昆虫表达系统
昆虫表达系统
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病毒基因组的结构特点
➢ 病毒基因组大小相差较大,与细菌或真核细胞相比，病毒的基因组 很小
➢ 病毒基因组可以由DNA组成，也可以由RNA组成
➢ 多数RNA病毒的基因组是由连续的核糖核酸链组成 ，病毒基 因组的大部分是用来编码蛋白质的 ，噬菌体（细胞病毒） 的基因是连续的；而真核细胞病毒的基因是不连续的 ，无内 含子
• 在杆状病毒所表达的一系列蛋白中,有一类蛋白具有较高的表达量,并且均为病毒基因组复制所
非必需, 其中最具代表性的有多角体蛋白与 P10蛋白, 均属于晚期表达的蛋白,受晚期启 动子的调从而提供了外源
DNA插入座位。
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➢ 部分载体具有宿主细胞特异性
➢ 识别受体 ➢ 假病毒颗粒
• 杆状病毒及其基因组模型
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昆虫杆状表达系统简介
• 杆状病毒是已知昆虫病毒中最大的类群 ,发现最早 、研
究最多且实用意义很大的昆虫病毒。20世纪80年代以来由
于杆状病毒表达载体系统（baculovirus expression vector system，BEVS）的建立 ,已被公认为是当今 基因工程四大表达系统之一 。该系统具有许多优点, 如多角体启动子控制下的高效表达 ,完善的转译后 加工修饰 ,较易从无血清培养上清中纯化的蛋白,无 内毒素污染等。 • 杆状病毒载体系统主要分为两大类,一类是用于表达单 个外源基因的载体,另一类是多元表达载体,用于插人 并表达2个或多个外源基因
871~ 881.
• （小鼠中枢神经系统）Sarkis C. , Serguera C. , Petres S. , Buchet D. ,Ridet J.L. et al.
白蚁木质纤维酶昆虫细胞表达体系的构建
白蚁木质纤维酶昆虫细胞表达体系的构建白蚁是一种能够分解木质纤维素的昆虫，其体内含有一种特殊的酶——木质纤维酶。
这种酶能够分解木质纤维素，将其转化为可被白蚁消化吸收的营养物质。
因此，白蚁的木质纤维酶在生物能源、环境保护等领域具有广泛的应用前景。
为了更好地利用白蚁的木质纤维酶，科学家们开始研究如何构建一种高效的昆虫细胞表达体系。
经过多年的努力，他们终于成功地构建了一种以白蚁为模板的昆虫细胞表达体系。
这种昆虫细胞表达体系主要由两部分组成：表达载体和宿主细胞。
表达载体是一种能够将目标基因导入宿主细胞并使其表达的DNA分子。
而宿主细胞则是一种能够稳定地表达目标基因并产生大量目标蛋白的细胞。
在构建这种昆虫细胞表达体系时，科学家们首先需要从白蚁中提取木质纤维酶的基因序列，并将其克隆到表达载体中。
然后，他们将表达载体导入宿主细胞中，并通过一系列的实验优化表达条件，最终成功地使宿主细胞产生了大量的木质纤维酶。
这种昆虫细胞表达体系的构建不仅为木质纤维素的高效分解提供了新的途径，还为生物能源、环境保护等领域的研究提供了新的思路和方法。
未来，科学家们将继续深入研究这种昆虫细胞表达体系，以期能够更好地利用白蚁的木质纤维酶，为人类的生活和环境保护
做出更大的贡献。
原核,昆虫,哺乳动物表达系统 对比
表达系统是生物体进行交流和传递信息的重要工具，不同类裙的生物体在表达系统上有着独特的特点和功能。
本文将就原核、昆虫和哺乳动物的表达系统进行对比分析。
一、原核1. 原核生物是一类较为简单的生物体，其表达系统主要包括RNA转录和翻译，以及一些原核生物特有的机制，如转座子、限制酶等。
2. 在原核生物中，基因的表达和调控相对简单，通常是通过DNA的转录产生mRNA，然后再通过翻译产生蛋白质。
原核生物的基因组相对较小，基因的结构也相对简单。
3. 原核生物的表达系统不仅包括基本的基因表达，还包括许多在分子水平上进行信息交流和传递的机制，如质粒介导的DNA转移、RNA 介导的基因沉默等。
二、昆虫1. 昆虫是一类较为复杂的生物裙体，其表达系统包括了多种不同的信号传导和调控机制，如激素系统、化学信号系统等。
2. 在昆虫中，基因的表达和调控已经相对复杂起来，有许多基因调控网络参与其中。
除了mRNA的转录和翻译外，昆虫还具有一些特殊的表达机制，如miRNA介导的基因沉默、垂体激素调控等。
3. 昆虫的表达系统在进化上相对比较保守，但在不同物种和不同环境中，表达系统也会出现一些特殊的适应性和多样性。
三、哺乳动物1. 哺乳动物是一类高度复杂的生物裙体，其表达系统包括了多种不同的信号传导和调控机制，如内分泌系统、神经系统等。
哺乳动物的基因组相对较大，基因的结构也十分复杂。
2. 在哺乳动物中，基因的表达和调控已经相对复杂起来，有许多基因调控网络参与其中。
哺乳动物具有多种不同的表达机制，如DNA甲基化、组蛋白修饰等。
3. 哺乳动物的表达系统在进化上相对比较灵活，不同物种和不同环境中会呈现出不同的表达模式和调控机制。
在哺乳动物中，基因表达的调控和信号传导机制十分复杂，涉及到许多不同的细胞信号通路和调控网络。
原核、昆虫和哺乳动物在表达系统上具有明显的差异。
原核生物表达系统相对简单，主要是基因的转录和翻译，以及一些特殊的表达机制。
昆虫和哺乳动物的表达系统则相对复杂，涉及到多种不同的信号传导和调控机制。
昆虫杆状病毒细胞表达系统 课件
6) Simplicity of technology
This technology has made expression of full-length proteins fast, easy and reliable. Recombinant Baculovirus can be obtained in two simple steps–cloning and co-transfection–in as little as 5 days. The ease of use now rivals that of bacterial expression systems and BEVS technology does not require that the recombinant protein be expressed as a fusion protein.
