海洋污染论文保护海洋环境论文
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将 JYX 201 菌株接种在海水 PDA 固体培养基 上, 在 25 ∀ 培养 7 d, 收集分生孢子, 过滤除去菌体, 混悬在 30 mL 无菌水中, 得到孢子悬浮液, 调整浓 度为 106 个/ mL 。采用凹玻片悬滴法[ 11] , 将 菌株的 孢子悬浮液接种在含不同元素离子浓度的沙氏培养 液中, 以未加金属元素的同种培养基作为空白对照 ( CK) , 观察孢子生长和菌丝形态变化。以孢子芽管 菌丝长度超过孢子长度的 1/ 2 作为萌发标准, 统计 萌发孢子数量, 计算真菌孢子萌发率, 对实验数据采 用 SPSS 进行方差分析, 采用 Duncan 的多重比较法 来分析不同元素离子浓度对菌株孢子萌发的差异显 著程度。 2. 5 菌落生长变化测定
菌株 JYX 201 的 IT S 序列在 GenBank 经同源
5 期 白树猛等: 半知菌 JY X 201 菌株( P enicil lium g r is eof ulv um) 对海洋 污染重金属反应的研究
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性检索结果显示( 登录号 EU 888291) 。该菌与 Pen i ci ll i um gr i seof ul v um , P eni ci ll i um gl andicol a, P eni ci l li um chr y sogenum 等种的同源性最高, 相似 率达到 99% 。挑 取 10 个菌株 的 IT S 序列与 菌株 JYX 201 采用邻接法( neig hbor joining) 构建系统发 育树( 图 1) 。从图 1 看出, 菌株 JYX 201 与 Peni ci lli um griseof ul vum( 登录号 DQ339557) 关系最近。结合 生物学特性及 IT S 序列分析, 确认菌株 JYX 201 属于 灰黄青霉( Penicill ium gri seof ul vum) 。
图 1 菌株 JYX 201 系统发育树
3. 2 不同浓度的重金属离子对孢子萌发的影响 3. 2. 1 Cu2+ 对孢子萌发的影响
JYX 201 菌株在未加金属元素的空白对照沙氏 培养液中培养 12 h, 87% 以上的孢子都可萌发, 加 入不同浓度 Cu2+ 在一定的时间内会对萌发起抑制 作用, 当 Cu2+ 浓度为 25 mg / dm 3 时, 萌发基本与对 照的相似, 随着 Cu2+ 浓度上升, 孢子萌发率逐渐下 降( 图 2) 。当 Cu2+ 浓度为 100 mg/ dm3 时, 12 h 时 孢子萌发率降低为 21% , Cu2+ 浓度增加到125 m g/ dm3 孢子萌发完全受到抑制。
了研究, 结果表明, 一定量的重金属铜、锌离子对菌株产生显著的影响, 并通过形态与色素变化的方
式表现出来。当培养基中 Cu2+ 浓度为 125 mg/ dm3 , Zn2+ 浓度为 800 mg/ dm3 时, 孢子萌发会完全
受到抑制, 同时菌丝也发生严重变异。菌株色素随着 Cu2+ 浓度的增加呈现从灰绿色到浅黄色的颜
取少量海水 PDA 固体培养基滴加在灭菌载玻 片上, 将 JYX 201 菌株接种在培养基表面, 在 25 ∀ 培养 4 d 后, 放置于显微镜上, 观察菌株自然生长的 立体结构, 并刮取少量菌落, 放置于载玻片上, 用常 规方法观察菌株产孢结构。 2. 3. 2 IT S 序列测试与系统发育树建立
菌株金属硫蛋白活性的测定方法见文献[ 14] 。
3 结果
3. 1 菌株形态和系统发育学鉴定结果 菌株在海水 PDA 固体培养基培养 4 d 后, 菌落
呈灰绿色, 绒毛状, 局限生长, 培养基背面呈褐色。 在显微镜下观察, 分生孢子梗顶端排列成帚状间枝, 分生孢子呈浅灰褐色, 球形或卵圆形, 在分生孢子梗 上排列成念珠状。
核微生物与高等生物更接近, 通过它们推测污染对 高等真核生物的影响更准确[ 2- 3] 。半知菌门真菌是 一类较特殊的真菌, 这类真菌适应性强, 繁殖快, 是 海洋环境中分布最广的真菌类型。半知菌的形态和 色素很丰富, 周围环境的变化会引起其形态和色素 变化。金属硫蛋白( m et allot hionein, M T ) , 是一类 普遍存在于生物体内的低分子 量可诱导型非 酶蛋
