生化实验技术与方法
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度应加入酶粗提液中的硫酸铵量，并称硫酸铵。（240g/L) （2）将酶液倒入烧杯内，边缓慢搅拌边缓慢加入称好的固体硫酸铵，
待全部加完后，再缓慢搅拌10min；然后于9000r离心15min，保 留上清液于烧杯内。 （3）根据硫酸铵饱和度用量表，算出从38%到75%饱和度所需硫酸铵 用量。 （222g/L) （4）按上述（2）步同法处理，离心后，弃去上清液，保留沉淀。 （5）将沉淀溶于2ml酶抽提液中,留样 0.5ml 。 透析脱盐
9
纯化
离子交换层析-------DEAE纤维素 （1）称取DEAE纤维素52干粉1~1.5g，加20ml的0.02mol/L磷 酸盐缓冲液（pH8.0）浸泡4h以上（或浸泡过夜）。 （2）装柱：把预处理的DEAE纤维素52装柱。装柱完成后， 用2~3个床体积的0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH8.0）洗脱平衡 该柱。
11
❖ 取试管2支，按表中所述（0号为调零管，1号为测定管。 注意按表格从上到下的顺序加入试剂）。（单位：ml）
试剂类型
调零管（0号） 待测管（1号）
pH8.7的0.1mol/L硼酸缓冲液 3
2
0.1mol/L L-苯丙氨酸溶液
0
1
样品（酶）溶液
0.1
0.1
将各管混匀，放入40℃恒温水浴保温1h（准确计时），到时 各加0.2 ml 2 mol/LHCl终止反应。 紫外分光光度于波长290nm处测定1号管的A290。
糖的薄层层析
❖ 实验原理
❖ 薄层层析是一种微量而快速的层析方法。该法是把 吸附剂或支持剂涂布在玻璃板上成为一薄层，将要 分析的样品滴加到薄层上，然后用合适的溶剂进行 展开，使样品各个成分分离，然后进行定性鉴定和 定量测定。
❖ 根据原理的不同薄层层析通常有4种类型：吸附薄
层层析，分配薄层层析，离子交换薄层层析和薄层
protein）
硫酸铵沉淀
透析
离子交换层析
可编辑ppt
14
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS－PAGE）测定蛋白质分子量
（3）上样：把所得的酶洗脱液小心地注入柱床面中央，上样 结束后，在床面以上小心地加入0.02mol/L磷酸盐缓冲液2~3cm 厚液层。注意上样开始就收集流出液。
（4）洗柱：约用2倍床体积的A液（0.02mol/L磷酸盐缓冲液） 及B液（含1mol/LNaCl 的0.02mol/L磷酸盐缓冲液）洗柱， 按 洗脱管编号，取A280值高的管中洗脱液测其PAL的活力；合并 主要含有PAL活力的各管洗脱液，并量出其体积（ml）。
3. 点样：样品为鼠李糖、木糖和葡萄糖。点样量 8-10μl。注意：点样点的直径小于5mm，点样要 少量多次，吹风机风力不能过大。
4. 展层：展层溶剂为：乙酸乙酯：甲醇：乙酸： 水=12：3：3：2（体积比），新鲜配制。 5. 显色：显色剂：苯胺-二苯胺-磷酸试剂。
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3
30mm 20mm
DEAE纤维素52
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7
操作步骤
酶液提取 （1）植物材料2g，剪成小段，加入5倍体积的酶提取液，于冰浴上用
研钵研磨。 （2）将已匀浆的酶液转入离心管，4000r冷冻离心30min。 （3）取离心后的上清液（酶粗提液），量出其体积，留样 0.5ml 。 硫酸铵分级沉淀酶蛋白 （1）根据实际体积、温度和硫酸铵饱和度用量表，算出达到38%饱和
酶液装入透析袋，放入低盐溶液中透析过夜,留样 0.5ml 。
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8
银杏叶2g +10ml酶提取液研磨 4000rpm、
30min 取上清液 加硫酸铵至饱和度38%
9000rpm、15min 取上清液 加硫酸铵至饱和
度75% 9000rpm、15min 取沉淀 溶于
2ml酶抽提液 透析
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❖ 本次实验是以银杏叶为原料采用分步盐析、透析 脱盐、离子交换等方法得到苯丙氨酸解氨酶。
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6
仪器 高速冷冻离心机；恒温水浴；电子天平；柱层析系统
试剂
酶提取液：0.1mol/L硼酸-硼砂缓冲液（含 1mmol/LEDTA、20mmol/Lβ-巯基乙醇）
固体硫酸铵
0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH8.0，含0.5mmol/LEDTA， 2.5%甘油，20mmol/Lβ-巯基乙醇）；
10mm
8mmΒιβλιοθήκη Baidu
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4
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5
苯丙氨酸解氨酶的提取纯化