5) Capacity to express unspliced genes
Insect cells have the capability to perform intron/exon splicing. However, certain virus-, tissue- or species-specific splicing patterns will not be obtained if they require the presence of particular splicing factors which are not available in the infected insect cell environment. In general, for high protein expression levels, a cDNA insert rather than a genomic DNA fragment is recommended.
昆虫杆状病毒表达系统(BEVS)
姓名：宋志瑞 专业：生物工程 学号： 2015304120207
NO.1
BEVS 简介
BEVS简介
昆虫杆状病毒表达载体系统(BEVS)是基于昆虫杆状病 毒及其宿主细胞建立起来的表达体系；是继大肠杆菌， 酵母，哺乳动物细胞表达系统建立起来的，始于上世纪 80年代。
NO.2
BEVS 优点
2
Bac-to-Bac
3
BaculoDirect源自BacPAKBac-to-Bac
BaculoDirect
三大体系的区别
NO.5
BEVS常用宿主
常用宿主
Thanks
√
√ √ Sometimes Sometimes
Glycosylation
Acylation
√
√
表达高
加工 修饰
安全
B E VS
高效
容量大
NO.3
BEVS 原件
BEVS原件
1. 转移载体 2. 杆状病毒（AcNPV) 3. 宿主（培养细胞或虫体）
NO.4
BEVS三大系统
BEVS三大系统
1
BacPAK
BEVS优点
Features Simple to use Protein size Multiple gene expression Signal peptide cleavage BEVS √ unlimited √ √ Bacterial √ <100kD
Intron splicing
Functional protein Phosphorylation
杆状病毒昆虫细胞表达系统：原理探微与常见问题解决指南
杆状病毒昆虫细胞表达系统：原理探微与常见问题解决指南在生物技术的广阔天地中，杆状病毒昆虫细胞表达系统以其独特的魅力和广泛的应用前景，正逐渐受到研究者们的青睐。
这一系统巧妙地利用经过改造的杆状病毒基因组，在大肠杆菌中高效复制，并通过精密的转座过程将目的基因精准地插入到bacmid的特定位点。
这一过程不仅展示了生物技术的精巧与奇妙，更为科研工作者提供了强大的工具，用以探索和研究蛋白质的功能与结构。
然而，任何技术在实际应用中总会遇到一些问题和挑战。
为了帮助大家更好地掌握和运用这一系统，本文将深入探讨其原理，并分享在实际操作中可能遇到的常见问题及其解决方案，以期为大家的科研工作提供有益的参考和指导。
杆状病毒昆虫细胞表达系统原理：经过精心改造的病毒基因组（即杆状病毒穿梭载体Bacmid）在此系统中展现了非凡的复制能力。
它们能在大肠杆菌如DH10Bac菌株中自如地繁衍。
这一复制过程得益于供体质粒中目的基因两侧所锚定的Tn7转座原件。
这些原件与DH10Bac菌株中的helper质粒所编码的转座酶活性相互作用，将目的基因精准地转座到bacmid的特定位点上。
当目的基因成功插入后，会导致bacmid上的LacZ基因发生移码，进而通过蓝白斑筛选法轻松鉴定出阳性重组bacmid。
经过提取后，这些bacmid便能转染昆虫细胞，开启其在昆虫细胞中的高效表达之旅。
昆虫-杆状病毒表达平台的常见问题解答1、义翘神州是否接受已构建的表达载体进行蛋白表达？对于众多常规蛋白表达项目，义翘神州确实欢迎并接受客户直接提供的表达载体，如pFastBac等，进行专业的蛋白表达。
我们深知每个蛋白的特性独一无二，因此，我们始终致力于与客户保持紧密的沟通，共同探讨并确定最佳的纯化方案，确保最终交付的产品符合客户的期望和需求。
我们承诺，通过我们的专业知识和丰富经验，将客户的表达载体转化为高质量的蛋白产品。
2、义翘神州是否接受包被好的杆状病毒直接进行蛋白表达？对于一些常规蛋白表达项目我们同样也可以直接使用客户制备好的杆状病毒进行蛋白表达，我们也会根据蛋白的实际特性与客户沟通交流纯化方案和最终交付形式。
杆状病毒——昆虫细胞表达系统
实验材料：1. 重组杆状病毒质粒：Bacmid/nsp-6及阳性对照Bacmid/CAT，已构建成功。
2. 昆虫细胞Sf9、High Five及其相关培养基、转染试剂均购自Invitrogen公司。
抗His单克隆抗体购自Oncogene公司，CAT-ELISA试剂盒购自Roche。
实验步骤：一、昆虫细胞转染：1． Sf9细胞计数，取6孔板中的两孔，每孔加入9×10 5个细胞(其中一孔设为正常对照)，并以全培培养至少1小时，使细胞贴壁。
2．准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物：a. 溶解1μg纯化重组杆状病毒重组质粒于100μl 无添加成分的Grace’s Medium。
b. 转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl 无添加成分的Grace’s Medium，混匀。
c. 将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育20min。
