超滤法在海洋真菌多糖分离纯化工艺中的应用

・技术交流・

超滤法在海洋真菌多糖分离纯化工艺中的应用

钮明洋,姚文兵,姚金凤,高向东

(中国药科大学生命科学与技术学院,江苏南京210009)

摘　要:目的用超滤法代替透析法去除海洋真菌多糖提取液中的单糖等小分子杂质。方法采用中空纤维超滤膜,对多糖去蛋白质后的提取液通过超滤去除小分子杂质,同一批提取液中取出部分用透析法处理,作平行对照。结果原液浓度、操作压力等影响参数优化后得到的产品,多糖得率和含量都不低于对照组,而且洗脱曲线也与对照组相似。结论超滤法适用于海洋真菌多糖的分离纯化,可供中试生产使用。 关键词:多糖;超滤;透析;分离;纯化

中图分类号:Q538;T Q460.6 文献标识码:B 文章编号:100521678(2004)0320161202

Application of ultrafiltration technique to the separation and purification of polysaccharides

NI U Ming 2yang ,Y AO Wen 2bing ,Y AO Jin 2feng ,G AO X iang 2dong

(School o f Life Science &Technology ,China Pharmaceutical Univer sity ,Nanjing 210009,China )

Abstract :Purpose Small m olecular im purities ,such as m onosaccharide ,were still in the extraction s olu 2tion of polysaccharides and could be g ot rid of by dialysis in the lab.H owever it is alm ost im possible in the in 2dustry.Ultrafiltration can serve as dialysis and is suitable for large 2scale production.Methods H ollow fiber ultrafiltration membrane was used and then dialysis was proceeding in the same time as control.R esults High yield rate and containment of polysaccharide were obtained after concentration and pressure was optimized.Conclusion The ultrafiltration technique can be used for middle 2scale production.

K ey w ords :polysaccharides ;ultrafiltration ;dialysis ;separation ;purification

收稿日期:2003212205;修回日期:2004204208

基金项目:国家863资助课题(2001AA624110、2003AA624110)和江苏省“六大人才高峰”资助

作者简介:钮明洋(19792),男,江苏六合人,硕士,研究方向为生物大分子的结构和功能;高向东,通讯作者,T el :025*********,E 2

mail :xdgao @ 。

海洋真菌(K eissleriella sp.Y C 4108)多糖是从海洋真菌菌丝体提取、分离纯化得到的一种多糖。初步药理实验表明其具有抗肿瘤活性,有较广的应用前景。以菌丝体为原料,提取纯化海洋真菌多糖的小试工艺已经较为成熟,中试工艺也基本确定。在提取过程中,去蛋白质液中含有较多的单糖等小分子杂质,在小试过程中采用透析方法去除,但透析处理能力有限,不适合中试生产。超滤法具有操作简单、分离过程中无相变、对产品破坏小等特点,适合大规模生产的分离纯化,因此在中试实验中采用超

滤法去除单糖。本文结合多糖的特点,探讨了超滤过程的原液浓度、压力等参数对产品的影响,初步确定了超滤的条件。1　材　料

海洋真菌,南京大学生命科学学院提供;中空纤维超滤器(10K,外流型),北京市旭成超滤设备厂;BS 2100A 自动部分收集器,上海沪西分析仪器厂;TH 21型梯度混合器,上海沪西机电厂。2　方法和结果

2.1　多糖的分离纯化流程

海洋真菌菌丝体经捣碎后于80℃水浴提取,过滤残渣,滤液于80℃浓缩至原体积1/3,再经sevag 去蛋白质、超滤,3倍体积工业乙醇沉淀4h ,最后丙酮洗涤后真空干燥得到粗多糖,粗多糖经离子交换色谱纯化后得到精品。2.2　多糖含量测定

参照文献[1,2],采用硫酸2蒽酮法测定多糖含量。

1

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2.3　超滤条件的优化

影响超滤主要因素有原液浓度(C)和压力(P),采用正交试验设计[L4(22)]对其进行优化。参照文献[3,4]和多糖自身特点,浓度选择0.25mg/ml (C1)和0.5mg/ml(C2),压力选择0.025M pa(P1)和0.05M pa(P2)。将粗多糖的得率和多糖含量作为考察指标。同时取出一定量去蛋白质液直接采用透析法处理作平行对照,考察超滤效果,结果见表1。

表1　超滤法和透析法的结果比较

供试品条件C/(mg/ml)P/M pa得率/%多糖含量/% 110.250.0250.23851.1

220.250.050.21459.3

330.50.0250.31887.5

440.50.050.22057.4

5透析0.31776.7

由表1可见,超滤过程中在原液浓度0.5mg/ ml、压力0.025M pa下,结果最好,其粗多糖的得率和糖含量高于透析组。

2.4　粗多糖的离子交换色谱

将离子交换树脂DE AE232装柱(2.6cm×20 cm),蒸馏水平衡24h。取表1中不同条件下所得的粗多糖溶液10ml(10mg/ml)分别上样,先用蒸馏水150ml洗脱,再用0～2m ol/ml NaCl溶液梯度洗脱,流速为22.5ml/h。硫酸2蒽酮法测定多糖含量,绘制洗脱曲线。结果见图1。

从图1可以看出,条件3与透析法洗脱行为相似,且有较好的分离效果。故选择原液浓度0.5mg/ ml、压力0.025M pa为比较合适的超滤条件。这也与正交试验所得结果相一致。

2.5　3批实验结果

为了进一步考察超滤条件的稳定性,在上述优化条件下,进行了3批超滤实验,其粗多糖得率分别为0.305%、0.312%和0.330%,糖含量分别为78.2%、80.1%和83.2%。说明该超滤条件适用于海洋真菌菌丝体的中试生产。

3　讨　论

结果表明超滤法所得产品的得率和多糖含量都高于透析对照组。另外本实验所用的多糖去蛋白质液在超滤或透析之前含有较多的色素,在超滤过程中色素大部分会被超滤膜吸附,这对于提高粗品多糖含量是有利的。超滤通常在常温和溶液常态下进行,分离过程无相变。一般影响其分离效果因素有:温度、pH值、压力、浓度等。对于常温下不会失活的产品通常选择常温下进行;一般超滤膜能承受的pH 值范围为2～14,可以满足绝大多数的应用要求,因此只要产品无特殊要求,一般不需要调节溶液pH 值。过高的压力会破坏膜组件,而压力过低又易在膜表面产生浓差极化,不仅影响分离效果,还会堵塞膜孔;原液中大分子浓度必须在一定范围内,浓度过小,溶液经膜内外,大分子易被分子剪切力所破坏;浓度太大又会堵塞膜孔,降低超滤效率[5]。本研究中,通过正交试验设计选择出合适的浓度和压力,取得了较为满意的结果。

参考文献:

[1]　郭欣,高向东,杨晓兵.酸性多糖中糖醛酸等中性糖的含量测定

[J].中国生化药物杂志,2004,25(2):25227.

[2]　张惟雄.糖复合物生化研究技术[M].杭州:浙江大学出版社,

1999.17.

[3]　时钧,袁权高,从士皆.膜技术手册[M].北京:化学工业出版

社,2001.3362338.

[4]　王厚廷,乔善义,杨明.超滤法提取六味地黄汤活性多糖的工

艺研究[J].解放军药学学报,2001,17(2):69271.

[5]　师俊玲,李元瑞,王鸿飞.猕猴桃汁超滤操作参数对膜通量的影

响[J].西北农业大学学报,1999,27(6):1132115.

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