基因定点突破
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重昼延伸PCR技术由于使用了具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而 在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来涌的扩增片段重叠拼接起来。 可简 单迅速的将两个DNA一片段连在 起，用于嵌合基因的构建。
重叠延伸PCR法 overlap extension PCR
1.引物对A（正向诱变引物F1和反向引物R1) 和引物对B（正向引物F2和反向诱变引物R2) 退火
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dut- (脱氧尿苷酸三磷酸酶缺乏) 能够积累尿嘧啶残基.，ung- (尿嘧啶脱糖苷 酶) 使得无法移除尿嘧啶残基
KunKel小结
1.用此种方法产生的突变体优势在于不必利用核苷酸探针标记 来筛选阳性噬菌斑，可直接通过序列分析来确定突变体，这样 就免除了繁杂的杂交程序。
2.此法的成功关键， 是要得到好的含U单链模板DNA（可用含 有目标基因的M13双链DNA载体感染E. coliCJ236品系，此为 大肠杆菌脱氧尿苷酸三磷酸酶和尿嘧啶脱糖苷酶双缺陷 dutung-菌株）
标题内容
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诚信铸就品质
创新引领未来
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方法介绍 1.寡核苷酸介导的基因突变
02 2.盒式突变
3.PCR介导的基因突变 4CRISPR/Cas介导基因突变
寡核苷酸介导的基因突变
寡核苷酸介导的基因突变是由加 拿大人迈克尔·史密斯 Michael Smith在1978所提出，因此而获得 了1993年诺贝尔化学奖。这一方法 被用来在体外对已知的DNA片断内 的核苷酸进行转换、增删的突变。
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远见力
决策力
创新力 执行力
感召力
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第四月 第三月 第二月 第一月
73% 82% 56%
32%
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2.盒式突变 盒式突变法具有比前两者简单易行、突变效率高等优点， 还可以在一对限制 酶切位点内一次突变多个位点。缺点是合成多条引物的成本较高。另外，在 一般情况下，在靶DNA 片段的两侧往往难以满足存在一对限制性酶切位点的 要求， 限制了该方法的广泛应用。
3.PCR 介导的定点突变法 其优点是操作较简单，突变的成功率可达100％。但它亦有两个缺点：①后 续工作较复杂， PCR扩增产物通常需要连接到载体分子上，然后才能对突变 的基因进行转录、转译等方面的研究 ；② TaqDNA聚合酶的保真性偏低；因 此PCR方法产生的DNA 片段要经过核苷酸序列测定，方可确证有无发生其它 突变。
03
PART 01
第三部分
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2015年2月
标题内容文字
2014年12月
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2013年5月
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2013年8月
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2014年4月
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2014年5月
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大引物PCR megaprimer PCR
1.用引物P1和含突基因的 引物P2扩增模板DNA产 生双链大引物(PCR1).
2.纯化大引物，去除PCR1 剩下的引物和脱氧核苷酸， 同时加入引物P3，形成带 突变基因的双链DNA
3. 扩增带有突变基因的双 链DNA
三种经典基因定点突变方法比较
1 寡核苷酸引物介导的定点突变法 其优点是保真度比PCR突变法高，经过改进后使该方法突变成功率大大提高 缺点是操作过程环节复杂、周期长， 而且在克隆待突变基因时会受到限制性 酶切位点的限制。
方
寡核苷酸介导的基因突变
法 1.将待突变基因插入到突变载体（M13噬菌 体）上，制备含突变基因的单链模板；
2. 将合成的寡核酸片段与单链模板退火， 在 DNA聚合酶，连接酶的作用下合成互补的双 链DNA
3. 将双链DNA转化大肠杆菌， 获得突变基因 （转化大肠杆菌是指将重组DNA分子导入大 肠杆菌受体细胞进行复制,增殖和表达）
直接用反应混合物转染
分级退火， 冰浴稳固异 源双链再加T4连接酶
经酚-仿抽提后再进行转染
转染效率： 3个空斑
转染效率：78个空斑
02
盒式突变cassette mutagenesis
1.1985年由Wells J.A提出的一种基因修饰技术
2.为利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，即所谓的 寡核苷酸盒(oligonucleotide cassette)，取代野生型基因中的相应序列。
2.通过PCR1和PCR2反应扩增出两种靶基因片 段。
3.用DNA聚合酶补平缺口，形成全长双链 DNA，进行PCR3扩增。
4.最后用引物F2和R2扩增出带有突变位点的 全长DNA片段(PCR4)
重叠PCR小结
优点：几乎没有特殊限制，而且成功率高