3．重组质粒与转染剂混合液孵育的同时，以2ml无添加成分的Grace’s Medium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液。
4．取0.8ml无添加成分的Grace’s Medium加入质粒与转染剂的混合液中，轻轻混匀后，总体积约为1ml。
加入上步洗涤后的细胞孔中，27℃继续培养5h。
5．移除质粒、转染剂混合物，加入2ml全培。
27℃湿盒孵育，直到病变现象产生。
二、病毒贮液的制备：1. 病毒感染晚期（正常24-72h）可见细胞停止生长、黏附，呈颗粒状外观。
即收集含病毒的培养上清，500g离心5min，去除细胞和碎片。
2. 上清即为P1病毒贮液，移入新的离心管中4℃避光保存。
长期保存分装冻存于-80℃。
3. 病毒贮液的扩增，按以下公式进行所需病毒P1贮液的量：感染所需病毒贮液量(ml)=[MOI(pfu/cell) ×细胞数÷病毒贮液效价(pfu/ml)]注：若不进行病毒空斑测定，P1贮液效价按照1×10 6到1×10 7计。
4. 扩增P1液制备P2病毒贮液方法如下：a. 转染当天，取2×106个细胞/孔加入六孔板中，贴壁生长至少1h。
昆虫细胞表达系统
昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统是四大表达系统（昆虫细胞、细菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统）之一。
昆虫细胞表达系统原理是通过转座作用将转移载体中的表达组件定点转座到能在大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体（Bacmid）上，通过抗性和蓝白斑筛选到重组穿梭质粒，提取穿梭质粒DNA转染昆虫细胞后，得到的子代病毒即为重组病毒。
将病毒上清浸染昆虫细胞，获得表达的重组蛋白。
杆状病毒是一类闭合环状双链病毒，病毒粒子呈杆状，以昆虫为主要宿主。
杆状病毒还是一种出芽型分泌性病毒粒子，在感染细胞后能迅速在培养细胞中水平传播而保持细胞在相当长的时间内不裂解，从而最大限度地保持了外源蛋白的稳定，昆虫细胞表达系统又被称为昆虫杆状病毒系统。
昆虫细胞表达系统本身是一个蛋白裂解性系统，在杆状病毒感染昆虫细胞的过程中，杆状病毒可以编码一些蛋白酶如木瓜蛋白酶等导致蛋白的降解。
因此，收集细胞后，在裂解细胞之前要加入蛋白酶抑制剂防止蛋白的降解。
昆虫细胞表达系统属于真核细胞表达系统，但又不同于酵母及哺乳动物细胞表达系统，酵母表达的蛋白易纯化但也易降解，而哺乳动物细胞表达系统表达的蛋白具有生物活性但成本高。
细菌表达系统属于原核表达系统，操作简单、周期短收益大、表达产物稳定，但是表达基因的相对分子量有限，且不能对表达产物进行翻译后加工修饰。
而昆虫细胞表达系统具有很多优点：(1)具有糖基化作用、乙酰化作用、磷酸化作用等一系列蛋白质翻译加工修饰系统；(2)正确的蛋白折叠、二硫键形成，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白，有利于表达产物形成天然的高级结构；(3)具有对重组蛋白进行定位的功能，如将核蛋白转送到细胞核上，膜蛋白则定位在膜上，分泌蛋白则可分泌到细胞外等；(4)昆虫细胞悬浮生长，容易放大培养，有利于大规模表达重组蛋白。
高表达量，最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%；(5)可表达非常大的外源性基因（~200kD）而不至于影响本身的增殖；(6)具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个基因的能力；(7)通用性广，能用于表达来自病毒、细菌、真菌、植物和动物几乎所有的蛋白，并且能表达带有内含子的外源基因；(8)对脊椎动物是安全的，杆状病毒属于昆虫病毒，有高度特异的宿主范围，对脊椎动物和植物均无致病性，而且经重组后的病毒因失去多角体保护而使其在自然界的生存能力很弱，被认为是安全的载体。
昆虫表达系统介绍
杆状病毒是已知昆虫病毒中最大的类群发现最早、研究最多且实用意义也是最大的昆虫病毒。
杆状病毒表达载体系统Baculovirus expression vector systemBEVS自1983年问世以来Smith Summer1983Maeda et al 1984由于其具有高效的表达能力、安全易操作等特点已成为研究和生产各种原核、真核蛋白的用力而普及的工具已成功表达了大量的外源基因几乎覆盖了所有物种可开发利用的大部分基因。
1 分类杆状病毒——有囊膜的双股DNA大型病毒仅限于无脊椎动物有尾噬菌体目Caudovirales 杆状病毒科Baculoviridae 核型多角体病毒属NucleopolyhedrovirusNPV ———苜蓿蠖核型多角体病毒Autographa Californica NPV ———家蚕核型多角体病毒Bombyx mori MPV 颗粒体病毒属GranulovirusGV ———苹果蠹蛾颗粒体病毒Cydia pomonella GV 多角体与颗粒体的区别NPV和GV均有包涵体形式NPV的称多角体后者称为颗粒体多角体内含有许多病毒子都在宿主细胞核内存在颗粒体内含一个病毒子偶尔是两个绝大部分在核内形成但某些GV在胞浆中形成颗粒体2 发育循环杆状病毒包含两个独特的时相又称双相生活循环biphase life cycle 第一相出现在PI0-24hr 核衣壳于胞核内病毒发生基质上进行装配通过细胞质出芽获得囊膜这种病毒称为细胞释放型病毒子Cell-released virusCRV又称胞外型病毒Extracellular virusECV或出芽型病毒Budded virusBV 第二相出现在PI20-72hr 当20hr后核内出现病毒包涵体时第二相显著出现一直持续到感染细胞溶解为止72hr 随着第二相开始CRV急剧减少从第二相开始留在核内的核衣壳被封入核内新装配的囊膜中以后许多核内获得囊膜的病毒子被包埋入多角体蛋白的结晶基质中逐渐形成多角体。
