卵黄抗体制备及应用

抗鸡球虫卵黄抗体制备及初步应用作者：钱玮霖指导老师：徐前明（安徽农业大学植保学院合肥 230061）摘要：本项目旨在研制抗鸡球虫卵黄抗体，为防治鸡球虫病提供一种新的手段。

利用对临床所分离的球虫，经超声波裂解制备粗抗原，然后将所得抗原分别于弗氏完全佐剂和不完全佐剂混合，经肌肉注射方式对鸡蛋进行免疫，收集免疫后的卵黄；采用饱和硫酸铵法分离卵黄中的抗体，并用聚乙二醇浓缩获得较高浓度的抗体；采用凝集试验确定其抗体水平，并采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）方法进行抗体纯度分析；最后将所分离的抗鸡球虫卵黄抗体用于鸡感染球虫保护试验。

结果表明：（1）临床所分离得球虫多为混合感染，达3种以上；（2）蛋鸡经免疫后，经凝集试验可证实其抗体水平可达1:28，SDS-PAGE电泳显示：纯化后抗体大小为67.0kD 和23kD，且纯度较高。

基于上述情况，认为本试验制备出抗鸡球虫卵黄抗体方法并初步阐明了其抗鸡球虫的基本功能。

关键词：鸡球虫病；卵黄抗体；保护试验引言鸡球虫病广泛存在于养鸡业中，常造成大批死亡，其死亡率可最高达80％，且病愈鸡生长严重受阻，抵抗力降低，易继发其他疾病。

每年，全世界因为鸡球虫病造成的损失高达数十亿美元[1]。

因此，鸡球虫病是养鸡业中危害最严重的疾病之一。

在我国，特别是在南方地区，由于气温高、湿度大，这种环境利于球虫卵囊的孢子发育，本病常常呈暴发性流行，危害更加严重。

然而，目前对鸡球虫病的防治措施绝大部分多依赖于药物的预防和治疗上,即化学合成药物和抗生素两大类，自从1936年首次出现专用抗球虫药以来，已报道的抗球虫药达40余种，但是因为球虫对药物极易产生抗药性，大量使用化学药物势必会造成严重的药物残留问题等，这也是当今养禽业所遇到最棘手的问题之一。

上述问题存在，为临床防治鸡球虫病提出紧迫任务。

卵黄抗体在禽胚孵化过程中逐渐进入禽胚血液，为刚出壳雏鸡提供被动免疫保护，在雏鸡疾病预防中具有重要作用。

这种策略得到良好的运用，如鸡法氏囊卵黄抗体在一定程度上解决了临床治疗该病难题，为生产作出了一定的贡献。

卵黄中的主要成分是蛋白质和脂肪，其比例为1：2。

大部分蛋白质都是脂蛋白，存在于卵黄颗粒中，不溶于水，只有卵黄球蛋白(α、β、γ)是水溶性的，而IgY是γ卵黄球蛋白。

因此IgY的分离纯化首先需要有效地去除卵黄中的脂类，从水溶性蛋白中分离IgY[2]。

多年来，已建立了许多较为高效而经济的方法，这些方法大多以PEG、硫酸葡聚糖、天然胶，如藻酸钠、角叉聚糖或乙醇沉淀等方法初步纯化蛋白质。

工业上大规模生产IgY的方法有：超临界二氧化碳气体抽提法、卡拉胶法、硫酸铵盐析法[3]。

开展抗球虫卵黄抗体的研究对家禽球虫病的预防及治疗具有重要意义：(1)该方法建立，为临床防治鸡球虫病提供新思路和策略，可在一定程度上减少抗生素的使用和减少化学药物残留问题。

(2)这种卵黄抗体具有生物活性的免疫球蛋白，具有效应特异性，在应用于临床预防该病时，不仅可有效激活肠道粘膜免疫，还可诱发其他免疫（体液免疫）。

因此，该抗体具有多重效应特点。

(3)此外，该抗体可高批量生产，且成本低，有利于规模化生产。

综上所述，本项目开展鸡球虫卵黄抗体制备及其效应的检测，旨在为生产中预防鸡球虫病的发生和降低经济损失提供一种有益的探索。

1.材料与方法1.1 材料1.1.1 仪器垂直板型电泳槽和直流稳压电源：北京六一电泳仪器厂；离心机：高速离心机；水浴锅；超声粉碎仪1.1.2 试材烧杯，玻棒，微量注射器（20μl、50μl、200μl、1000μl、2000μl），玻璃板，吸量管；常头滴管，pH试纸，96孔微量板，研钵等1.1.3动物刚孵出的肉用雏鸡以及成年蛋鸡（肥西县官亭某养鸡场）1.1.4 试剂丙烯酰胺：购自上海生物有限公司；Tris碱：购自北京天庚生物有限公司；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂：购自Sigma公司；硫酸铵：HCl ； SDS AP ；β-锍基乙醇 0.1%溴酚蓝； TEMED ；甘油；考马斯亮蓝 R250；重络酸钾；双蒸水：自备。

1.1.5 溶液配制溶液配制：(1)0.01M pH 7.4 PBS：NaH2PO4·2H2O 0.260g Na2HPO4·12H20 2.17g配制1000ml 调节pH=7.4(2) 0.01M Tris-HCL Tris0.605g 配制500ml 1M HCL 调节Ph8.0；SDS-PAGE电泳溶液配制：(1)30%分离胶贮液（丙烯酰胺溶液100ml)(2)分离胶缓冲液（1.5mol/l Tris-HCl缓冲液 pH8.8 ,100ml）称取Tris 18.17g溶于80ml单蒸水中，用浓盐酸调pH至8.8，蒸馏水定容至100ml.(3)浓缩胶缓冲液（1.0MOL/LTris-HCl缓冲液 PH6.8,100ml）称取Tris 12.11g溶于80mldH2O 中，用浓盐酸调pH至6.8，蒸馏水定容至100ml. (4)10%SDS溶液(50ml)5g SDS加入到40ml单蒸水中，65℃加热使其溶解，用浓盐酸调制pH至7.2，定容至50ml. ( SDS在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解)(5)10%（AP）现用现配，称取1g过硫酸铵溶于10ml单蒸水中。