缺点： 需要2对引物， 进行3次PCR，并且需要对中间产物进行 纯化
4. 产生野生型、突变型的同源双链分子。可 以用限制性酶切法、 斑点杂交法和生物学法
来初步筛选突变的基因；
5.对突变体DNA基Fra Baidu bibliotek进行序列分析。
局限性：异源双链DNA分子并非真正异源 突变体子代中突变碱基被错配修复体系修复
提高寡核苷酸介导的基因突变效率方法介绍
这是1985年由 Kunkel等人建立的一种改进的寡核苷酸介导的基因 突变方法。
步骤 1.将复制型的M13噬菌体转染到脱氧尿苷酸三磷酸酶和尿嘧啶脱糖 苷酶双缺陷的E.coli (dut-, ung-) 菌株中，使U取代T代入DNA链 中（一般每个重组体20-30个）
2.以此种带U的DNA链为模板，用带突变碱基的寡核苷酸引物进行 复制，产生异源双链。
3. 将此异源双链转化到ung＋(尿嘧啶脱糖苷酶）菌株中生长， 含U 的模板链被破坏， 从而使子代DNA链大部分（～80%）含突变碱基 序列
3.然而， 并非所有变异区附近都能找到合适的限制位点， 如果不存在 限制位点， 就要用寡核苷酸指导的定位诱变引入限制位点。
02
盒式突变cassette mutagenesis
03
PCR介导的基因突变PCR site-directed mutagenesis
1.重叠延伸PCR法 2.大引物PCR法
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第一月
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项目分析
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原理为在正常情况下， 尿嘧啶脱糖苷酶(ung)可以去除掺入DNA中的尿嘧啶 残基。 但在ung-的菌株中，此酶失活。 因此在大肠杆菌脱氧尿苷酸三磷酸酶和尿嘧啶脱糖苷酶双缺陷dut-ung-菌株 中生长的M13噬菌体的DNA中将含有20-30个尿嘧啶残基。 用这些噬菌体感 染ung＋菌株， 尿嘧啶被迅速去除， DNA链遭到破坏， 感染力下降约5个数 量级
基因定点突变技术介绍
临床医学院
谢睿晋
目录
01
相关定义
方法介绍
02
定义 基因定点突变是一种分子生物学方法，用于对基因和任何基 因产品的DNA序列进行具体和有意的改变，包括碱基的添加、 删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的 目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手 段。
提高寡核苷酸介导的基因突变效率方法介绍
Oligo诱导突变的改进方法
1998年由武汉大学叶林柏等人对Oligo 诱导突变的方法进行了改进，2-3个核 苷酸突变替换频率可达80%-85%，及 时需要有道4-5氨基的缺失，突变频率 也高达40%-50%
方法对比
原KunKel
DNA聚合酶和T4连接酶同步加入
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重叠延伸PCR法 overlap extension PCR
重叠延伸PCR技术(SOE PCR)是指在PCR技术的基础上，采用具有互补末端的引物 使PCR产物形成了重叠链，通过重叠链的延伸，将不同来源的片段重叠拼接起来的一项 新技术。该技术可以很快获得依靠其它限制性内切酶消化的方法难以得到的产物，其成 功的关键是重叠互补引物的设计。 重叠延伸PCR在基因的定点突变，长片段基因的合 成、基因敲除以及目的基因的扩增有重要的作用。
重叠延伸PCR法 overlap extension PCR
1.引物对A（正向诱变引物F1和反向引物R1) 和引物对B（正向引物F2和反向诱变引物R2) 退火
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KunKel小结
1.用此种方法产生的突变体优势在于不必利用核苷酸探针标记 来筛选阳性噬菌斑，可直接通过序列分析来确定突变体，这样 就免除了繁杂的杂交程序。
2.此法的成功关键， 是要得到好的含U单链模板DNA（可用含 有目标基因的M13双链DNA载体感染E. coliCJ236品系，此为 大肠杆菌脱氧尿苷酸三磷酸酶和尿嘧啶脱糖苷酶双缺陷 dutung-菌株）
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方法介绍 1.寡核苷酸介导的基因突变
02 2.盒式突变
3.PCR介导的基因突变 4CRISPR/Cas介导基因突变
寡核苷酸介导的基因突变
寡核苷酸介导的基因突变是由加 拿大人迈克尔·史密斯 Michael Smith在1978所提出，因此而获得 了1993年诺贝尔化学奖。这一方法 被用来在体外对已知的DNA片断内 的核苷酸进行转换、增删的突变。
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2.盒式突变 盒式突变法具有比前两者简单易行、突变效率高等优点， 还可以在一对限制 酶切位点内一次突变多个位点。缺点是合成多条引物的成本较高。另外，在 一般情况下，在靶DNA 片段的两侧往往难以满足存在一对限制性酶切位点的 要求， 限制了该方法的广泛应用。
3.PCR 介导的定点突变法 其优点是操作较简单，突变的成功率可达100％。但它亦有两个缺点：①后 续工作较复杂， PCR扩增产物通常需要连接到载体分子上，然后才能对突变 的基因进行转录、转译等方面的研究 ；② TaqDNA聚合酶的保真性偏低；因 此PCR方法产生的DNA 片段要经过核苷酸序列测定，方可确证有无发生其它 突变。
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大引物PCR megaprimer PCR
1.用引物P1和含突基因的 引物P2扩增模板DNA产 生双链大引物(PCR1).