昆虫细胞表达系统
昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统是四大表达系统（昆虫细胞、细菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统）之一。
昆虫细胞表达系统原理是通过转座作用将转移载体中的表达组件定点转座到能在大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体（Bacmid）上，通过抗性和蓝白斑筛选到重组穿梭质粒，提取穿梭质粒DNA转染昆虫细胞后，得到的子代病毒即为重组病毒。
将病毒上清浸染昆虫细胞，获得表达的重组蛋白。
杆状病毒是一类闭合环状双链病毒，病毒粒子呈杆状，以昆虫为主要宿主。
杆状病毒还是一种出芽型分泌性病毒粒子，在感染细胞后能迅速在培养细胞中水平传播而保持细胞在相当长的时间内不裂解，从而最大限度地保持了外源蛋白的稳定，昆虫细胞表达系统又被称为昆虫杆状病毒系统。
昆虫细胞表达系统本身是一个蛋白裂解性系统，在杆状病毒感染昆虫细胞的过程中，杆状病毒可以编码一些蛋白酶如木瓜蛋白酶等导致蛋白的降解。
因此，收集细胞后，在裂解细胞之前要加入蛋白酶抑制剂防止蛋白的降解。
昆虫细胞表达系统属于真核细胞表达系统，但又不同于酵母及哺乳动物细胞表达系统，酵母表达的蛋白易纯化但也易降解，而哺乳动物细胞表达系统表达的蛋白具有生物活性但成本高。
细菌表达系统属于原核表达系统，操作简单、周期短收益大、表达产物稳定，但是表达基因的相对分子量有限，且不能对表达产物进行翻译后加工修饰。
而昆虫细胞表达系统具有很多优点：(1)具有糖基化作用、乙酰化作用、磷酸化作用等一系列蛋白质翻译加工修饰系统；(2)正确的蛋白折叠、二硫键形成，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白，有利于表达产物形成天然的高级结构；(3)具有对重组蛋白进行定位的功能，如将核蛋白转送到细胞核上，膜蛋白则定位在膜上，分泌蛋白则可分泌到细胞外等；(4)昆虫细胞悬浮生长，容易放大培养，有利于大规模表达重组蛋白。
高表达量，最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%；(5)可表达非常大的外源性基因（~200kD）而不至于影响本身的增殖；(6)具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个基因的能力；(7)通用性广，能用于表达来自病毒、细菌、真菌、植物和动物几乎所有的蛋白，并且能表达带有内含子的外源基因；(8)对脊椎动物是安全的，杆状病毒属于昆虫病毒，有高度特异的宿主范围，对脊椎动物和植物均无致病性，而且经重组后的病毒因失去多角体保护而使其在自然界的生存能力很弱，被认为是安全的载体。
昆虫杆状病毒表达系统的研究进展综述
基因工程制药综述昆虫杆状病毒表达系统的研究进展综述体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。
原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞, 它操作简便、周期短、收益大及表达产物稳定, 但是表达基因的相对分子质量 (Mr)有限, 不宜过大, 且不能对表达产物进行一些翻译后加工、修饰。
真核细胞系统包括 CHO 等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等。
昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性, 日益受到人们的重视。
1 杆状病毒的生物学特性杆状病毒只来源于无脊椎动物, 虽然已发现 600 多种杆状病毒, 但进行分子生物学研究的不到 20 种。
杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链 DNA 分子, 大小为 80～ 160 kb, 其基因组可在昆虫细胞核复制和转录[1]。
DNA 复制后组装在杆状病毒的核衣内, 后者具有较大的柔韧性, 可容纳较大片段的外源 DNA 插入, 因此是表达大片段 DNA 的理想载体。
其中, 用作外源基因表达载体的杆状病毒, 目前仅限于核型多角体病毒( nuclear polyhedrosis virus, NPV)。
该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约 1～ 5 μm 的包含体病毒 , 呈多角体形状[2]。
核型多角体病毒有两种形式[2] :一种为包含体病毒( occluded virus, OV) , 另一种则为细胞外芽生病毒( budded virus, BV)。
它们在病毒感染中扮演的角色不同, 包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式, 昆虫往往是食入污染OV 的食物后引起感染。
包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体, 即 Mr 为 29 000 的多角体蛋白, 它对病毒的水平感染起以下作用:①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。
②保证病毒颗粒在适当的位置释放, 引起感染。
