼脂(15 g/L ) 铺平皿, 用接种环划线接种甘油管基因工程菌菌种, 30℃培养过夜；
2. 挑取单菌落接种于含5 m l LB (含50ug/mL Amp ) 的试管中, 30℃、120 rpm摇菌培养到OD600 为0.2-0.8；
3. 取1 mL于另一试管中42℃培养3 小时, 离心收集菌体；
4. 以10%的接种量上发酵罐发酵培养；
5. 接种LB培养液诱导表达，采用SDS-PAGE电泳分析其表达量；
6. 据基因工程菌表达产物的不同采用不同的分离纯化方法，如盐析、层析、萃取等。
五、注意事项
在基因工程菌的发酵过程中，培养基的种类、pH值、培养的温度及接种量和发酵时间都会对其发酵效果及表达产物的分离纯化产生不同的影响，所以应多次试验进行全方面的优化。
基因工程大肠杆菌发酵的研究
讨论
• 含PL启动子的 启动子的E.coli工程菌的表达及温度敏感株 启动子的 工程菌的表达及温度敏感株 活菌疫苗的生产要求细菌在较低的温度（ ℃ 活菌疫苗的生产要求细菌在较低的温度（30℃） 发酵增殖，在一定时间内提高菌体密度， 发酵增殖，在一定时间内提高菌体密度，然后迅 速提高温度诱导目的产物的表达。 速提高温度诱导目的产物的表达。 • 这类菌表达产物的表达量取决于两个因素：一是 这类菌表达产物的表达量取决于两个因素： 在30℃发酵过程中尽可能提高菌体密度；二是快 ℃发酵过程中尽可能提高菌体密度； 速升温诱导。 速升温诱导。
• 科学家们把人的胰岛素基 因送到大肠杆菌的细胞里， 因送到大肠杆菌的细胞里， 让胰岛素基因和大肠杆菌 的遗传物质相结合。 的遗传物质相结合。人的 胰岛素基因在大肠杆菌的 细胞里指挥着大肠杆菌生 产出了人的胰岛素。 产出了人的胰岛素。并随 着它的繁殖， 着它的繁殖，胰岛素基因 也一代代的传了下去， 也一代代的传了下去，后 代的大肠杆菌也能生产胰 岛素了。 岛素了。这种带上了人工 给予的新的遗传性状的细 被称为基因工程菌。 菌，被称为基因工程菌。
• 二、生物工程下游技术的必要性 近年来，不少基因工程药物、疫苗、 近年来，不少基因工程药物、疫苗、 酶制剂及某些检测试剂，如人（ 酶制剂及某些检测试剂，如人（牛、猪） 生长激素、 （ ， ）干扰素、链激酶、 生长激素、α-（β-，γ-）干扰素、链激酶、 凝乳酶、葡激酶、白细胞介素、人胰岛素、 凝乳酶、葡激酶、白细胞介素、人胰岛素、 肿瘤坏死因子、表皮生长因子、心房肽、 肿瘤坏死因子、表皮生长因子、心房肽、 降钙素、仔猪腹泻疫苗、 型肝炎检测试 降钙素、仔猪腹泻疫苗、C-型肝炎检测试 剂等都是应用基因工程大肠苗菌进行生产 的。
基因工程产业化除上游构建工程菌之外， 基因工程产业化除上游构建工程菌之外，下 游必须建立生产规模的发酵工艺、离心、 游必须建立生产规模的发酵工艺、离心、细胞破 目的产物的分离、纯化、 碎、目的产物的分离、纯化、恢复表达产物的天 然结构使之具有生物活性， 然结构使之具有生物活性，有的表达产物还需进 一步加工修饰， 一步加工修饰，如人胰岛素原的化学切断与酶切 降钙素C-末端的酰胺化修饰 末端的酰胺化修饰， 断，降钙素 末端的酰胺化修饰，以及质量控制 等，没有这些下游技术的建立就没有基因工程产 品。
第十章_基因工程菌发酵
平均细胞近似
均衡生长 细胞之间不均一
离 散 模 型
不考虑细胞 结构，但各 种细胞均一
细胞内部多组分
非离散、非结构模型（均衡生长模型）
假设培养体系是均一的，忽略细胞间的差异和不同时期组 成及代谢特性的差异
适于研究细胞群体代谢生长代谢规律
离散非结构模型
培养体系中的细胞被区分成许多不同的状态和功
质粒的行为规律与宿主、质粒本身外界环 境等密切相关
工程菌培养过程中会发现质粒丢失现象，
严重影响外源基因产物的产量和质量
分配的不稳定性
原
结构不稳定性
因
质粒不同拷贝状态
分配不稳定：这是由于在细胞分裂过程中质 粒缺失分配到子细胞中而导致整个质粒丢失。
结构性不稳定：由于重组质粒DNA发生缺失、 插入或重排引起的质粒结构变化。
使用酚时应注意
1）使用注意
酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或
黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。
变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核
