基因定点突破
定点突变技术的原理和步骤
定点突变技术的原理和步骤嘿，咱今儿来聊聊定点突变技术呀！这玩意儿可神奇了呢！你想啊，就好像是一个特别厉害的魔法，能让基因按照我们的想法来变一变。
那定点突变技术的原理是啥呢？简单来说，就是要精准地在基因的特定位置上搞点小改动。
这就好比是在一个庞大的基因拼图里，准确地找到那一块我们想要动的小拼图，然后给它换个模样。
这可不是随随便便就能做到的哦，得有非常精细的操作和技巧才行呢。
那具体咋操作呢？这步骤可不能马虎。
首先呢，得设计好要突变的那个点，这就像是给要走的路先规划好方向，可不能瞎走。
然后，要准备好各种工具和材料，这就跟出门得带好钥匙、钱包一样重要。
接下来，就是真正开始动手啦！就像一个精巧的工匠，小心翼翼地对基因进行操作。
把原来的那块小拼图取出来，再把我们准备好的新的放进去。
这过程可得特别仔细，不能有一点差错，不然可就前功尽弃啦！做完这些还不算完哦，还得检查检查，看看变的对不对，效果好不好。
这就像我们做完作业得检查一遍一样，可不能马马虎虎的。
你说这定点突变技术是不是很神奇？它能让我们对基因进行精确的改造，为很多领域带来了巨大的帮助。
比如说在医学上，能帮助我们研究疾病的发生机制，找到更好的治疗方法。
在农业上呢，能让农作物变得更优秀，产量更高，品质更好。
想象一下，如果没有定点突变技术，我们对基因的了解和利用会少多少啊！那得是多大的损失呀！所以说，这项技术真的是太重要啦！总之呢，定点突变技术就是这样一个既有趣又有用的东西。
它让我们对基因的操控变得更加精准和有效。
我们要好好利用它，让它为我们的生活带来更多的好处和惊喜。
你说是不是呀？。
定点突变原理
定点突变原理定点突变原理是指生物体基因组中某个特定位置的碱基序列发生突变的现象。
这种突变可以是单个碱基的替换、插入或缺失，也可以是更大范围的基因片段的改变。
定点突变可以导致生物体的遗传信息发生改变，从而影响其表型特征和遗传特性。
定点突变的发生通常是由于DNA复制过程中的错误或外部环境因素的影响。
在DNA复制过程中，酶类会不时出现错误，导致新合成的DNA链上出现错误的碱基。
此外，环境因素如辐射、化学物质等也会对DNA分子产生损害，导致定点突变的发生。
定点突变可以分为两种类型，点突变和插入/缺失突变。
点突变是指单个碱基的改变，包括错义突变、无义突变和无框移码突变。
错义突变是指由于碱基替换导致对应的氨基酸发生改变，从而影响蛋白质的结构和功能；无义突变是指由于碱基替换导致对应的密码子变成终止密码子，导致蛋白质合成过程中提前终止；无框移码突变是指由于碱基插入或缺失导致密码子的读框发生改变，从而影响蛋白质合成过程中的氨基酸序列。
插入/缺失突变则是指在基因组中插入或缺失一段碱基序列，导致基因的框架发生改变，进而影响蛋白质的合成。
定点突变的发生对生物体的遗传特性和表型特征都会产生影响。
在遗传学研究中，定点突变被认为是生物体进化过程中的重要驱动力之一。
一些有利于生物体适应环境的定点突变可以被自然选择所保留，从而在种群中逐渐普及。
而一些不利于生物体适应环境的定点突变则可能被淘汰。
因此，定点突变在生物体的进化过程中扮演着重要的角色。
定点突变也是许多遗传性疾病发生的原因之一。
一些致病基因中的定点突变会导致蛋白质结构和功能的改变，从而引发一系列遗传性疾病。
对定点突变的研究有助于我们更好地理解遗传疾病的发病机制，并为相关疾病的治疗提供理论基础。
总之，定点突变是生物体遗传信息发生变化的重要方式，它对生物体的遗传特性、进化过程以及遗传性疾病的发生都具有重要影响。
对定点突变的深入研究不仅有助于我们更好地理解生物体的遗传特性，也为相关领域的研究提供了重要理论基础。
定点突变的步骤
定点突变的步骤定点突变是一种在基因研究中超级酷的技术呢。
咱就先来说说最开始要做的事儿吧。
得先确定好你要突变的那个基因序列。
这就像是在一大串密码里，找到你想搞点小把戏的那一小段密码一样。
这个基因序列的选择可不能马虎，得是对整个研究或者实验有重要意义的部分哦。
接着呀，就得设计突变引物啦。
这引物就像是一把特殊的小钥匙，能精准地找到你想要突变的地方。
设计引物的时候可讲究了，要考虑好多因素，什么碱基互补啦，长度合适啦之类的。
就像你搭配衣服，得考虑颜色搭不搭，款式合不合适一样。
有了引物之后呢，就是进行PCR反应啦。
这PCR反应就像是一个小小的基因复印机，不过呢，它可是按照你设计的引物来工作的。
它会把包含你要突变位置的那一段基因大量地复制出来，而且在这个过程中，因为有引物的引导，就会在复制的时候产生你想要的突变。
这个过程就像是一场小小的基因魔法秀，在分子的小世界里悄悄地改变着基因的模样。
PCR反应完了之后，还得对产物进行验证呢。
这就好比做完了一件艺术品，你得检查检查有没有瑕疵。
验证的方法有不少，像是测序之类的。
测序就像是给基因拍个高清照片，然后仔细看看每个碱基是不是都在正确的位置，有没有按照我们想要的突变发生了改变。
要是验证通过了，那就可以把这个突变后的基因放到细胞或者生物体里啦。
这就像是把一个新的小零件装到一个大机器里，然后看看这个新零件会给大机器带来什么样的变化。
也许会产生一些意想不到的效果，也许会按照我们预想的那样改变细胞或者生物体的某些特性。
定点突变虽然听起来很复杂，但就像做一道超级复杂的菜一样。
只要一步一步按照正确的步骤来，精心准备每一个材料，用心操作每一个步骤，最后就能做出一道让自己满意的“基因大餐”啦。
这过程中虽然可能会遇到不少小麻烦，就像做菜的时候盐放多了或者火候没掌握好，但只要不断调整，总会得到想要的结果的。
而且每一次成功的定点突变，都像是打开了一扇通往新知识新发现的小窗户，让人特别有成就感呢。
基因定点突变名词解释
基因定点突变名词解释嘿，咱今儿来唠唠基因定点突变这档子事儿！你说基因就像是生命的密码本，那基因定点突变呢，就好比是给这个密码本来了个精准的修改。
咱就打个比方哈，好比一个大机器，基因就是让这个机器运转的各种零件和程序。