昆虫中肠上皮局部的强碱性环境( pH=10. 5) , 可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体[3] 。
昆虫表达系统原理
昆虫表达系统原理宝子们！今天咱们来唠唠昆虫表达系统的原理，可有趣啦！昆虫表达系统呢，就像是一个超级独特的小工厂，这个小工厂就在昆虫的身体里。
那昆虫为啥能成为这个特殊的“工厂”呢？这就得从昆虫细胞说起啦。
昆虫细胞就像是一群勤劳的小工匠，它们有着独特的本领。
昆虫表达系统主要是利用昆虫细胞或者昆虫的幼虫、蛹来生产我们想要的东西，比如说一些特殊的蛋白质。
这里面有个关键的角色，那就是杆状病毒。
杆状病毒就像是一个带着特殊任务的快递小哥。
它呀，能够非常高效地把我们想要表达的基因送进昆虫细胞里。
想象一下，杆状病毒这个小快递员，它身上带着我们要生产的蛋白质对应的基因这个“包裹”。
它在昆虫细胞的世界里到处找门儿，然后就悄悄地把这个“包裹”送进细胞里。
一旦进入细胞，就像是在细胞里放了一个魔法种子。
昆虫细胞这个小工匠就开始按照这个基因的指示来干活啦。
昆虫细胞里面有着各种各样的“工具”和“原材料”。
就像我们做菜要有锅碗瓢盆和食材一样。
细胞里的那些酶呀，就像是做菜的厨师，它们根据基因带来的“菜谱”，把细胞里的氨基酸这些“食材”组合起来。
氨基酸们就乖乖地排好队，一个一个地连接在一起，慢慢地就形成了我们想要的蛋白质。
而且哦，昆虫表达系统有个超棒的优点，就是它生产出来的蛋白质很接近天然的状态。
这就好比是手工制作的精美工艺品，而不是那种粗制滥造的东西。
因为昆虫细胞这个小环境，它有着自己独特的“氛围”，这个“氛围”能够让生产出来的蛋白质正确地折叠起来。
蛋白质要是折叠不对，就像我们把衣服叠得乱七八糟，是没办法好好发挥作用的。
在昆虫的幼虫或者蛹里也是类似的情况。
杆状病毒把基因送进去之后，这些小家伙身体里的细胞就开始热火朝天地生产蛋白质。
幼虫和蛹就像是一个个小小的生物反应器，在它们的身体里，蛋白质不断地被制造出来。
宝子们，昆虫表达系统还有一个很神奇的地方呢。
它的安全性相对比较高。
因为杆状病毒这个快递员啊，它是比较专一的，一般不会对其他生物造成太大的危害。
昆虫杆状病毒表达系统研究进展
昆虫杆状病毒表达系统研究进展昆虫杆状病毒表达系统研究进展摘要：昆虫杆状病毒表达载体系统具有安全性好、重组蛋白表达量高、能同时表达多个基因、重组蛋白翻译后加工完整等特点，因而得到了广泛的应用。
随着重组杆状病毒构建技术的不断发展，昆虫杆状病毒表达载体系统的操作在逐渐简化，重组杆状病毒获得的效率也在不断提高。
昆虫细胞培养技术的改进和转基因昆虫细胞系的发展，进一步推动了昆虫杆状病毒表达载体系统在商品化药物、治疗性抗体、生物农药研发和基因治疗中的应用。
尽管仍存在着重组蛋白降解的问题，但随着分子生物学技术的发展，对杆状病毒载体的研究与改造也会更加深入，未来昆虫杆状病毒表达载体系统的应用将更为广泛。
关键词：杆状病毒；多角体启动子；转基因昆虫细胞系；疫苗；治疗性抗体。
前言作为当今基因工程四大表达系统之一，昆虫细胞杆状病毒表达载体系统(Insect cell baculovirus ex． pression vector system，IC-BEVS)的应用变得越来越广泛。
它不仅具有真核表达系统所具有的传统优势，同时兼具原核表达系统重组蛋白表达量高的特点，且能同时在一个载体上表达多种蛋白。
由于昆虫细胞易于悬浮培养，细胞培养基的改进也使得悬浮培养的细胞活率不断提高，最终得以实现昆虫细胞的大规模培养，这使得其在商业领域如生物医药、农业、疫苗研发等方面均获得了广泛的应用[1]。
1 杆状病毒的分类与分子生物学杆状病毒属于杆状病毒科(Baculoviridae)，分为核多角体病毒属和颗粒体病毒属，病毒粒子呈杆状，是一类专一性感染节肢动物并具有囊膜的DNA病毒。
基因组DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180 kb之间。
杆状病毒基因组可在昆虫细胞核复制和转录，DNA复制后组装在杆状病毒的核衣壳内，因其具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入而成为表达大片段DNA的理想载体。
其中，目前用作外源基因表达载体的杆状病毒主要为核型多角体病毒(Nuclear polyhedrosis virus，NPV)。
昆虫细胞蛋白表达常见问题解析
昆虫细胞蛋白表达常见问题解析昆虫细胞蛋白表达常见问题解析1、昆虫细胞蛋白表达系统能否将两个基因共同表达？答：昆虫细胞可以同时表达多个基因,杆状病毒衣壳内可以容纳较大的外源DNA插入片段，可以分别构建2个质粒，然后一起转染昆虫细胞，这种方式的优点是可以分别优化两个蛋白的表达水平，可以控制两个蛋白的表达平衡，相对于一个质粒共表达的方式缺点是在蛋白表达之前质粒构建，质粒抽提，蛋白病毒包被工作及成本费用都是增加一倍的；另一种共表达的方式是pFastBac Dual载体上构建两个目的基因，就可以同时表达两个蛋白。
pFastBac Dual载体上两个启动子分别为PH和P10启动子，其中PH启动子蛋白表达效率要高于P10启动子。
2、昆虫细胞蛋白表达系统的优势（1）、可以表达大分子量的蛋白，目前做过250KD蛋白表达，依然稳定性较好，没有断裂或降解。
（2）、昆虫细胞相对哺乳动物细胞培养相对简单，27度培养，无需CO2补充，目前商业化的培养基细胞培养非常成熟，细胞密度能够达到15*10^6个/ml，昆虫表达系统成本较哺乳表达系统较低。
（3）、病毒一次包被，长期使用，稳定表达。
较哺乳瞬时表达系统而言，该系统放大表达较容易，不需要抽提大量的质粒，质粒的质量以及批次差异会影响蛋白表达。
昆虫表达系统只需要包被好病毒，做好表达小试即可稳定放大表达。