酸的磷酸二酯键。 2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手 套。
10.5 基因工程菌的不稳定性及对策
不稳定的表现 不稳定的原因及对策
能类型，对培养过程中细胞存在明显差异的系统
是适合的。
结构非离散模型
细胞被分散成多个不同功能的部分，各部分相 互协调作用，对分析胞内代谢调控有应用价值。
离散结构模型
细胞培养过程的实际情况，模拟单个细胞内 的生化反应体系，通过单细胞模型的不同组 合建立高层次的离散结构模型
10.1.2 基因工程菌培养过程中的动力学模型
《基因工程菌发酵》PPT课件
整理ppt
12
分批培养中选择不同的碳源，连 续培养中控制稀释速率等都能一定范 围内控制菌体的生长，从而控制乙酸 的产生，减少它的抑制作用。
加入蛋氨酸和酵母提取物都能减 少乙酸的产生。
整理ppt
13
大肠杆菌中克隆携带氧能力的 VHB蛋白的基因可提高菌体生长 速率。
采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为 宿组主细胞，阻止乙酸产生，可提 高产量。
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它的浓度增加会导致在合成mRNA和 rRNA时RNA聚合酶在模板上的移动产生 停顿，RNA链延长速度减慢，使游离的 RNA聚合酶浓度降低，严紧控制的启动 子如rrnA等的转录减少。
也可能ppGpp是通过干扰RNA聚合酶 与PL启动子专一识别反应。
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18
第七节基因工程菌发酵
基因工程菌的培养过程包括: ⑴通过摇瓶操作基因工程菌生长的基 础条件,如温度、pH、培养基各种组分、 碳氧比，分析表达产物的合成、积累 对受体细胞的影响; ⑵通过培养罐操作确定培养参数和控 制方案以及顺序。
高拷贝质粒的工程菌（240拷贝） 中，生长速率和菌体总蛋白合成均减 少。这与工程菌大量前体被利用引起 前体不足，从而产生“严紧反应”有 关。
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16
“严紧反应”是当氨酰tRNA不 足时,核糖体在密码子上停留,并合 成被称为魔点的ppGpp的结果。
ppGpp是一个重要的调控分子。 它通过影响RNA链的延深过程减少 转录。
对于好氧发酵,溶解氧浓度是重 要的参数。
好氧微生物利用溶解于培养液 中的氧气进行呼吸。
若能提高溶氧速度和氧的利用 率，则能提高发酵产率。
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发酵时，随DO2浓度的下降， 细胞生长减慢，ST值下降，发酵后 期下降幅度更大。
基因工程大肠杆菌发酵的研究
基因工程大肠杆菌发酵的研究基因工程大肠杆菌发酵是一种高效的生物工程技术，广泛应用于医药、食品、化工等领域。
该技术利用基因工程手段，将外源基因导入大肠杆菌中，使其表达出所需的蛋白质或其他代谢产物。
本文旨在探讨基因工程大肠杆菌发酵的研究现状、实验方法、实验结果及分析，以期为相关领域的研究提供参考。
基因工程大肠杆菌发酵的研究已经取得了长足进展。
国内外研究者通过基因改造、代谢工程、细胞工程等手段，成功地实现了多种外源基因在大肠杆菌中的表达。
这些外源基因产物包括抗体、疫苗、胰岛素、生长因子等具有重要应用价值的蛋白质。
同时，基因工程大肠杆菌发酵在提高产量、优化发酵条件等方面也取得了显著成果。
基因工程大肠杆菌发酵的实验方法主要包括以下步骤：接种：将经过基因改造的大肠杆菌接种至含有适量营养物质的液体培养基中。
培养：在适宜的温度和pH条件下，进行静置培养或搅拌培养，以利于微生物的生长和繁殖。
提取：经过离心、过滤等手段，将大肠杆菌细胞分离出来，并将其中的目标蛋白质或代谢产物提取出来。
实验方法具有操作简单、易于大规模生产等优点。
然而，该方法也存在一定的局限性，如发酵过程中可能出现的杂菌污染、产物稳定性不足等问题，需进一步完善。
通过基因工程大肠杆菌发酵实验，我们成功地实现了目标蛋白质的表达能力提高，并优化了发酵条件，提高了产量。
经过对发酵液的成分进行分析，发现目标蛋白质的表达量占大肠杆菌总蛋白的30%以上，说明表达水平较高。
同时，我们发现经过基因改造的大肠杆菌在发酵过程中的生长速度和细胞密度均得到显著提高。