2.纯化大引物，去除PCR1 剩下的引物和脱氧核苷酸， 同时加入引物P3，形成带 突变基因的双链DNA
3. 扩增带有突变基因的双 链DNA
三种经典基因定点突变方法比较
1 寡核苷酸引物介导的定点突变法 其优点是保真度比PCR突变法高，经过改进后使该方法突变成功率大大提高 缺点是操作过程环节复杂、周期长， 而且在克隆待突变基因时会受到限制性 酶切位点的限制。
方
寡核苷酸介导的基因突变
法 1.将待突变基因插入到突变载体（M13噬菌 体）上，制备含突变基因的单链模板；
2. 将合成的寡核酸片段与单链模板退火， 在 DNA聚合酶，连接酶的作用下合成互补的双 链DNA
3. 将双链DNA转化大肠杆菌， 获得突变基因 （转化大肠杆菌是指将重组DNA分子导入大 肠杆菌受体细胞进行复制,增殖和表达）
直接用反应混合物转染
分级退火， 冰浴稳固异 源双链再加T4连接酶
经酚-仿抽提后再进行转染
转染效率： 3个空斑
转染效率：78个空斑
02
盒式突变cassette mutagenesis
1.1985年由Wells J.A提出的一种基因修饰技术
2.为利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，即所谓的 寡核苷酸盒(oligonucleotide cassette)，取代野生型基因中的相应序列。
2.通过PCR1和PCR2反应扩增出两种靶基因片 段。
3.用DNA聚合酶补平缺口，形成全长双链 DNA，进行PCR3扩增。
4.最后用引物F2和R2扩增出带有突变位点的 全长DNA片段(PCR4)
重叠PCR小结
优点：几乎没有特殊限制，而且成功率高
缺点： 需要2对引物， 进行3次PCR，并且需要对中间产物进行 纯化
4. 产生野生型、突变型的同源双链分子。可 以用限制性酶切法、 斑点杂交法和生物学法
来初步筛选突变的基因；
5.对突变体DNA基Fra Baidu bibliotek进行序列分析。
局限性：异源双链DNA分子并非真正异源 突变体子代中突变碱基被错配修复体系修复
提高寡核苷酸介导的基因突变效率方法介绍
这是1985年由 Kunkel等人建立的一种改进的寡核苷酸介导的基因 突变方法。
步骤 1.将复制型的M13噬菌体转染到脱氧尿苷酸三磷酸酶和尿嘧啶脱糖 苷酶双缺陷的E.coli (dut-, ung-) 菌株中，使U取代T代入DNA链 中（一般每个重组体20-30个）
2.以此种带U的DNA链为模板，用带突变碱基的寡核苷酸引物进行 复制，产生异源双链。
3. 将此异源双链转化到ung＋(尿嘧啶脱糖苷酶）菌株中生长， 含U 的模板链被破坏， 从而使子代DNA链大部分（～80%）含突变碱基 序列
3.然而， 并非所有变异区附近都能找到合适的限制位点， 如果不存在 限制位点， 就要用寡核苷酸指导的定位诱变引入限制位点。
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1.重叠延伸PCR法 2.大引物PCR法
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基因定点突变技术介绍
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定义 基因定点突变是一种分子生物学方法，用于对基因和任何基 因产品的DNA序列进行具体和有意的改变，包括碱基的添加、 删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的 目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手 段。
提高寡核苷酸介导的基因突变效率方法介绍
Oligo诱导突变的改进方法
1998年由武汉大学叶林柏等人对Oligo 诱导突变的方法进行了改进，2-3个核 苷酸突变替换频率可达80%-85%，及 时需要有道4-5氨基的缺失，突变频率 也高达40%-50%
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重叠延伸PCR法 overlap extension PCR
重叠延伸PCR技术(SOE PCR)是指在PCR技术的基础上，采用具有互补末端的引物 使PCR产物形成了重叠链，通过重叠链的延伸，将不同来源的片段重叠拼接起来的一项 新技术。该技术可以很快获得依靠其它限制性内切酶消化的方法难以得到的产物，其成 功的关键是重叠互补引物的设计。 重叠延伸PCR在基因的定点突变，长片段基因的合 成、基因敲除以及目的基因的扩增有重要的作用。