那基因定点突变呢，就是咱专门挑出其中一个小零件或者一小段程序，给它变一变。
这一变可不得了，可能整个机器的运行状态就不一样啦！想象一下，本来一个生物有着特定的性状，就像一只兔子一直是白色的。
但通过基因定点突变，嘿，说不定这兔子就能变成灰色的或者其他颜色啦！这多神奇呀！基因定点突变可不是随便乱改的哦，这得非常精细、非常小心才行。
就跟咱修钟表似的，得用特别小的工具，特别仔细地去摆弄那些小零件。
一个不小心，可能整个钟表就不走了，或者走得不准啦！它的作用可大着呢！可以用来研究基因的功能呀。
咱想知道某个基因到底是干啥用的，那就给它变一变，看看生物会有啥变化，不就清楚啦？而且在医学上也很重要呢！比如说有些疾病是因为基因出了问题，那咱通过基因定点突变，说不定就能找到治疗的办法呢。
在农业上也有用武之地呀！可以让农作物变得更抗病虫害，产量更高。
这就像是给农作物来了个超级进化，让它们变得更强壮、更厉害！不过呢，这事儿也不是那么容易的。
就像走钢丝一样，得稳稳当当的，稍有偏差可能就会出大乱子。
而且也不是说变了就一定能达到咱想要的效果，有时候可能会有意想不到的结果哦。
那怎么实现基因定点突变呢？这就得靠那些厉害的科学家们啦！他们有各种高科技的手段和工具，就像孙悟空有金箍棒一样，能把基因这个“妖怪”给制服咯！总之呢，基因定点突变是个很有意思、很有挑战性的领域。
它就像是打开生命奥秘大门的一把钥匙，让我们能更深入地了解生命的奇妙之处。
咱可得好好研究研究，说不定哪天就能给我们的生活带来翻天覆地的大变化呢！可不是嘛！。
定点突变讲解学习
1.1.1 基因定点突变简介（INTRODUCTION ）定点突变（site-directed mutagenesis ）是指通过聚合酶链式反应（PCR ）等方法向目的DNA 片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变（单点/多点）等。
定点突变能迅速、高效的提高DNA 所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
原理上分两种：1. 搭桥法（重叠PCR ）2. 一步法（全质粒PCR ） ► 搭桥法（重叠PCR ）定点突变搭桥法共需要两对引物（两端引物，中间引物）,三次PCR ，其中前两次PCR 可同时完成，原理如图一所示：两次PCR 的产物回收，作为模板加上两端引物primer F 和primer R 进行PCR3。
PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增实验步骤（PROCEDURE ）1. 两对引物的Tm 值都应相当。
两端PCR 引物参照普通引物设计并无特殊要求。
所需引入突变包含在中间引物互补区域内 （需要在两条引物上均引入点突变），请勿将突变位点置于引物3’ 末端且突变位点距离3’ 端最少要有15个碱基，因为有非匹配碱基的存在，太短会导致引物与模板无法结合。
2. 对于一对中间引物的设计，如左图所示（高亮处是突变碱基），两引物间可以是完全互补，也可是部分互补。
但两引物间互补部分的Tm 值不能太低（太低导致PCR3无法配对延伸）。
搭桥法定点突变3.PCR：PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增；PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增。
两次PCR的产物回收，作为模板加上两端引物primer F和primer R 进行PCR3。
（注意前两次不能使用taq聚合酶，因为taq在产物3’ 端多加一个A，导致后续的PCR3出现移码突变）4.克隆：回收PCR3产物，酶切，连接，转化。
基因定点突变全攻略
基因定点突变全攻略一、定点突变得目得把目得基因上面得一个碱基换成另外一个碱基.二、定点突变得原理定点突变就是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目得DNA片段（可以就是基因组，也可以就是质粒)中引入所需变化（通常就是表征有利方向得变化）,包括碱基得添加、删除、点突变等。
定点突变能迅速、高效得提高DNA所表达得目得蛋白得性状及表征，就是基因研究工作中一种非常有用得手段。
体外定点突变技术就是研究蛋白质结构与功能之间得复杂关系得有力工具，也就是实验室中改造/优化基因常用得手段。
蛋白质得结构决定其功能,二者之间得关系就是蛋白质组研究得重点之一。
对某个已知基因得特定碱基进行定点改变、缺失或者插入,可以改变对应得氨基酸序列与蛋白质结构，对突变基因得表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构与功能得关系,探讨蛋白质得结构/结构域。
而利用定点突变技术改造基因：比如野生型得绿色荧光蛋白（wtGFP)就是在紫外光激发下能够发出微弱得绿色荧光,经过对其发光结构域得特定氨基酸定点改造,现在得GFＰ能在可见光得波长范围被激发（吸收区红移),而且发光强度比原来强上百倍,甚至还出现了黄色荧光蛋白,蓝色荧光蛋白等等。
定点突变技术得潜在应用领域很广,比如研究蛋白质相互作用位点得结构、改造酶得不同活性或者动力学特性,改造启动子或者DNＡ作用元件,提高蛋白得抗原性或者就是稳定性、活性、研究蛋白得晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面．通过设计引物,并利用ＰCR将模板扩增出来,然后去掉模板，剩下来得就就是我们得PCR 产物,在PCＲ产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆，再测序确定就行了．三、引物设计原则引物设计得一般原则不再重复.突变引物设计得特殊原则:(1）通常引物长度为2５~４5 bp,我们建议引物长度为3０~35 bp。