实验结果表明，基因改造的大肠杆菌在发酵过程中表现出优良的性能。
通过对比实验，我们发现经过基因改造的大肠杆菌比未经过改造的大肠杆菌的目标蛋白质表达量高出数倍。
我们发现基因改造的大肠杆菌在发酵过程中的生长速度和细胞密度也得到显著提高，这为提高目标产物的产量奠定了基础。
然而，实验结果也表明该方法存在一些不足之处。
虽然目标蛋白质的表达量较高，但仍有部分大肠杆菌细胞未表达目标蛋白质，这可能影响到产物的纯度和收率。
基因工程菌的发酵研究
《生物工程进展》1997,V o l.17,N o.2基因工程菌的发酵研究李会成 李文辉 郭 军 刘利民(哈尔滨市医药工程技术研究开发中心 150020)摘要 本文对大肠杆菌表达的rhG M-CSF工程菌的发酵条件进行了详细的研究,探讨了发酵条件对工程菌表达外源蛋白量的影响,优化了影响发酵的各种条件,形成了一套工程菌发酵表达外源蛋白的工艺,并从工业化角度对工程菌的高密度高表达间的关系进行了探讨。
关键词 工程菌发酵 外源蛋白 高密度 高表达 利用基因重组技术构建的生物工程菌的发酵工艺不同于传统的发酵工艺,就其选用的生物材料而言,前者含有带外源基因的重组载体;而后者是单一的微生物细胞;从发酵工艺考虑,生物工程菌的发酵生产之目的是希望能获得大量的外源基因产物,尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染,外源基因的高水平表达,不仅涉及宿主,载体和克隆基因三者之间的相互关系,而且与其所处的环境条件息息相关,因此仅按传统的发酵工艺生产生物制品是远远不够的,需要对影响外源基因表达的因素进行分析,探索出一套适于外源基因高效表达的发酵工艺。
一、材料与方法111 材料重组工程菌系本所保存,宿主菌为E.co li DH5a。
Yeast Ex tract,Po lypep tone均为OX I OD 公司产品,其它所需试剂均为国产分析纯试剂。
112 方法11211 摇床条件下培养:30℃,120rpm培养到OD600达012-018时,水浴升温到42℃,继续培养3小时,取1m l离心收集菌体,做SD S2 PA GE分析。
11212 rh G M2CSF表达量测定用常规SD S-PA GE分析,用Phar m acia公司激光扫描仪扫描分析。
SD S2PA GE方法按文献(1)方法做。
11213 发酵采用美国NB S公司的40L发酵罐,按操作说明书操作。
11214 菌体测量采用称重法和浊度法。
11215 9501批发酵不添加任何营养物,9502批,高密度发酵都采用流加工艺,补加有机营养。
《基因工程菌发酵》课件
通过将目标基因插入宿主菌株的染色体，实现对目标基因的表达和调控。
2
发酵过程
利用菌株进行发酵过程，通过代谢产物合成目标化合物。
3
纯化和提取
通过有效的纯化和提取技术，获取目标化合物的高纯度。
基因工程菌发酵的优势
1 高效
菌体能够高效合成目标化合物，提高生产效率。
2 可控
通过基因调控和发酵条件优化，可以精确控制产品成分和质量。
总结和展望
基因工程菌发酵是一项具有广泛应用和巨大潜力的技术，将在医药、工业、 环境和农业等领域继续发展和创新。
《基因工程菌发酵》PPT课件
通过深入浅出的解释和精美的图片，本课件将详细介绍基因工程菌发酵的背 景、原理、应用领域以及发展前景。
背景介绍
基因工程菌发酵是一种重要的生物工艺技术，利用基因工程手段改造菌株， 通过发酵生产目标物质。
基因工程菌发酵的定义
基因工程菌发酵是指利用重组DNA技术构建具有特定基因组的菌株，并通过 菌体生物代谢过程来合成目标化合物的过程。
3 环保
利用菌株的生物降解能力，减少废弃物产生和环境污染。
基因工程菌发酵的发展前景
创新性
基因工程菌发酵将会不断结合新 技术和新领域，推动科技创新。
研究和发展
越来越多的研究机构和企业投入 基因工程菌发酵领域的研究和开 发。
生物技术发展
基因工程菌发酵是生物技术发展 的重要方向之一，有着广阔的应 用前景。
基因工程菌发酵的应用领域
制药业
利用基因工程菌发酵生产药物，提高药物生产 效率和纯度。
环境治理
利用基因工程菌发酵进行废水处理和有机废弃 物降解。
工领域
利用基因工程菌发酵生产化工原料和生化产品， 替代传统化工合成过程。
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思考题？
v 为什么基因工程菌的发酵液在外排之前，必须要 进行灭活处理?