（4）、昆虫细胞体系能进行翻译后的加工修饰，包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除及肽段的切割和分解等；（5）、可以同时表达多个基因，比如抗体、 fab、互相结合作用的蛋白等；（6）、杆状病毒对脊椎动物无感染性。
（7）、可以表达有毒蛋白，比如抗菌肽。
3、昆虫病毒的保存方式对病毒有怎样的影响？答：制备病毒时添加2%的细胞培养级别的BSA或者胎牛血清，有助于保护病毒，如果忘记添加，在收货病毒后添加，放在4度或者负80保存，短期使用（一般半年左右）可以放在4度，长期使用建议负80保存，再次使用建议检测一下病毒滴度或者做个表达小试，防止病毒滴度降低或失效。
昆虫细胞表达系统流程
昆虫细胞表达系统流程昆虫细胞表达系统呀，可有趣啦！一、昆虫细胞表达系统是啥呢？简单来说呀，它就是一种能让昆虫细胞来生产我们想要的蛋白之类东西的一个超酷的系统哦。
就像是让昆虫细胞成为小小的生产工厂一样呢。
你看，昆虫细胞有它们自己独特的地方，和其他比如细菌细胞之类的就不太一样。
昆虫细胞能对那些复杂的蛋白进行正确的加工和修饰，就像给蛋白穿上合适的衣服一样，这样生产出来的蛋白才更有活性，更接近我们在生物体内真正需要的那种样子呢。
二、构建表达载体。
要让昆虫细胞干活，就得先给它们一个“指示牌”，这个指示牌就是表达载体啦。
我们要把想要表达的基因放进这个载体里。
这个过程就像是把一个菜谱放进厨师的手里一样。
构建这个载体的时候呀，要考虑好多东西呢。
比如说基因的启动子，这就像是发动机的开关，要选一个合适的，才能让基因在昆虫细胞里顺利地开始工作。
还有基因的序列，得确保它是完整的、正确的，不然细胞就会搞不清楚要做什么啦。
而且这个载体还得能够在昆虫细胞里稳定地存在，不能进去晃一圈就没了呀。
三、细胞培养。
昆虫细胞很娇弱的呢，就像小宝贝一样。
培养它们的环境得很讲究。
我们得用专门的培养基，这个培养基就像是它们的食物和小床。
里面有各种营养成分，像氨基酸呀、维生素呀之类的，都是细胞生长必不可少的东西。
温度也很重要哦，不能太热也不能太冷，就像我们人感觉舒适的温度对它们来说也是刚刚好的。
一般昆虫细胞喜欢在27℃左右的环境里生长。
而且还得注意不能让它们太挤啦，要给它们足够的空间，如果细胞太挤的话，它们就会不开心，生长得也不好，就像我们人在很拥挤的地方也会觉得难受一样呢。
四、转染。
转染这个过程呀，就像是给细胞传递一个秘密信息。
我们要把构建好的带有目的基因的表达载体送进昆虫细胞里面去。
这个有好几种方法呢，比如说脂质体转染法。
就像是给载体包上一层小泡泡，这个小泡泡能和细胞的膜融合，然后就把载体偷偷地送进去了。
还有杆状病毒介导的转染，这个就像是找了一个小快递员（杆状病毒），把载体这个包裹送到细胞里面去。
生物制药技术在昆虫细胞表达系统中的应用
生物制药技术在昆虫细胞表达系统中的应用随着生物技术的不断发展，生物制药逐渐成为医药行业的重要组成部分。
而昆虫细胞表达系统作为一种重要的生物制药技术，具有许多优点，如易于操作、表达的蛋白质结构较好等，因此在生物制药领域得到了广泛应用。
本文将讨论昆虫细胞表达系统在生物制药技术中的应用，并介绍其优势和前景。
首先，昆虫细胞表达系统在生物制药中的应用主要体现在重组蛋白质的表达方面。
昆虫细胞表达系统能够高效表达多种复杂的蛋白质，包括荷兰病毒蛋白质、人类免疫球蛋白、溶血性毒素等。
而且，由于昆虫细胞表达系统所表达的蛋白质结构较好，其生物活性也较高，因此具有更好的药效和安全性。
此外，昆虫细胞表达系统在蛋白质折叠和糖基化等方面也具有很大优势，可保证表达的蛋白质的结构和功能的正确性。
其次，昆虫细胞表达系统在大规模生产生物制品方面也具有较大应用价值。
昆虫细胞表达系统具有易于操作、高效稳定的特点，能够通过大规模培养获得大量的蛋白质产物。
这对于生物制药企业来说是非常重要的，可以大幅度提高生物制品的产量，降低生产成本，更好地满足市场需求。
同时，昆虫细胞表达系统还可以进行工程改造，增强细胞代谢和表达能力，进一步提高大规模生产的效率和产量，助力生物制药行业的发展。
昆虫细胞表达系统在生物制药中的应用还表现在疫苗生产方面。
昆虫细胞表达系统能够高效表达疫苗所需的抗原蛋白，因此在疫苗的生产方面具有广阔的前景。
例如，昆虫细胞表达系统可用于产生免疫球蛋白，而免疫球蛋白是一种重要的抗体疫苗，具有抗感染能力，能够有效预防和治疗多种疾病。
此外，昆虫细胞表达系统在表达疫苗蛋白方面能够保证蛋白质的完整性和免疫原性，为疫苗的研发和生产提供了有力的支持。
然而，尽管昆虫细胞表达系统在生物制药技术中有许多优点和应用前景，但也存在一些挑战和限制。
首先，昆虫细胞表达系统所表达的蛋白质结构和翻译后修饰与真核细胞有一定差异，因此在某些情况下可能需要进行结构和功能的改造。
白蚁木质纤维酶昆虫细胞表达体系的构建
白蚁木质纤维酶昆虫细胞表达体系的构建
白蚁木质纤维酶是一种能够分解木质纤维素的酶，对于生物质能源的
开发和利用具有重要的意义。
因此，构建高效的白蚁木质纤维酶昆虫
细胞表达体系是当前研究的热点之一。
首先，需要选择合适的表达载体。
常用的表达载体有原核表达载体和
真核表达载体。
原核表达载体具有转化效率高、表达速度快等优点，
但是无法进行翻译后修饰，因此无法表达复杂的真核蛋白。
真核表达
载体则可以进行翻译后修饰，能够表达复杂的真核蛋白，但是转化效
率低、表达速度慢。
针对白蚁木质纤维酶这种复杂的真核蛋白，应该
选择真核表达载体。
其次，需要选择合适的宿主细胞。
常用的宿主细胞有哺乳动物细胞、
昆虫细胞、真菌细胞等。
哺乳动物细胞表达体系具有高度的真实性和
生物活性，但是成本高、操作复杂。
真菌细胞表达体系具有高度的表
达效率和稳定性，但是无法进行翻译后修饰。
昆虫细胞表达体系则具
有高度的表达效率和稳定性，能够进行翻译后修饰，且成本相对较低，因此应该选择昆虫细胞作为宿主细胞。