一般都就是以要突变得碱基为中心,加上两边得一段序列,两边长度至少为1１—12 bｐ。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要１1-1２个ｂp才能与模板搭上,而这种突变ＰＣR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补得引物。
基因定点突变技术原理
基因定点突变技术原理
基因定点突变技术是一种用于改变特定基因序列的方法。
它可以被用于研究基因功能，以及开发新的基因治疗方法。
基因定点突变技术的原理是利用特定的酶切位点或特异性识别序列，将新的DNA序列插入到目标基因中。
这种技术通常使用质粒或病毒载体来将新的DNA序列导入目标
基因中，然后使用细胞转染或转化的方法将质粒或病毒载体导入细胞中，从而实现对目标基因的改变。
基因定点突变技术不仅可以用于改变单个基因的序列，还可以被用于删除或插入多个基因。
这种技术的应用非常广泛，包括基因治疗、基因工程以及基因组学研究等领域。
但是基因定点突变技术也存在一些挑战，包括技术成本高、效率低、难以操作等问题。
因此，不同的实验室和公司都在开发新的基因定点突变技术，以突破这些技术难关。
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基因定点突变全攻略
基因定点突变全攻略一、定点突变得目得把目得基因上面得一个碱基换成另外一个碱基.二、定点突变得原理定点突变就是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目得DNA片段（可以就是基因组，也可以就是质粒)中引入所需变化（通常就是表征有利方向得变化）,包括碱基得添加、删除、点突变等。
定点突变能迅速、高效得提高DNA所表达得目得蛋白得性状及表征，就是基因研究工作中一种非常有用得手段。
体外定点突变技术就是研究蛋白质结构与功能之间得复杂关系得有力工具，也就是实验室中改造/优化基因常用得手段。
蛋白质得结构决定其功能,二者之间得关系就是蛋白质组研究得重点之一。
对某个已知基因得特定碱基进行定点改变、缺失或者插入,可以改变对应得氨基酸序列与蛋白质结构，对突变基因得表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构与功能得关系,探讨蛋白质得结构/结构域。
而利用定点突变技术改造基因：比如野生型得绿色荧光蛋白（wtGFP)就是在紫外光激发下能够发出微弱得绿色荧光,经过对其发光结构域得特定氨基酸定点改造,现在得GFＰ能在可见光得波长范围被激发（吸收区红移),而且发光强度比原来强上百倍,甚至还出现了黄色荧光蛋白,蓝色荧光蛋白等等。
定点突变技术得潜在应用领域很广,比如研究蛋白质相互作用位点得结构、改造酶得不同活性或者动力学特性,改造启动子或者DNＡ作用元件,提高蛋白得抗原性或者就是稳定性、活性、研究蛋白得晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面．通过设计引物,并利用ＰCR将模板扩增出来,然后去掉模板，剩下来得就就是我们得PCR 产物,在PCＲ产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆，再测序确定就行了．三、引物设计原则引物设计得一般原则不再重复.突变引物设计得特殊原则:(1）通常引物长度为2５~４5 bp,我们建议引物长度为3０~35 bp。
一般都就是以要突变得碱基为中心,加上两边得一段序列,两边长度至少为1１—12 bｐ。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要１1-1２个ｂp才能与模板搭上,而这种突变ＰＣR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补得引物。
基因定点突变全攻略
基因定点突变全攻略基因定点突变是指基因序列中的一些碱基发生了改变，可以是单个碱基的替换、插入或删除。
这种突变一般发生在DNA的编码区域，会导致蛋白质的氨基酸序列发生改变，从而影响蛋白质的功能。
基因定点突变在许多遗传病和疾病中起着重要的作用。
以下是关于基因定点突变的全攻略。
1.基因定点突变的类型基因定点突变可以分为三类：错义突变、无义突变和非义突变。
错义突变是指被改变的碱基导致了密码子的改变，从而使蛋白质的氨基酸序列发生了改变。
无义突变是指被改变的碱基导致了密码子的提前终止，从而使蛋白质的合成过早终止。
非义突变是指被改变的碱基导致了密码子的改变，但不会改变蛋白质的合成。
2.基因定点突变的起因基因定点突变可以由多种因素引起，如自然突变、致突变剂和辐射。
自然突变是指在正常细胞分裂和DNA复制过程中产生的突变。
致突变剂是指能够引起DNA突变的化学物质或物理因素，如化学药物、辐射等。
辐射包括离子辐射和非离子辐射，如X射线、紫外线等。
3.检测和诊断基因定点突变检测和诊断基因定点突变可以通过分子生物学技术进行，如PCR、DNA测序和核酸杂交等。
PCR可以扩增特定的DNA片段，从而使突变的碱基更容易被检测到。
DNA测序可以确定基因序列的每个碱基，从而找到突变的位置和类型。
核酸杂交可以通过与已知突变序列杂交，检测是否存在突变。
4.基因定点突变的遗传5.基因定点突变与疾病总结：基因定点突变是基因序列中的一些碱基发生改变，影响蛋白质的功能。
基因定点突变可以分为错义突变、无义突变和非义突变。
突变的原因包括自然突变、致突变剂和辐射。
基因定点突变的检测和诊断可以通过分子生物学技术进行。
基因定点突变可以遗传给后代，影响他们的生长和发育。
基因定点突变在许多疾病中起着重要作用，了解基因突变对于早期诊断和治疗具有重要意义。
基因定点突变技术
寡核苷酸介导的定点突变
• 寡聚核苷酸定点诱 变技术是由加拿大 的生物化学家 ( michael smith )发明 的.