(6)2×SDS上样缓冲液（5ml)1.0mol/l Tris-HCL(PH6.8) 0.5ml；β-锍基乙醇 0.5ml；10%SDS2.0ml；0.1%溴酚蓝0.25ml；甘油1mL；蒸水 0.75ml。

(7)电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液）称取Tris 3.02g, 甘氨酸18.9g, SDS 1.0g, 用无离子水溶解后定容至1L。

(8)考马斯亮蓝脱色液(500ml)50mL冰乙酸，225mL重蒸水与50mL甲醇混匀、避光保存。

(9)0.25%考马斯亮蓝R250染色液(500ml)考马斯亮蓝脱色液500ml，加入考马斯亮蓝R2501.25g ，充分溶解，避光保存。

1.1.6 虫株混合球虫孢子化卵囊，来自田间动物感动。

1.1.7试验动物新出生雏鸡和蛋鸡，来自合肥肥西县某养鸡场。

1.2方法1.2.1卵囊收集、纯化、增殖（1）卵囊的分离和纯化：刮取发病鸡盲肠粘膜以及病鸡粪便通过过筛后，经饱和食盐漂浮法分离球虫卵囊，具体步骤可参照索勋等方法，不再详述[4]。

然后将卵囊置于2.5%重铬酸钾溶液中进行孢子化。

（2）卵囊的增殖：上述所分离的球虫卵囊接种17日龄雏鸡(无球虫污染的环境饲养)，接种量为8×105个孢子化卵囊/只进行卵囊增殖，给予充足饮食与饮水，逐日观察试验动物状态和粪便情况，于感染7天后收集粪便和肠道中的卵囊。

1.2.2免疫对增殖卵囊进行计数，以每只蛋鸡攻105个卵囊为标准并对卵囊进行超声粉碎，然后将抗原液与弗氏完全佐剂等体积混合制备抗原，进行首免。

二免时用抗原液与弗氏不完全佐剂等体积混合，然后接种动物。

以肌肉多点注射的方式对10只体况相同的蛋鸡进行首次免疫，14天后以相同方式进行加强免疫，在初次免疫7天后连续收集鸡蛋[5]。

1.2.3卵黄抗体分离与纯化采用水稀释硫酸铵盐析法分离相关抗体，并用PEG进一步提纯。

（1）分离蛋黄液取鸡蛋，打一小孔，流出蛋清；从小孔内加入无菌水，重复3次；将蛋黄在滤纸上滚动；刺破蛋黄膜，收集蛋黄液。

（2）水溶稀释法粗提抗体用1:9 倍的蒸馏水稀释卵黄, 利用0.1% 的盐酸调节蒸馏水pH 至5.0-5.4, 搅拌15 min, 置4 ℃过夜后脂蛋白自然沉淀,以10000 r/min, 4 ℃离心25 min 去除脂类, 收集上清液即可。

（3）硫酸铵两步法盐析纯化用水稀释法粗提卵黄获得水溶性成分200ml, 加入等体积200mlPBS( pH7.4) 稀释, 再入饱和硫酸铵400ml ,使硫酸铵浓度为50%, 4 ℃度静置30min以上, 9000 r/min 离心15min, 弃上清。

再用200mlPBS 溶解沉淀，离心去除不溶物，取上清液加入100ml饱和硫酸铵至33% 饱和度， 4 ℃静置30min以上， 9000 r/min 离心15min, 取沉淀。

如此重复2 ~ 3 次，可获较纯的IgY。

（4）PEG透析纯化将IgY溶解液灌入透析袋中，两端封口放入PEG-20000中透析，得到高浓度的IgY。

（5）SDS-PAGE方法鉴定分离的抗体[6]（a）分离胶制备：按表1配制20ml 12%分离胶，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约8cm高，用1ml注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约3—4mm高，以进行水封。

约30min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。

倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。

（b）浓缩胶的制备：按表2配制10ml 5%浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，避免带入气泡。

再静置30min，待凝胶凝固，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将pH=8.3 Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约0.5cm以上，即可准备加样。

表1 12%分离胶（5ml)配制方案Tab 1 Formula of 12% separation gel溶液体积（ml）40%Acr-Bis 1.51.5mol/L Tris-HCL （pH8.9) 1.2510%SDS 0.05TEMED 0.002去离子水 2.1510%过硫酸铵0.05表2 5%浓缩胶（3ml)配制方案Tab 2 Formula of 5% concentration gel溶液体积（ml）40%Acr-Bis 0.3751.5mol/l Tris-HCL（pH6.8) 0.3810%SDS 0.03TEMED 0.003去离子水 2.22510%过硫酸铵0.03（c）样品处理及加样各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓度为0.5～1mg/mL，沸水浴加热3min，冷却至室温备用。

处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴中加热1min，以消除亚稳态聚合。

一般加样体积为15μL（即2－10μg蛋白质）。

如样品较稀，可增加加样体积。

用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。

（d）电泳将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电压调至50V。

待样品进入分离较时，将电压调至90V。

当蓝色染料迁移至底部时，将电压调回到零，关闭电源。

拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。