最后，需要进行基因克隆和转染。
将白蚁木质纤维酶基因克隆到真核
表达载体中，然后将载体转染到昆虫细胞中。
转染后，需要进行筛选
和鉴定，确定表达效果和纯度。
总之，构建高效的白蚁木质纤维酶昆虫细胞表达体系需要选择合适的表达载体和宿主细胞，进行基因克隆和转染，最后进行筛选和鉴定。
这一研究对于生物质能源的开发和利用具有重要的意义。
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昆虫杆状病毒表达系统的分子基础
• 目前已知基因组全序列的杆状病毒有苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒 (Ac MNPV)、 家蚕核多角体病毒(BmNPV)、 黄杉毒蛾多核衣壳核多角体病毒 (OpMNPV)、 舞毒蛾多核衣壳核多角体病毒( Ld MNPV)、 甜菜夜蛾多核衣壳 核多角体病毒( Se MNPV)、 棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)以及斜纹夜蛾核 型多角体病毒( SplM t NPV) 杆状病毒在其生活史中共有两种形式的表型存在,在感染的初期( 0~ 24h), 主 要以细胞释放型病毒粒子( cell-released virus , CRV)为主, 也称为胞外型病毒 ( extracel lular vir us , ECV)或出芽型病毒 ( Budded vir us , BV); 在感染的晚 期主要以包埋型病毒( occlude d vir us , OV)的形式存在。杆状病毒的这两种 表型的形态、 蛋白组成、 病毒囊膜的来源、 感染组织特异性以及病毒入侵 宿主细胞的方式都不相同。 由于两种表型的病毒在结构组成上的差异, 所以杆状病毒在不同的时期需要表 达不同类型的蛋白来满足病毒颗粒不同形式的组装。昆虫杆状病毒的基因表 达共分为 4个时期: 极早期、 早期、 晚期、 迟晚期。4个时期的基因一环扣 一环,按时间先后, 以级联方式严格制约。早期表达的基因有 ie- 1、 me53、 pe38、 ie- 2等, 晚期表达的基因有 vp39 、vp80、 polh、 p10等, 这些不同的 基因所表达的蛋白各自具有不同的功能, 有些表达产物具有调控的功能, 而有 些仅仅只具有结构蛋白的作用。 在杆状病毒所表达的一系列蛋白中,有一类蛋白具有较高的表达量,并且均为病 毒基因组复制所非必需, 其中最具代表性的有多角体蛋白与 P10蛋白, 均属于 晚期表达的蛋白,受晚期启动子的调控。昆虫的杆状病毒表达系统正是利用了 这类蛋白的优点, 从而提供了外源 DNA插入座位。
表位标记与构建重组体注意事项
使用常用密码子 注意克隆位点（限制 性酶切位点）相符 5`端加上起始密码子 ATG 3`端加上终止密码子 用一种抗体可鉴别不同重组 可插入蛋白酶切位点 蛋白 不影响蛋白功能 基因，以利于产生天 有利于研究蛋白功能 然蛋白 常用表位：6His；FLAG； 其他常规构建载体的 LZ等 注意点
病毒基因组的结构特点
病毒基因组大小相差较大,与细菌或真核细胞相比，病毒 的基因组很小 病毒基因组可以由DNA组成，也可以由RNA组成 多数RNA病毒的基因组是由连续的核糖核酸链组成 ，病 毒基因组的大部分是用来编码蛋白质的 ，噬菌体（细胞 病毒）的基因是连续的；而真核细胞病毒的基因是不连续 的 ，无内含子 基因重叠即同一段DNA片段能够编码两种甚至三种蛋白 质分子，病毒基因组DNA序列中功能上相关的蛋白质的 基因或rRNA的基因往往丛集在基因组的一个或几个特定 的部位,形成一个功能单位或转录单元 ，多顺反子 除了反转录病毒以外，一切病毒基因组都是单倍体，每个 基因在病毒颗粒中只出现一次
杆状病毒_昆虫表达系统
杆状病毒基因组：闭环双链DNA，88-166kb 启动子：杆状病毒科核多角体病毒的多角蛋白强启动子 表达系统（两种）
杆状病毒表达系统（BEVS） 家蚕核型多角体病毒-家蚕表达系统
宿主：鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、脉翅 目、毛翅目的600多种昆虫 克隆基因方法：转移载体→共转染→同源重组→空斑筛选 →纯化→重组病毒
表位：抗原决定簇即抗原 分子于一特定抗体结合的 化学基团，一般由少至几 个氨基酸的多肽组成 用于重组DNA技术的示踪、 分析、纯化（亲和） 优点
基因导入的各种方法
光穿孔法：激光；悬浮细胞 冲击波：活体局部的基因转移 基因枪法：即微粒轰击；动物细胞，更适用于植 物细胞 穿孔法：脉冲电场；Cytomix缓冲液；70%细胞 死亡时效率最高 磷酸钙共沉淀法 脂质体法：Lipofectin；阳离子 抗体转染法：抗CD3，CD34或表面免疫求蛋白 其他：超声波法；微注射法原生质体融合法；反 转录病毒感染法
基因表达与调控
真核表达_昆虫杆状病毒表达系统
真核表达系统的种类和常用载体
1.真核表达系统的种类
酵母 丝状真菌 昆虫 哺乳动物细胞
2.真核表达载体
质粒：真核表达元件、 真核抗性
病毒载体：改建后
SV40病毒 腺病毒 反转录病毒 痘苗病毒
转基因动物
植物反应器
杆状病毒表达系统的局限性
• 1.无法进行连续性（高）表达 • 2.糖基化方式与哺乳动物存在一定差异 • 3.糖侧链甘露糖的成分较高，而复合寡糖缺 乏 • 4.功能基因组学的研究仍然比较薄弱 • 5.有关病毒晚期的高表达和调控机制等仍不 够明了 • 6.酵母筛选系统比昆虫细胞重组介质相对更 有优势，重组病毒与原病毒的混合增加筛 选难度
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杆状病毒表达系统优点