寡核苷酸定点突变基本原理
• 合成一段寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物，使其与带有目的基因 完全互补。
• 合成的寡核苷酸引物除短的错配区外，与目的基因完全互补。 • 然后用DNA聚合酶使寡核苷酸引物延伸，完成单链DNA的复制。 • 由此产生的双链DNA，一条链为野生型亲代链，另一条为突变型
子代链。 • 将获得的双联分子通过转导入宿主细胞，并筛选出突变体其中
基因已被定向修改
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
盒式突变
• 1985年Wells提出的一种基因修饰技术—盒式突变。
• 盒式突变：用一段人工合成具有突变序列的DNA片段，取代 野生型基因中的相应序列。
• 然而，并非所有变异区附近都能找到合适的限制位点，如 果不存在限制位点，就要用寡核苷酸指导的定位诱变引入 限制位点。
• 定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互 作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改 造启动子或者DNA作用元件，引入新的酶切位点，提高蛋白 的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以 及药物研发、基因治疗等等方面。
应用前景
• 不同于定点突变的是基于PCR的随机突变，通过改变PCR条件提 高PCR过程中的随机出错，这种方法适用于未知的蛋白质，作全 局性分析，所以有人称为饱和突变（saturation mutagenesis）。 不过这种方法由于没有目的性，分析操作相当繁琐，并且不会出 现一个位点2个以上碱基突变，因而应用上有局限性。定点突变 适用于蛋白结构已有初步了解的基因，比PCR随机突变更有目的 性，也更为精确，简单，同时改造基因更加“随心所欲”。由于 定点突变技术在蛋白质组学中有这非常广泛的应用前景，相信这 个技术在不远的将来还会有更大的改进和发展，也必将为更多人 熟悉应用。
基因定点突变方法及其应用
基因定点突变方法及其应用基因定点突变是指在基因组中特定位置的发生的突变。
基因定点突变可以是单个碱基的突变，也可以是多个碱基的突变。
这可以发生在DNA、RNA或蛋白质的编码区域或非编码区域。
基因定点突变方法是用于研究基因突变的工具和技术。
它们在生物医学研究、疾病诊断、药物研发等领域有着广泛的应用。
1.PCR扩增：PCR扩增是一种常用的基因定点突变方法，可以快速有效地扩增所需的DNA片段。
通过在PCR反应中引入突变引物，可以在特定位点引入单个碱基变异。
这种方法被广泛应用于基因功能研究、遗传性疾病的诊断和突变的检测等领域。
2.扩增-测序：扩增-测序方法是一种将突变引物引入待测基因位点的PCR扩增方法，随后使用测序技术验证突变是否成功。
这种方法可用于研究基因突变与人类遗传病之间的相互关系，还可以用于检测药物抗性突变、病毒突变等领域。
3.分子克隆：分子克隆是一种将特定DNA片段插入载体DNA的方法。
通过将突变片段与目标DNA结合，随后将其放入宿主细胞，可将所需的突变引入到目标基因中。
这种方法广泛应用于蛋白质工程、基因功能研究等领域。
4. CRISPR-Cas9系统：这些基因定点突变方法在基因功能研究、疾病诊断和治疗、药物研发等领域有着广泛的应用。
在基因功能研究中，通过引入特定的突变，研究人们可以研究基因的功能和调控机制。
例如，通过基因定点突变，可以研究基因在发育、免疫反应、代谢调节等过程中的作用和调节机制。
在疾病诊断和治疗中，基因定点突变方法可以用于检测与一些遗传性疾病有关的突变。
例如，通过扩增-测序方法可以检测BRCA1和BRCA2基因的突变，从而评估患者患乳腺和卵巢癌的风险。
此外，基因定点突变方法也可以用于基于个体遗传背景的个体化药物治疗。
在药物研发领域，基因定点突变方法可以用于评估药物的疗效和副作用。
通过引入特定的突变，可以模拟蛋白质靶点的突变，评估药物对该靶点的亲和力和选择性。
这对于开发更有效和安全的药物具有重要意义。
基因的定点突变的原理
基因的定点突变的原理基因的定点突变是指在DNA序列中的特定位置发生的突变，即碱基序列的改变。
这种突变发生在特定的位置，通常是基因编码区域，会引起氨基酸序列的改变，从而对蛋白质的功能产生影响。
定点突变的原理主要涉及以下几个方面：1. 突变的起源：定点突变可以是自发发生的，也可以是由外部因素引起的。
自发突变通常是由DNA复制过程中的错误引起的，包括碱基替换、插入或缺失等变异。
而外部因素如辐射、化学物质等也可能引起DNA损伤并导致定点突变。
2. 碱基替代：定点突变最常见的形式是碱基替代，即一个碱基被另一个碱基替代。
这种替代可能是同义突变，即替代后的密码子依然编码相同的氨基酸。
也可能是错义突变，即替代后的密码子编码不同的氨基酸，从而改变蛋白质的结构和功能。
3. 密码子的改变：在定点突变时，被替代的碱基往往位于密码子序列中的特定位置。
这种替代可能导致密码子的改变，从而改变蛋白质的翻译过程。
例如，突变可能导致起始密码子的改变，影响蛋白质的翻译起始，或者导致终止密码子的改变，影响蛋白质的翻译终止。
4. 功能影响：定点突变引起的氨基酸序列的改变可能会影响蛋白质的结构和功能。
如果突变发生在蛋白质的活性位点或功能域内，可能会影响蛋白质的结合能力、催化能力或信号转导等功能。