色变化, 随着 Zn2+ 浓度的增加呈现从灰绿色到白色的颜色变化。在菌株生长的离子浓度范围内,
一定量的 Cu2+ 浓度能提高 CA T , G O D 酶的活性作用, 在 Cu2+ 浓度为 25 m g/ dm3 时活性作用最
强; 在25~ 75 m g/ dm3时, 随着 Cu2+ 浓度的增加, 活性作用逐渐减弱, 浓度增加至 100 mg / dm 3时菌
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白, 该蛋白在转录水平上易被环境中的重金属所诱 导, 而且这种诱导与重金属浓度具有相关性, 可以反 映环境中的重金属浓度水平, 是公认的评价重金属 污染状况的关键性生物标志物。污染重金属的胁迫 作用也 会 引 起其 防 御系 统 的 变化。过 氧 化氢 酶 ( CAT ) 与葡萄糖氧化酶( GOD) 是最直接的反应指 标[ 6- 7] 。课题组从青岛胶州湾污染较重的李村河入 海口、海泊河入海口沉积物样品分离半知菌的优势 种, 并根据菌株对重金属元素( Cu, Zn, H g ) 的反应, 筛选获得 1 株 JYX 201 菌株, 分别对菌株在重金属 胁迫下的生长、色素及 CAT , GOD 酶活变化进行了 研究, 以证明该菌株作为污染指示菌株的可能性。
( 1. 国家海洋局 第一海洋研究所, 山东 青岛 266061; 2. 青岛科技大学 生物系, 山东 青岛 266042)
摘要: 从胶州湾污染区域的沉积物样品中筛选获得 1 株对重金属元素反应敏感的菌株, 经鉴定为灰
黄青霉( Peni ci ll ium gr iseof ul vum) , 对该菌株在重金属胁迫下的生物学特征及酶的活性变化进行
利用 SPSS15. 0 软件对离子浓度和培养时间作 方差分析, Cu2+ 离子浓度和培养时间的 F 值分别为 7 551 和 61. 982, 出 现概率 均小 于极 显著 性水 平 0 05, 具有统计学意义, 说明 Cu2+ 离子浓度和培养 时间都对孢子萌发起到显著的影响作用。
采用 Duncan 的多重比较法分析 Cu2+ 浓度对孢 子萌发的影响, 结果见表 1, Subset 值越大, 表明孢 子萌发的效果越好。对照 Subset 值最大, 孢子的萌 发效果最好, 添加的 Cu2+ 浓度越大, Subset 值越小, 孢子萌发的效果越差。
第 32 卷 第 5 期 2010 年 9 月
海洋学报
ACT A OCEANOLOGICA SIN ICA
Vo l 32, N o 5 Spetember 2010
半知菌 JYX 201 菌株( Penicillium griseof ulvum) 对海洋污染重金属反应的研究
白树猛1, 2 , 田黎1, 2* , 史振平2 , 张久明2 , 姜会超2
关键词: 近海重金属污染; 指示半知菌; 生物学变化
中图分类百度文库: Q959
文献标志码: A
文章编号: 0253 4193( 2010) 05 0127 08
1 引言
保护近岸海洋环境与防治污染是国家 十一五 重大规划。海洋污染元素众多, 其中以重金属对生 物的影响较明显, 重金属元素通过破坏细胞膜或抑 制细胞分裂导致生物生长出现异常甚至死亡, 重金 属在海洋环境中沿生物链放大, 最终累积在人类食 品中, 对人类身体健康产生较大的潜在危害而倍受 关注。目前已建立理化监测方法, 它能够较精确地 反映重金属含量[ 1] , 但不能确切反映污染物对环境 尤其对生物的综合效应, 而生物监测则直接把污染 物与它们的毒性联系起来, 其中指示生物法是较成 熟、有效的生物监测方法。其原理是通过指示生物
的生物学特性和生理生化变化来反映海洋污染的程 度[ 2- 3] 。在已报道的指示生物中, 微生物以 取样方 便、反应灵敏、研究周期短、成本低等优势受到重视。 在近年来国内外开展的研究中, 以原核微生物发光 细菌和大肠杆菌作指示生物的研究较多见[ 4] , 而以 真核微生物真菌作指示生物的研究鲜见报道[ 5] 。真
对菌株 JY X 201 采用玻璃珠法[ 9] 提取基因组 DNA, 并采用真菌核糖体内转录间隔区 IT S 序列通
海洋学报 32 卷
用引物 IT S1/ IT S4 进行 P CR 扩增, 由上海博 尚生 物技术有限公司完成测序工作, 将该菌的 IT S 序列 在 N CBI 网站( ht t p: / / w w w . ncbi. nlm . nih. gov) 上 进行同源性比 较( BL A ST ) , 采用邻 接法[ 10] 构 建其 与相关菌株的 IT S 序列系统发育树。 2. 4 菌株孢子萌发测定