谢谢聆听！
基因工程菌发酵的特点：
Ø特点：
1. 发酵产物比常规菌更纯粹和单一 2. 能大幅度提高产物的含量 3. 能合成生产外源基因编码的产物
基因工程菌的应用：
• 1. 基因工程药物的生产 例如：胰岛素、干优素、乙肝疫苗、生长激素、
粒细胞巨噬细胞集落刺激因子等。
2. 其它发酵产品的制备 例如：酶制剂、氨基酸（苏氨酸、色氨酸）、抗生
Combinatorial Biosynthesis and Drug Discovery
一、前 言
什么是基因工程菌?
——主要是指以微生物为操作对象，通过基因工程技术 获得的表达外源基因的工程生物。也称为重组菌。
如：重组大肠杆菌、重组酵母菌等
作为基因工程菌的条件：
1. 发酵产品是高浓度、高转化率和高产率的。 2. 菌株能利用常用的碳源，并可进行连续发酵。 3. 菌株不是致病株，也不产内毒素。 4. 代谢控制容易进行。 5. 重组的DNA不易脱落。
素等
二、基因工程菌发酵所用设备
基因工程菌的培养设备
（1）发酵罐的组成：发酵罐体、搅拌器、温控、灭
菌系统、空气无菌过滤系统、参数测量与控制系统、以 及培养液配制及连续操作装置等。
（2）基因工程菌对发酵设备的要求：
既要防止外部微生物侵入罐内，还要不使培养 物外漏。
机械搅拌式发酵罐
气升式发酵罐
三、基因工程菌的培养工艺
细胞自身对pH具有一定调节能力，但当外界条件变化过于激 烈时，细胞失去自身调节能力，从而影响细胞的正常生长。
如采用两阶段培养工艺： ①培养前期阶段：着重于优化工程菌的最佳生长条件 ②培养后期阶段：着重于优化外源蛋白的表达条件
总之：必须建立工程菌发酵的最佳化工艺。
即指：
①最快周期最周全的废物处理效果 ⑦最低失败率等综合指标。
16℃和18℃培养时，菌体生长较慢，从而影响翻译，即酶的合 成。
4 溶解氧的影响
溶解氧（Dissolved oxygen,DO2）：是工程菌发酵培养过
程中影响菌体代谢的一个重要参数，溶解氧浓度对菌体生长和 产物生成的影响很大。
发酵前期，随DO2的下降，细胞生长减慢，ST (surface tension) 值下降； 发酵后期，随DO2的下降，ST值下降幅度更大，外源基因高水平转录和翻
铵、硝酸铵、氯化铵等。 ③其他：无机盐、微量元素、维生素、生物素等，营养缺陷型菌 株还要补加相应的营养物质。
2 接种量的影响
① 什么是接种量?——移入的种子液体积和培养液体积之 比。 ② 接种量的大小对发酵有什么影响?
答：影响发酵的产量和发酵周期， （1）接种量小，菌体生长的延迟期长，不利于外源基因的表达； （2）接种量大，有利于对基质的利用，可以缩短生长延迟期，但
会使菌体生长过快，代谢产物累积过多，反而会抑制后期菌体的生长；
3
温度的影响
在复制水平上 在转录水平上 在其他方面
通过调控复制改变基因剂量来影响基因表达 通过影响RNA聚合酶作用来调控基因表达 在mRNA降解和翻译水平上影响基因表达
温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。
例如：大肠杆菌合成青霉素酰化酶不仅受苯乙酸诱导和葡萄 糖阻碍，还受温度调控。
发酵生产 目的：
1、获得大量外源基因产物 2、减少宿主细胞本身蛋白质的污染
要求外源基因高水平表达
宿主、载体和克隆基因之间的相互关系及其 所处的环境条件
1 培养基的影响
培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持重组质粒 的稳定性，使外源基因能够高效表达。
①碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖及果糖等。 ②氮源：酵母粉、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆和氨水、硫酸
译，细胞 需要更大的能量，需维持较高水平的DO2值(≥40%)，以促进细胞 的呼吸作用，也更利于外源蛋白产物的形成。
Ccr：临界氧浓度，指不影响呼吸所允许 的最低氧气浓度。
5 诱导时机的影响
一般在对数生长期或生长对数期后期开始诱导表达 因为此期菌数量多，生长旺盛。
7
pH的影响
pH的变化 ——主要是由工程菌的代谢、培养基的组成、发酵条件来决定。