这种影响可能是有益的，例如产生对环境更有优势的适应性变异，也可能是有害的，例如导致疾病的发生。
总之，定点突变是指DNA序列特定位置发生的突变，可能是自发发生的或由外部因素引起的。
突变可以是碱基替代，导致密码子的改变，进而影响蛋白质的结构和功能。
这些突变的结果可能是有益的适应性变异，也可能是有害的疾病突变。
基因定点突变技术简介
如果将简并 的突变寡 核苷酸 插入 到质 粒载体分 子上 ，
在一次的实验 中便 可 以获得 数量 众多 的突变体 ， 大大 减少 了突变需要的次数 。这种方法适合研究 蛋 白质分 子 中不同位点的氨 基酸作 用 。缺 点是在 靶 Ｄ Ｎ Ａ 区段 的两侧需存在一对 限制酶单 切点 ， 限制 了该 方法 的广
的异源双链分子 ， 在Ｔ ａ ｑ酶 的作用下 ， 产 生含有重叠序 列 的双链 Ｄ Ｎ Ａ分子 ， 这种 Ｄ Ｎ Ａ分子再 用 两 个 外 侧 引
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３ ８・
生物 学教 学 ２ ０ １ ３ 年（ 第３ ８ 卷） 第１ ２ 期
对 细胞 大 小 与 物 质 运 输 的 关 系模 拟 实验 的研 究
生物学 教 学 ２ ０ １ ３ 年（ 第３ ８ 卷） 第１ ２ 期
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３７ ・
基 因定 点 突变 技 术 简 介
胡文斌 （ 湖 北 省 武 汉 市 黄 陂 区 第 一中 学４ ３ ｏ ３ ０ ０ ）
一
般来说 ， 基 因突 变是不定 向的， 是随机 的， 且 突
核苷酸片段 ， 取代野生 型基 因中相应序 列 Ｊ 。这种突 变 的寡核苷酸是 由两条寡核苷酸组成 的 ， 当其 退火 时， 按设计要求产生克隆需要 的黏性末端 。由于不存在异 源双链的 中间体 ， 因此重组质 粒全部是突 变体 （ 图２ ） 。
散速度一致 ， 约为 ０ ． ５ ｃ ｍ。 琼脂块 的边 长 越 大 ， 表 面 体 积 之 比值 越 小 ，
内通过单位面积 细胞膜 的物质量 的影响不大 。与其 说 细胞增 大物 质运输 效率降低 ， 不 如说细 胞膜相 对于 细
胞（ 质） 的需要 而言“ 负 担” 加重 。
３ 对细胞 大小与 物质运 输的 关 系模拟 实验 的补 充实
基因定点突变技术简介-sill
基因定点突变技术简介：一般来说，基因突变是不定向的，是随机的，且突变频率非常低。
而通过定点突变技术，可以按照预定设计，对某个已知基因的特定碱基进行定点增删或转换，最终改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，因此基因定点突变技术是蛋白质工程研究中的重要工具。
基因定点突变主要有以下三种方法：1.寡核苷酸介导的定点突变该方法以M13噬菌体的DNA为载体，在操作时，首先利用转基因技术，将待诱变的目的基因插入到M13噬菌体的正链DNA上，制备含有目的基因的单链DNA。
再使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，启动单链DNA分子进行复制，这段寡核苷酸引物便成为新合成的DNA子链的一个组成部分，将其转入细胞后，经过不断复制，可获得突变的DNA分子。
Stratagene公司研制了QuikChangeLightning Site-Directed Mutagenesis Kit即是在此种方法上进行改良的：以含目的DNA的质粒为模板，在要突变处设计一对反向互补的引物，用高保真酶进行扩增，再用dpnI消化掉质粒模板，将已经形成环状的PCR产物转化进大肠杆菌就可以。
2．盒式定点突变该方法是利用一段人工合成的含有突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中相应序列。
这种突变的寡核苷酸是由两条寡核苷酸组成的，当其退火时，按设计要求产生克隆需要的黏性末端。
由于不存在异源双链的中间体，因此重组质粒全部是突变体。
但这种方法需要在靶DNA区段的两侧存在一对限制酶单切点，限制了该方法的使用。
3.PCR介导的定点突变经典PCR介导的定点突变法，需要4种扩增引物，进行3次PCR反应(见图2)。
头两次PCR反应中，应用两个互补的并在相同部位具有相同碱基突变的内侧引物，扩增形成两条有一端可彼此重叠的双链DNA片段，去除未参入的多余引物之后，这两条双链DNA 片段经变性和退火可以形成具有3’凹末端的异源双链分子，在TaqDNA聚合酶的作用下，产生含重叠序列的双链DNA分子。
基因定点突变技术.
4、大引物诱变法
首先用正向突变引物（M） 和反向引物（R1），扩增模板 DNA产生双链大引物（PCR1）， 与野生型DNA分子混合后退火并 使之复性，第二轮PCR中加入正 向引物（F2），与PCR1中产生 的一条互补链配对，扩增产生带 有突变的双链DNA。由于F2中的 退火温度显著高于第一轮PCR所 使用的引物M和R1，因此，可忽 略引物M和R1在本轮反应中所造 成的干扰。
1、寡核苷酸盒式诱变
（Cassette mutagenesis）
利用一段人工合成的具有突变 序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸 盒，取代野生型基因中的相应序列。
2、寡核苷酸引物诱变
使用化学合成的含有突变碱基的寡 核苷酸片段作为引物，启动单链DNA 分子进行复制，随后这段寡核苷酸引 物便成为了新合成DNA子链的一个组 成部分，因此所产生出来的新链便具 有已发生突变的碱基序列