海水 P DA 培养基、改良的沙氏培养基[ 8] 用于半 知菌的培养与检测。 2. 3 菌株选择与鉴定
从上述 2 个河口及对照区海域 17 个采样点的 海洋沉积物样品中分离得到 120 余株半知菌菌株, 先选出分布率占 80% 以上的 8 株菌株作为优势种, 根据色素情况选出的 4 株分别为产黄色素的 JSX 101, 产黑色素的 JSX 301, 产青绿色素的 JSX 302, 产灰绿色素的 JYX 201。根据这 4 株菌株对重金属 元素( Cu, Zn, H g ) 的反应, 筛选获得 1 株对 Cu2+ , Zn2+ 反应较敏感的 JY X 201 菌株, 采用形态与分子 生物学方法鉴定其种类。 2. 3. 1 生物学特性
丝不能生长。Cu2+ 对菌体金属硫蛋白的影响不规则。在 Zn2+ 浓度为 100~ 400 mg/ dm3 的培养基
中, CA T , G OD 酶 和 金属 硫蛋 白的 活性 作用 随 着 Zn2+ 浓 度的 增 加逐 渐 增强, 在 Zn2+ 浓 度 为
400 m g/ dm3时酶和金属硫蛋白活性达到最强。Z n2+ 浓度增加至 600 mg/ dm3 时, 菌株不能生长。
收稿日期: 2009 12 25; 修订日期: 2010 03 12。 基金项 目: 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 40776098; 40976104 ) ; 国 家 高 技 术 研 究 发 展 计 划 ( 八 六 三 计 划 ) ( 2007AA09Z435; 2007AA091507; 2008A A 09Z407) 。 作者简介: 白树猛( 1983 ! ) , 男, 山东省泰安市人, 硕士研究生, 从事海洋微生物研究。E mail: * 通信作者: 田黎。E mail: w shw 8@ yah oo. com. cn
在含不同元素离子浓度的改良的沙氏固体培养 基的平板上分别接入 JYX 201 孢子液 30 L , 用玻 璃涂布器涂抹均匀, 在 25 ∀ 培养 4 d, 观察菌落生长 速度变化和菌落颜色变化。 2. 6 菌株防御酶活性测试
将菌株 JYX 201 斜面菌种接入海水 P DA 液体 培养基中, 在 25 ∀ 以 150 r/ m in 离心培养 24 h; 按 10% 接种量接入灭菌后含不同浓度的元素离子的海 水 PDA 液体培 养基中, 以未加 金属元素的同 种培 养基作为空白对照( CK) , 在同样条件下 培养 48 h 后过滤收集菌体, 将菌体研磨破壁, 以 4 000 r/ m in 离心 10 m in, 取上清液供酶活测试。对葡萄糖氧化 酶( G O D) 的活性采用 2, 4 二氯苯酚氧化法测定[ 12] , 对过氧化氢酶( CA T ) 采用紫外分光光度法测定[ 13] 。
2 材料与方法
2. 1 重金属元素离子浓度 根据青岛胶州湾污染较重的李村河入海口、海
泊河入海口沉积物金属元素( Cu, Z n, H g) 的平均 浓度, 设定金 属元素离 子的浓度。Cu2+ 浓度为 0, 25, 50, 75, 100, 125 mg / dm3 ; Z n2+ 的浓度为 0, 100, 200, 400, 600, 800 mg / dm 3 ; H g2+ 的浓度为 0, 0. 5, 1, 2, 3, 4 m g/ dm3。 2. 2 培养基
菌株 JYX 201 的 IT S 序列在 GenBank 经同源
5 期 白树猛等: 半知菌 JY X 201 菌株( P enicil lium g r is eof ulv um) 对海洋 污染重金属反应的研究
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性检索结果显示( 登录号 EU 888291) 。该菌与 Pen i ci ll i um gr i seof ul v um , P eni ci ll i um gl andicol a, P eni ci l li um chr y sogenum 等种的同源性最高, 相似 率达到 99% 。挑 取 10 个菌株 的 IT S 序列与 菌株 JYX 201 采用邻接法( neig hbor joining) 构建系统发 育树( 图 1) 。从图 1 看出, 菌株 JYX 201 与 Peni ci lli um griseof ul vum( 登录号 DQ339557) 关系最近。结合 生物学特性及 IT S 序列分析, 确认菌株 JYX 201 属于 灰黄青霉( Penicill ium gri seof ul vum) 。