❖ 实验原理
❖ 苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine：ammonia lyase，简称PAL；EC4.3.1.5）是植物体内苯丙 烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木 质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切 有关，在植物正常生长发育和抵御病菌侵害过程 中起重要作用。
电泳。
可编辑ppt
1
实验操作
1.硅胶薄板的制备：注意胶要均匀。
1.2 g硅胶H加4.0 ml0.5%CMC溶液， 研磨数分钟后，倒在预先准备好的玻璃 板上，铺开，使浆液分部均匀，放在水 平台上，自然晾干。
可编辑ppt
2
2. 板的处理： 薄板的活化：105℃，0.5h 薄板的刮分：径向层析的优点是：样品展层后图 谱呈弧形带状，使Rf值相近的化合物也能清楚地 分开。
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10
苯丙氨酸解氨酶的活力测定
PAL催化L-苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸， 反式肉桂酸在290nm处有最大吸收值。若 酶的加入量适当，A290升高的速率可在 几小时内保持不变，因此通过测定A290 升高的速率以测定PAL活力。规定1h内 A290增加0.01为PAL的一个活力单位。
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12
蛋白质测定（考马斯亮蓝染色法）
取酶液0.1ml，用蒸馏水稀释至5ml 取试管8支，按下表加入各溶液： 将上述各试管混匀，静置2min，测定各管的A595。
试管编号
01 2 3 4
标准蛋白质溶液 0 0.2 0.4 0.6 0.8 （ml）50ug/ml
稀释酶液（ml） / / / / /
蒸馏水（ml）
2.0 1.8 1.6 1.4 1.2
考马斯亮蓝（ml） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
567 1.0 / /
/ 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 2.0 2.0 2.0
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13
PAL总活力、比活力、蛋白质含量的计算
步骤 粗提
体积（ml）蛋白质含量 （mg）
总活力 比活力 （m） （m/mg
待全部加完后，再缓慢搅拌10min；然后于9000r离心15min，保 留上清液于烧杯内。 （3）根据硫酸铵饱和度用量表，算出从38%到75%饱和度所需硫酸铵 用量。 （222g/L) （4）按上述（2）步同法处理，离心后，弃去上清液，保留沉淀。 （5）将沉淀溶于2ml酶抽提液中,留样 0.5ml 。 透析脱盐
9
纯化
离子交换层析-------DEAE纤维素 （1）称取DEAE纤维素52干粉1~1.5g，加20ml的0.02mol/L磷 酸盐缓冲液（pH8.0）浸泡4h以上（或浸泡过夜）。 （2）装柱：把预处理的DEAE纤维素52装柱。装柱完成后， 用2~3个床体积的0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH8.0）洗脱平衡 该柱。
11
❖ 取试管2支，按表中所述（0号为调零管，1号为测定管。 注意按表格从上到下的顺序加入试剂）。（单位：ml）
试剂类型
调零管（0号） 待测管（1号）
pH8.7的0.1mol/L硼酸缓冲液 3
2
0.1mol/L L-苯丙氨酸溶液
0
1
样品（酶）溶液
0.1
0.1
将各管混匀，放入40℃恒温水浴保温1h（准确计时），到时 各加0.2 ml 2 mol/LHCl终止反应。 紫外分光光度于波长290nm处测定1号管的A290。
糖的薄层层析
❖ 实验原理
❖ 薄层层析是一种微量而快速的层析方法。该法是把 吸附剂或支持剂涂布在玻璃板上成为一薄层，将要 分析的样品滴加到薄层上，然后用合适的溶剂进行 展开，使样品各个成分分离，然后进行定性鉴定和 定量测定。
❖ 根据原理的不同薄层层析通常有4种类型：吸附薄
层层析，分配薄层层析，离子交换薄层层析和薄层
protein）
硫酸铵沉淀
透析
离子交换层析
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SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS－PAGE）测定蛋白质分子量
（3）上样：把所得的酶洗脱液小心地注入柱床面中央，上样 结束后，在床面以上小心地加入0.02mol/L磷酸盐缓冲液2~3cm 厚液层。注意上样开始就收集流出液。
（4）洗柱：约用2倍床体积的A液（0.02mol/L磷酸盐缓冲液） 及B液（含1mol/LNaCl 的0.02mol/L磷酸盐缓冲液）洗柱， 按 洗脱管编号，取A280值高的管中洗脱液测其PAL的活力；合并 主要含有PAL活力的各管洗脱液，并量出其体积（ml）。