2寡核苷酸引物诱变使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作为引物启动单链dna分子进行复制随后这段寡核苷酸引物便成为了新合成dna子链的一个组成部分因此所产生出来的新链便具有已发生突变的碱基序列?将待突变的目的基因插入将待突变的目的基因插入m13噬菌体载体上制备单链噬菌体载体上制备单链dna?将合成的寡核酸片段在与单链模板退火在dna聚合酶的作用下合成互补的双链聚合酶的作用下合成互补的双链dna?将双链dna转化大肠杆菌获得突变基因转化大肠杆菌获得突变基因?突变体的筛选
定点突变技术通过寡核苷酸盒式诱变、寡 核苷酸引物介导、重叠延伸介导和大引物诱变 法介导（PCR介导）等途径来实现。盒式突变 是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核 苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列，该 法虽简单易行，但成本较高。寡核苷酸引物介 导是利用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物， 在聚合酶的作用下启动对ＤＮＡ分子的复制， 该方法虽被广泛应用于基因调控、蛋白质功能 与结构之间的相互关系的研究中，但存在突变 效率低的问题；重叠延伸和大引物诱变法介导 的定点突变技术为基因修饰、改造也提供了另 一条方便的途径。但该方法后续工作比较复杂， 且易发生其他突变；
基因定点突变的原理和应用
基因定点突变的原理和应用1. 引言基因定点突变是指基因组中特定位置上的突变事件，它在遗传学研究、分子生物学研究以及生物工程等领域中具有重要的应用。
本文将介绍基因定点突变的原理和应用，并探讨其在科学研究和生物技术领域的潜力。
2. 基因定点突变的原理基因组中的定点突变可以通过多种机制产生，包括点突变、缺失、插入和替换等。
下面将介绍几种常见的基因定点突变的原理。
2.1 点突变点突变是指基因组中发生的单个碱基的改变。
它可以包括碱基替换、碱基插入和碱基缺失等不同类型。
点突变的原因可以是DNA复制时的错误、环境暴露以及基因组重组等。
2.2 缺失和插入缺失和插入是指基因组中发生的多个碱基的改变。
缺失是指某个区域的碱基突然丧失，而插入则是指某个区域多出了一个或多个碱基。
缺失和插入的原因可以是DNA复制过程中的错误、环境暴露以及基因组重组等。
2.3 替换替换是指基因组中的某个碱基被另一个碱基替换的现象。
替换可以是同义替换，即被替换的碱基编码的氨基酸与替代后的碱基编码的氨基酸一致；也可以是非同义替换，即被替换的碱基编码的氨基酸与替代后的碱基编码的氨基酸不同。
替换的原因可以是DNA复制时的错误、环境暴露以及基因组重组等。
3. 基因定点突变的应用基因定点突变在科学研究和生物技术领域有着广泛的应用。
下面将介绍几个常见的应用领域。
3.1 基因功能研究基因定点突变可以用来研究基因的功能。
通过人为地引入特定的突变，可以观察到这些突变如何影响基因的表达或功能，从而揭示基因的作用机制。
这对于理解基因与疾病之间的关系以及探索基因功能具有重要意义。
3.2 遗传疾病研究基因定点突变对于遗传疾病的研究也具有重要意义。
通过研究疾病相关基因的突变情况，可以了解突变对基因功能的影响，进而揭示疾病的发生机制。
这对于预防和治疗遗传疾病具有重要的指导意义。
3.3 基因工程基因定点突变在基因工程中有着广泛的应用。
通过引入特定的突变，可以改变目标基因的功能或表达水平，从而实现对生物体的改造。
基因定点突变的方法
基因定点突变的方法嘿，朋友们！今天咱来聊聊基因定点突变的那些事儿。
你想想看，基因就像是生命的密码本，而基因定点突变呢，就像是给这个密码本做了个精准的修改。
那怎么实现这个神奇的操作呢？一种常见的方法就是 PCR 介导的定点突变啦。
就好像是个厉害的魔法棒，通过巧妙的设计和操作，能在特定的位置让基因发生变化。
比如说，我们想要在某个基因的某个地方加个碱基或者换个碱基，PCR 就能帮我们做到。
这就好比我们要给一件衣服绣上一朵特别的花，PCR 就是那根神奇的绣花针，能准确地在我们想要的地方绣出我们想要的图案。
还有一种方法呢，是利用一些特殊的酶来进行基因编辑。
这些酶就像是一群小巧而精准的工具，能在基因上进行精细的雕琢。
它们能识别特定的序列，然后在那里进行切割和连接，从而实现基因的定点突变。
这就好像是一个经验丰富的工匠，拿着他的专业工具，对一块珍贵的材料进行精心打造。
另外呀，还有基于同源重组的方法呢。
这就像是给基因搭了一座桥，让它可以从原来的样子变成我们想要的新样子。
想象一下，基因本来在一条路上走，通过这座桥，它就可以走到另一条全新的道路上去，多有意思呀！那这些方法有啥用呢？哎呀，用处可大啦！可以帮助我们研究基因的功能呀，就像我们通过给一个机器换个零件来看看它的运行会有啥变化一样。
还可以用来开发新的药物，让药物更加精准地作用于目标。
这不就像是给子弹装上了瞄准镜，能更准确地击中目标嘛！而且哦，基因定点突变在农业领域也能大显身手呢！可以让农作物变得更抗病虫害，产量更高，品质更好。
这不就是给农作物来了一次华丽的升级嘛！总之呢，基因定点突变的方法就像是打开生命奥秘大门的一把钥匙。
通过这些方法，我们可以更深入地了解生命的奥秘，也可以为人类的健康和生活带来更多的好处。
