卵黄抗体制备及应用

抗鸡球虫卵黄抗体制备及初步应用

作者：钱玮霖指导老师：徐前明

（安徽农业大学植保学院合肥 230061）

摘要：本项目旨在研制抗鸡球虫卵黄抗体，为防治鸡球虫病提供一种新的手段。利用对临床所分离的球虫，经超声波裂解制备粗抗原，然后将所得抗原分别于弗氏完全佐剂和不完全佐剂混合，经肌肉注射方式对鸡蛋进行免疫，收集免疫后的卵黄；采用饱和硫酸铵法分离卵黄中的抗体，并用聚乙二醇浓缩获得较高浓度的抗体；采用凝集试验确定其抗体水平，并采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）方法进行抗体纯度分析；最后将所分离的抗鸡球虫卵黄抗体用于鸡感染球虫保护试验。结果表明：（1）临床所分离得球虫多为混合感染，达3种以上；（2）蛋鸡经免疫后，经凝集试验可证实其抗体水平可达1:28，SDS-PAGE电泳显示：纯化后抗体大小为67.0kD 和23kD，且纯度较高。基于上述情况，认为本试验制备出抗鸡球虫卵黄抗体方法并初步阐明了其抗鸡球虫的基本功能。

关键词：鸡球虫病；卵黄抗体；保护试验

引言

鸡球虫病广泛存在于养鸡业中，常造成大批死亡，其死亡率可最高达80％，且病愈鸡生长严重受阻，抵抗力降低，易继发其他疾病。每年，全世界因为鸡球虫病造成的损失高达数十亿美元[1]。因此，鸡球虫病是养鸡业中危害最严重的疾病之一。在我国，特别是在南方地区，由于气温高、湿度大，这种环境利于球虫卵囊的孢子发育，本病常常呈暴发性流行，危害更加严重。

然而，目前对鸡球虫病的防治措施绝大部分多依赖于药物的预防和治疗上,即化学合成药物和抗生素两大类，自从1936年首次出现专用抗球虫药以来，已报道的抗球虫药达40余种，但是因为球虫对药物极易产生抗药性，大量使用化学药物势必会造成严重的药物残留问题等，这也是当今养禽业所遇到最棘手的问题之一。上述问题存在，为临床防治鸡球虫病提出紧迫任务。

卵黄抗体在禽胚孵化过程中逐渐进入禽胚血液，为刚出壳雏鸡提供被动免疫保护，在雏鸡疾病预防中具有重要作用。这种策略得到良好的运用，如鸡法氏囊卵黄抗体在一定程度上解决了临床治疗该病难题，为生产作出了一定的贡献。

卵黄中的主要成分是蛋白质和脂肪，其比例为1：2。大部分蛋白质都是脂蛋白，存在于卵黄颗粒中，不溶于水，只有卵黄球蛋白(α、β、γ)是水溶性的，而IgY是γ卵黄球蛋白。因此IgY的分离纯化首先需要有效地去除卵黄中的脂类，从水溶性蛋白中分离

IgY[2]。多年来，已建立了许多较为高效而经济的方法，这些方法大多以PEG、硫酸葡聚糖、天然胶，如藻酸钠、角叉聚糖或乙醇沉淀等方法初步纯化蛋白质。工业上大规模生产IgY的方法有：超临界二氧化碳气体抽提法、卡拉胶法、硫酸铵盐析法[3]。

开展抗球虫卵黄抗体的研究对家禽球虫病的预防及治疗具有重要意义：(1)该方法建立，为临床防治鸡球虫病提供新思路和策略，可在一定程度上减少抗生素的使用和减少化

学药物残留问题。(2)这种卵黄抗体具有生物活性的免疫球蛋白，具有效应特异性，在应用于临床预防该病时，不仅可有效激活肠道粘膜免疫，还可诱发其他免疫（体液免疫）。因此，该抗体具有多重效应特点。(3)此外，该抗体可高批量生产，且成本低，有利于规模化生产。

综上所述，本项目开展鸡球虫卵黄抗体制备及其效应的检测，旨在为生产中预防鸡球虫病的发生和降低经济损失提供一种有益的探索。

1.材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器垂直板型电泳槽和直流稳压电源：北京六一电泳仪器厂；离心机：高速离心机；水浴锅；超声粉碎仪

1.1.2 试材烧杯，玻棒，微量注射器（20μl、50μl、200μl、1000μl、2000μl），玻璃板，吸量管；常头滴管，pH试纸，96孔微量板，研钵等

1.1.3动物刚孵出的肉用雏鸡以及成年蛋鸡（肥西县官亭某养鸡场）

1.1.4 试剂丙烯酰胺：购自上海生物有限公司；Tris碱：购自北京天庚生物有限公司；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂：购自Sigma公司；硫酸铵：HCl ； SDS AP ；β-锍基乙醇 0.1%溴酚蓝； TEMED ；甘油；考马斯亮蓝 R250；重络酸钾；双蒸水：自备。

1.1.5 溶液配制

溶液配制：

(1)0.01M pH 7.4 PBS：NaH2PO4·2H2O 0.260g Na2HPO4·12H20 2.17g配制1000ml 调节

pH=7.4

(2) 0.01M Tris-HCL Tris0.605g 配制500ml 1M HCL 调节Ph8.0；

SDS-PAGE电泳溶液配制：

(1)30%分离胶贮液（丙烯酰胺溶液100ml)

(2)分离胶缓冲液（1.5mol/l Tris-HCl缓冲液 pH8.8 ,100ml）

称取Tris 18.17g溶于80ml单蒸水中，用浓盐酸调pH至8.8，蒸馏水定容至100ml.

(3)浓缩胶缓冲液（1.0MOL/LTris-HCl缓冲液 PH6.8,100ml）

称取Tris 12.11g溶于80mldH2O 中，用浓盐酸调pH至6.8，蒸馏水定容至100ml. (4)10%SDS溶液(50ml)

5g SDS加入到40ml单蒸水中，65℃加热使其溶解，用浓盐酸调制pH至7.2，定容至50ml. ( SDS在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解)

(5)10%（AP）

现用现配，称取1g过硫酸铵溶于10ml单蒸水中。

(6)2×SDS上样缓冲液（5ml)

1.0mol/l Tris-HCL(PH6.8) 0.5ml；β-锍基乙醇 0.5ml；10%SDS

2.0ml；0.1%溴酚蓝0.25ml；甘油1mL；蒸水 0.75ml。

(7)电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液）

称取Tris 3.02g, 甘氨酸18.9g, SDS 1.0g, 用无离子水溶解后定容至1L。

(8)考马斯亮蓝脱色液(500ml)