容量大：能插入12kb的外源基因 高表达：采用的polh基因启动子是目前所 知的最强的真核启动子；产物对宿主影响 小；产物可结晶 高效：可同时表达多个基因 安全：杆状病毒对脊椎动物无病原性 具加工修饰功能：昆虫细胞属较高等真核 细胞 家蚕表达系统中，家蚕易饲养
表达产物的检测技术
Western印迹法——免疫学方 法——抗原-抗体反应 荧光显微镜法——表位标记的 抗体与直接抗体进行荧光标 记——免疫学方法
• Western印迹法 蛋白样品制备→ SDS-PAGE（按
分子量大小）→电转移→一抗（特
异性）→二抗→显色 敏感度：1-5ng
杆状病毒-昆虫表达系统技术路线
构建真核表达系统_细胞必需表达元件
原核DNA序列 启动子 增强子 拼接信号 终止子和多聚腺苷化信号 筛选标记 动物病毒基因序列
病毒载体优点
真核细胞可识别的启动子 报告基因 感染周期，可持续复制 部分载体可整合入基因组 部分载体本身带有完整的 复制及表达元件 部分载体具有宿主细胞特 异性
SV40病毒
• 《SV40》(Simian vacuolating virus 40 or Simian virus 40)是猴空泡病毒40，猿猴病毒40或猴病毒 40的缩写，多瘤病毒科，这是在人类和猴子都发 现的致瘤病毒。SV40病毒的基因组是一种环形双 链的DNA，基因组5.2kb，病毒的直径45nm，病 毒成熟部位细胞核，无被膜，62个核壳粒亚单位， 这种大小很适于基因操作。同时它也是第一个完 成基因组DNA全序列分析的动物病毒。
识别受体 假病毒颗粒
• 杆状病毒及其基因组模型
昆虫杆状表达系统简介
• 杆状病毒是已知昆虫病毒中最大的类群 ,发现最 早 、研究最多且实用意义很大的昆虫病毒。20世 纪80年代以来由于杆状病毒表达载体系统 （baculovirus expression vector system，BEVS） 的建立 ,已被公认为是当今基因工程四大表达系统 之一 。该系统具有许多优点,如多角体启动子控制 下的高效表达 ,完善的转译后加工修饰 ,较易从无 血清培养上清中纯化的蛋白,无内毒素污染等。 • 杆状病毒载体系统主要分为两大类,一类是用于表 达单个外源基因的载体,另一类是多元表达载体,用 于插人并表达2个或多个外源基因
病毒复制（SV40示例）
• 以单纯疱疹病毒为例。 （1）病毒与细胞结合； （2）病毒进入细胞，去 包膜；（3）脱壳；（4） 病毒DNA进入细胞核； （5）病毒基因组复制， 合成子代病毒及病毒 mRNA；（6）以病毒基因 转录的mRNA进入细胞质； （7）病毒mRNA翻译病毒 子代蛋白，包括早期蛋白 和晚期蛋白；（8）装配 子代病毒；（9）出核， 同时披上包膜；（10）释 放到胞外
• BEVS通常由转移载体、亲本病毒和重组介质三部分组成, 其技术路线分以下几步:先将外源片段克隆到载体质粒中, 置于杆状病毒启动子控制之下, 上下游各有一段与亲本病 毒DNA 相匹配的侧翼序列, 构建成转移载体; 然后把转移 载体和野生型病毒共转染入昆虫细胞,通过同源重组将外 源片段插入到病毒基因组,再以特定的筛选标记和方法获 得重组病毒。由于病毒原来的非必需区段被外源片段取代, 当重组病毒在受体细胞内复制时,外源片段也得到了表达。 最后空斑纯化重组病毒, 扩大培养,分离、 纯化所表达的外 源蛋白。 • 技术路线英文参考文献：CHRIS TOPHER D R. Baculovirus expression protocols [ M ] . Totowa: Humana Press Inc, 1995: 12-23.
重组杆状病毒表达载体的构建
杆状病毒表达系统的应用
• • • • • • • • • • • • 1，基础研究 如为功能基因组学研究提供种类繁多、数量庞大的蛋白 2.开发医用疫苗和药物 HIV疫苗的研究与开发，禽流感病毒疫苗生产；家蚕宿主BEVS生产重组多态 药物，或生产鱼疫苗再用蚕蛹饲喂鱼，改善鱼类的食用品质 3.农业生物杀虫剂 家蚕重组NPV（核多角体病毒）用作生物杀虫剂的突出优点是对人体安全， 不伤害害虫的天敌，不污染环境 4.基因治疗 最近几年来,杆状病毒在小鼠和大鼠肝骨骼肌和中枢神经系统的基因转移中取 得成功 基因治疗参考文献： （小鼠和大鼠肝）Hofmann C. ,Strauss M. Gene. Therapy, 1998,5(4): 531~536. （小鼠骨骼肌）Pieroni L. ,Maione D. ,La Monica. N. Hum. Gene Therapy, 2001,12(8): 871~ 881. （小鼠中枢神经系统）Sarkis C. , Serguera C. , Petres S. , Buchet D. ,Ridet J.L. et al. J.Proc. Natl. Acad. A,2000,97(26):14638~14643.
杆状病毒表达系统的部分改进
• 1.用病毒早期启动子与晚期启动子以及嵌合与修饰启动子，让杆状病 毒系统持续表达 • 2.通过亲本病毒的线性化，非必需基因的缺失以增加外源基因表达途 径来大大提高重组病毒筛选效率与稳定性 • 3.杆状病毒穿梭载体bacmid（Baculovirus plasmid，杆状病毒质粒） 的构建，可被修饰并在原核细胞与真核细胞之间穿梭表达。 Bac-toBac system。这一方法利用了转座酶将外源基因转座到病毒基因组的 特异性位点, 重组后的病毒基因组现在被俗称为 Bacmid 。在 Bacmid 中, 外源基因被核多角体启动子控制, 并包含了不同的抗性基因及 LacZ缺失标记, 极大地方便了重组病毒的筛选及鉴定。 • 4.病毒滴度测定方法的改进，传统的病毒滴度测定方法是利用噬菌斑 试验, 这一方法极为突出的缺点是所需时间较长，报告蛋白来进行滴 度的测定, 如绿色荧光蛋白及半乳糖苷酶等。这些方法共有的缺点是 需要额外表达一个蛋白。用western印迹法，荧光显微镜法