3. 点样：样品为鼠李糖、木糖和葡萄糖。点样量 8-10μl。注意：点样点的直径小于5mm，点样要 少量多次，吹风机风力不能过大。
4. 展层：展层溶剂为：乙酸乙酯：甲醇：乙酸： 水=12：3：3：2（体积比），新鲜配制。 5. 显色：显色剂：苯胺-二苯胺-磷酸试剂。
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30mm 20mm
DEAE纤维素52
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操作步骤
酶液提取 （1）植物材料2g，剪成小段，加入5倍体积的酶提取液，于冰浴上用
研钵研磨。 （2）将已匀浆的酶液转入离心管，4000r冷冻离心30min。 （3）取离心后的上清液（酶粗提液），量出其体积，留样 0.5ml 。 硫酸铵分级沉淀酶蛋白 （1）根据实际体积、温度和硫酸铵饱和度用量表，算出达到38%饱和
酶液装入透析袋，放入低盐溶液中透析过夜,留样 0.5ml 。
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银杏叶2g +10ml酶提取液研磨 4000rpm、
30min 取上清液 加硫酸铵至饱和度38%
9000rpm、15min 取上清液 加硫酸铵至饱和
度75% 9000rpm、15min 取沉淀 溶于
2ml酶抽提液 透析
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❖ 本次实验是以银杏叶为原料采用分步盐析、透析 脱盐、离子交换等方法得到苯丙氨酸解氨酶。
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仪器 高速冷冻离心机；恒温水浴；电子天平；柱层析系统
试剂
酶提取液：0.1mol/L硼酸-硼砂缓冲液（含 1mmol/LEDTA、20mmol/Lβ-巯基乙醇）
固体硫酸铵
0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH8.0，含0.5mmol/LEDTA， 2.5%甘油，20mmol/Lβ-巯基乙醇）；
10mm
8mmΒιβλιοθήκη Baidu
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苯丙氨酸解氨酶的提取纯化
❖ 实验原理
❖ 苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine：ammonia lyase，简称PAL；EC4.3.1.5）是植物体内苯丙 烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木 质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切 有关，在植物正常生长发育和抵御病菌侵害过程 中起重要作用。
电泳。
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1
实验操作
1.硅胶薄板的制备：注意胶要均匀。
1.2 g硅胶H加4.0 ml0.5%CMC溶液， 研磨数分钟后，倒在预先准备好的玻璃 板上，铺开，使浆液分部均匀，放在水 平台上，自然晾干。
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2
2. 板的处理： 薄板的活化：105℃，0.5h 薄板的刮分：径向层析的优点是：样品展层后图 谱呈弧形带状，使Rf值相近的化合物也能清楚地 分开。
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10
苯丙氨酸解氨酶的活力测定
PAL催化L-苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸， 反式肉桂酸在290nm处有最大吸收值。若 酶的加入量适当，A290升高的速率可在 几小时内保持不变，因此通过测定A290 升高的速率以测定PAL活力。规定1h内 A290增加0.01为PAL的一个活力单位。
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12
蛋白质测定（考马斯亮蓝染色法）
取酶液0.1ml，用蒸馏水稀释至5ml 取试管8支，按下表加入各溶液： 将上述各试管混匀，静置2min，测定各管的A595。
试管编号
01 2 3 4
标准蛋白质溶液 0 0.2 0.4 0.6 0.8 （ml）50ug/ml
稀释酶液（ml） / / / / /
蒸馏水（ml）
2.0 1.8 1.6 1.4 1.2
考马斯亮蓝（ml） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
567 1.0 / /
/ 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 2.0 2.0 2.0
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PAL总活力、比活力、蛋白质含量的计算
步骤 粗提
体积（ml）蛋白质含量 （mg）
总活力 比活力 （m） （m/mg