是不是很神奇呀？大家可别小瞧了这些方法，它们可是在默默地推动着科学的进步和人类的发展呢！所以呀，让我们一起好好探索基因定点突变的奇妙世界吧！。
简述定点突变pcr原理
简述定点突变pcr原理亲爱的今天咱们来聊聊定点突变 PCR 这个神奇的玩意儿，保证让你轻轻松松就搞明白它的原理！想象一下，咱们就像是一群超级基因工程师，要对 DNA 这个神秘的密码进行精准改造。
定点突变 PCR 呢，就是咱们手里的神奇魔法棒。
咱们先来说说 DNA 吧，它就像是一个长长的密码串，决定了生物的各种特征。
但有时候，咱们想要让这个密码串发生一点点小变化，来实现咱们的特定目的，这时候定点突变 PCR 就派上用场啦！在这个过程中，咱们得有几个关键的小伙伴。
首先就是咱们的模板 DNA ，这就像是我们要改造的原始蓝图。
然后呢，还有一对特别设计的引物，这俩家伙可是关键中的关键哦！这对引物啊，就像是两个聪明的小向导。
它们可不是随便设计的，而是经过咱们精心谋划的。
它们身上带着咱们想要引入的突变信息。
比如说，咱们想在某个特定的位置把一个碱基换成另一个，这对引物就会在这个位置做出相应的改变。
接下来，PCR 反应就开始啦！就好像是一场热闹的大派对。
在 PCR 反应的锅里，有各种神奇的试剂，模板 DNA 、引物、酶等等都在里面欢快地跳舞。
DNA 会在高温下解开双链，就像是把紧紧抱在一起的双胞胎给分开。
然后，引物就会迅速地找到它们对应的位置，紧紧地贴上去，就像找到了自己的归属。
然后呢，在酶的帮助下，新的 DNA 链就开始合成啦！因为引物带着咱们设计好的突变信息，所以新合成的 DNA 链就会有咱们想要的突变啦！一轮 PCR 反应结束后，咱们就得到了一部分带有突变的 DNA 。
但是别着急，这还不够呢！咱们还要再来几轮，让带有突变的 DNA 越来越多，直到成为咱们的主力军。
经过一轮又一轮的 PCR 反应，最后咱们就能得到大量含有定点突变的 DNA 啦！是不是感觉超级神奇？其实啊，定点突变 PCR 就像是一场精心策划的基因改造大作战。
咱们通过巧妙地设计引物，利用 PCR 反应的强大力量，实现对 DNA 密码的精准修改。
dpn1定点突变原理
dpn1定点突变原理
dpn1定点突变原理是一种基因突变分析方法，用来确定基因序列中的突变位点。
该原理利用特定引物扩增基因序列，并采用基因测序技术对扩增产物进行测序。
在测序过程中，引物中的特定核苷酸位点会发生突变，形成两个不同的碱基。
通过比较突变位点上的碱基组成，可以确定基因序列中的突变。
dpn1定点突变原理可用于分析基因的单碱基多态性（SNP）和小片段内的插入/缺失变异。
该方法能够高效、准确地检测基因突变，并广泛应用于基因突变鉴定、疾病诊断和研究等领域。
该原理的关键是选择合适的引物和测序方法，以确保突变位点上的碱基能够被准确测序。
此外，为了提高检测的特异性和敏感性，还可以结合其他方法，如聚合酶链反应（PCR）、限制性内切酶切割等。
总之，dpn1定点突变原理是一种可靠、高效的基因突变分析方法，对于研究和诊断基因突变具有重要意义。
基因定点突变技术
定点突破旳措施
• 寡核苷酸介导旳基因突变指用具有突变碱基旳寡聚核苷酸
片断作为引物，在聚合酶旳作用下开启DNA分子进行复 制。
• 盒式突变是利用一段人工合成旳含基因突变序列旳寡核
苷酸片段，取代野生型基因中旳相应序列。
• PCR介导旳基因突变
寡核苷酸介导旳定点突变
• 寡聚核苷酸定点诱 变技术是由加拿大 旳生物化学家 ( michael smith )发明 旳.
在分子生物学和基因工程中旳应用
探明未知序列旳构造和功能旳关系，如开启子诱变筛选，真 核旳TATA盒保守序列拟定。 载体构建：调控元件，强开启子，多接头。 研究基因调控序列，如AUG前加入ACC序列最佳。
在蛋白质工程中旳应用
降低毒性，如TNF 变化亚型和种旳特异性，如IFN旳23位AAG（赖氨酸），AGG （精氨酸），使IFN2a变成IFN2b。123位Try（酪）变甘/丝， 使IFN种属特异性明显变化，对人抗病毒活性不大于牛。 提升活性和稳定性，如IFN- βser17（cys变ser） 提升蛋白质作用旳专一性，如IFNβ旳9-56位被IFNa旳7-54位 取代后，活性提升40倍。
• 定点突变技术旳潜在应用领域很广，例如研究蛋白质相互 作用位点旳构造、改造酶旳不同活性或者动力学特征，改 造开启子或者DNA作用元件，引入新旳酶切位点，提升蛋白 旳抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白旳晶体构造，以 及药物研发、基因治疗等等方面。
应用前景
• 不同于定点突变旳是基于PCR旳随机突变，经过变化PCR条件提 升PCR过程中旳随机犯错，这种措施合用于未知旳蛋白质，作全 局性分析，所以有人称为饱和突变（saturation mutagenesis）。 但是这种措施因为没有目旳性，分析操作相当繁琐，而且不会出 现一种位点2个以上碱基突变，因而应用上有不足。定点突变合 用于蛋白构造已经有初步了解旳基因，比PCR随机突变更有目旳 性，也更为精确，简朴，同步改造基因愈加“随心所欲”。因为 定点突变技术在蛋白质组学中有这非常广泛旳应用前景，相信这 个技术在不远旳将来还会有更大旳改善和发展，也必将为更多人 熟悉应用。
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大引物PCR megaprimer PCR
1.用引物P1和含突基因的 引物P2扩增模板DNA产 生双链大引物(PCR1).
2.纯化大引物，去除PCR1 剩下的引物和脱氧核苷酸， 同时加入引物P3，形成带 突变基因的双链DNA
3. 扩增带有突变基因的双 链DNA
三种经典基因定点突变方法比较
1 寡核苷酸引物介导的定点突变法 其优点是保真度比PCR突变法高，经过改进后使该方法突变成功率大大提高 缺点是操作过程环节复杂、周期长， 而且在克隆待突变基因时会受到限制性 酶切位点的限制。
2.通过PCR1和PCR2反应扩增出两种靶基因片 段。
3.用DNA聚合酶补平缺口，形成全长双链 DNA，进行PCR3扩增。
4.最后用引物F2和R2扩增出带有突变位点的 全长DNA片段(PCR4)
重叠PCR小结
优点：几乎没有特殊限制，而且成功率高
缺点： 需要2对引物， 进行3次PCR，并且需要对中间产物进行 纯化
4. 产生野生型、突变型的同源双链分子。可 以用限制性酶切法、 斑点杂交法和生物学法
来初步筛选突变的基因；
5.对突变体DNA基因进行序列分析。
局限性：异源双链DNA分子并非真正异源 突变体子代中突变碱基被错配修复体系修复
提高寡核苷酸介导的基因突变效率方法介绍
这是1985年由 Kunkel等人建立的一种改进的寡核苷酸介导的基因 突变方法。
03
PART 01
第三部分
标题文字内容
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标题内容文字
2014年12月
标题内容文字
2013年5月
标题内容文字
2013年8月
标题内容文字
2014年4月
标题内容文字
2014年5月
标题内容文字
步骤 1.将复制型的M13噬菌体转染到脱氧尿苷酸三磷酸酶和尿嘧啶脱糖 苷酶双缺陷的E.coli (dut-, ung-) 菌株中，使U取代T代入DNA链 中（一般每个重组体20-30个）
2.以此种带U的DNA链为模板，用带突变碱基的寡核苷酸引物进行 复制，产生异源双链。
3. 将此异源双链转化到ung＋(尿嘧啶脱糖苷酶）菌株中生长， 含U 的模板链被破坏， 从而使子代DNA链大部分（～80%）含突变碱基 序列
dut- (脱氧尿苷酸三磷酸酶缺乏) 能够积累尿嘧啶残基.，ung- (尿嘧啶脱糖苷 酶) 使得无法移除尿嘧啶残基
KunKel小结
1.用此种方法产生的突变体优势在于不必利用核苷酸探针标记 来筛选阳性噬菌斑，可直接通过序列分析来确定突变体，这样 就免除了繁杂的杂交程序。
2.此法的成功关键， 是要得到好的含U单链模板DNA（可用含 有目标基因的M13双链DNA载体感染E. coliCJ236品系，此为 大肠杆菌脱氧尿苷酸三磷酸酶和尿嘧啶脱糖苷酶双缺陷 dutung-菌株）
标题内容
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诚信铸就品质
创新引领未来
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2.盒式突变 盒式突变法具有比前两者简单易行、突变效率高等优点， 还可以在一对限制 酶切位点内一次突变多个位点。缺点是合成多条引物的成本较高。另外，在 一般情况下，在靶DNA 片段的两侧往往难以满足存在一对限制性酶切位点的 要求， 限制了该方法的广泛应用。
3.PCR 介导的定点突变法 其优点是操作较简单，突变的成功率可达100％。但它亦有两个缺点：①后 续工作较复杂， PCR扩增产物通常需要连接到载体分子上，然后才能对突变 的基因进行转录、转译等方面的研究 ；② TaqDNA聚合酶的保真性偏低；因 此PCR方法产生的DNA 片段要经过核苷酸序列测定，方可确证有无发生其它 突变。
直接用反应混合物转染
分级退火， 冰浴稳固异 源双链再加T4连接酶
经酚-仿抽提后再进行转染
转染效率： 3个空斑
转染效率：78个空斑
02
盒式突变cassette mutagenesis
1.1985年由Wells J.A提出的一种基因修饰技术
2.为利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，即所谓的 寡核苷酸盒(oligonucleotide cassette)，取代野生型基因中的相应序列。
原理为在正常情况下， 尿嘧啶脱糖苷酶(ung)可以去除掺入DNA中的尿嘧啶 残基。 但在ung-的菌株中，此酶失活。 因此在大肠杆菌脱氧尿苷酸三磷酸酶和尿嘧啶脱糖苷酶双缺陷dut-ung-菌株 中生长的M13噬菌体的DNA中将含有20-30个尿嘧啶残基。 用这些噬菌体感 染ung＋菌株， 尿嘧啶被迅速去除， DNA链遭到破坏， 感染力下降约5个数 量级
3.然而， 并非所有变异区附近都能找到合适的限制位点， 如果不存在 限制位点， 就要用寡核苷酸指导的定位诱变引入限制位点。
02
盒式突变cassette mutagenesis
03
PCR介导的基因突变PCR site-directed mutagenesis
1.重叠延伸PCR法 2.大引物PCR法
提高寡核苷酸介导的基因突变效率方法介绍
Oligo诱导突变的改进方法
1998年由武汉大学叶林柏等人对Oligo 诱导突变的方法进行了改进，2-3个核 苷酸突变替换频率可达80%-85%，及 时需要有道4-5氨基的缺失，突变频率 也高达40%-50%
方法对比
原KunKel
DNA聚合酶和T4连接酶同步加入
方法介绍 1.寡核苷酸介导的基因突变
02 2.盒式突变
3.PCR介导的基因突变 4CRISPR/Cas介导基因突变
寡核苷酸介导的基因突变
寡核苷酸介导的基因突变是由加 拿大人迈克尔·史密斯 Michael Smith在1978所提出，因此而获得 了1993年诺贝尔化学奖。这一方法 被用来在体外对已知的DNA片断内 的核苷酸进行转换、增删的突变。
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重叠延伸PCR法 overlap extension PCR
重叠延伸PCR技术(SOE PCR)是指在PCR技术的基础上，采用具有互补末端的引物 使PCR产物形成了重叠链，通过重叠链的延伸，将不同来源的片段重叠拼接起来的一项 新技术。该技术可以很快获得依靠其它限制性内切酶消化的方法难以得到的产物，其成 功的关键是重叠互补引物的设计。 重叠延伸PCR在基因的定点突变，长片段基因的合 成、基因敲除以及目的基因的扩增有重要的作用。
标题 内容
已完成
未完成
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重昼延伸PCR技术由于使用了具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而 在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来涌的扩增片段重叠拼接起来。 可简 单迅速的将两个DNA一片段连在 起，用于嵌合基因的构建。
重叠延伸PCR法 overlap extension PCR
1.引物对A（正向诱变引物F1和反向引物R1) 和引物对B（正向引物F2和反向诱变引物R2) 退火
方
寡核苷酸介导的基因突变
法 1.将待突变基因插入到突变载体（M13噬菌 体）上，制备含突变基因的单链模板；
2. 将合成的寡核酸片段与单链模板退火， 在 DNA聚合酶，连接酶的作用下合成互补的双 链DNA
3. 将双链DNA转化大肠杆菌， 获得突变基因 （转化大肠杆菌是指将重组DNA分子导入大 肠杆菌受体细胞进行复制,增殖和表达）
基因定点突变技术介绍
临床医学院
谢睿晋
目录
01
相关定义
方法介绍
02
定义 基因定点突变是一种分子生物学方法，用于对基因和任何基 因产品的DNA序列进行具体和有意的改变，包括碱基的添加、 删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的 目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手 段。