图 1 菌株 JYX 201 系统发育树
3. 2 不同浓度的重金属离子对孢子萌发的影响 3. 2. 1 Cu2+ 对孢子萌发的影响
JYX 201 菌株在未加金属元素的空白对照沙氏 培养液中培养 12 h, 87% 以上的孢子都可萌发, 加 入不同浓度 Cu2+ 在一定的时间内会对萌发起抑制 作用, 当 Cu2+ 浓度为 25 mg / dm 3 时, 萌发基本与对 照的相似, 随着 Cu2+ 浓度上升, 孢子萌发率逐渐下 降( 图 2) 。当 Cu2+ 浓度为 100 mg/ dm3 时, 12 h 时 孢子萌发率降低为 21% , Cu2+ 浓度增加到125 m g/ dm3 孢子萌发完全受到抑制。
了研究, 结果表明, 一定量的重金属铜、锌离子对菌株产生显著的影响, 并通过形态与色素变化的方
式表现出来。当培养基中 Cu2+ 浓度为 125 mg/ dm3 , Zn2+ 浓度为 800 mg/ dm3 时, 孢子萌发会完全
受到抑制, 同时菌丝也发生严重变异。菌株色素随着 Cu2+ 浓度的增加呈现从灰绿色到浅黄色的颜
取少量海水 PDA 固体培养基滴加在灭菌载玻 片上, 将 JYX 201 菌株接种在培养基表面, 在 25 ∀ 培养 4 d 后, 放置于显微镜上, 观察菌株自然生长的 立体结构, 并刮取少量菌落, 放置于载玻片上, 用常 规方法观察菌株产孢结构。 2. 3. 2 IT S 序列测试与系统发育树建立
菌株金属硫蛋白活性的测定方法见文献[ 14] 。
3 结果
3. 1 菌株形态和系统发育学鉴定结果 菌株在海水 PDA 固体培养基培养 4 d 后, 菌落
呈灰绿色, 绒毛状, 局限生长, 培养基背面呈褐色。 在显微镜下观察, 分生孢子梗顶端排列成帚状间枝, 分生孢子呈浅灰褐色, 球形或卵圆形, 在分生孢子梗 上排列成念珠状。
核微生物与高等生物更接近, 通过它们推测污染对 高等真核生物的影响更准确[ 2- 3] 。半知菌门真菌是 一类较特殊的真菌, 这类真菌适应性强, 繁殖快, 是 海洋环境中分布最广的真菌类型。半知菌的形态和 色素很丰富, 周围环境的变化会引起其形态和色素 变化。金属硫蛋白( m et allot hionein, M T ) , 是一类 普遍存在于生物体内的低分子 量可诱导型非 酶蛋
色变化, 随着 Zn2+ 浓度的增加呈现从灰绿色到白色的颜色变化。在菌株生长的离子浓度范围内,
一定量的 Cu2+ 浓度能提高 CA T , G O D 酶的活性作用, 在 Cu2+ 浓度为 25 m g/ dm3 时活性作用最
强; 在25~ 75 m g/ dm3时, 随着 Cu2+ 浓度的增加, 活性作用逐渐减弱, 浓度增加至 100 mg / dm 3时菌
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白, 该蛋白在转录水平上易被环境中的重金属所诱 导, 而且这种诱导与重金属浓度具有相关性, 可以反 映环境中的重金属浓度水平, 是公认的评价重金属 污染状况的关键性生物标志物。污染重金属的胁迫 作用也 会 引 起其 防 御系 统 的 变化。过 氧 化氢 酶 ( CAT ) 与葡萄糖氧化酶( GOD) 是最直接的反应指 标[ 6- 7] 。课题组从青岛胶州湾污染较重的李村河入 海口、海泊河入海口沉积物样品分离半知菌的优势 种, 并根据菌株对重金属元素( Cu, Zn, H g ) 的反应, 筛选获得 1 株 JYX 201 菌株, 分别对菌株在重金属 胁迫下的生长、色素及 CAT , GOD 酶活变化进行了 研究, 以证明该菌株作为污染指示菌株的可能性。
( 1. 国家海洋局 第一海洋研究所, 山东 青岛 266061; 2. 青岛科技大学 生物系, 山东 青岛 266042)
摘要: 从胶州湾污染区域的沉积物样品中筛选获得 1 株对重金属元素反应敏感的菌株, 经鉴定为灰
黄青霉( Peni ci ll ium gr iseof ul vum) , 对该菌株在重金属胁迫下的生物学特征及酶的活性变化进行
利用 SPSS15. 0 软件对离子浓度和培养时间作 方差分析, Cu2+ 离子浓度和培养时间的 F 值分别为 7 551 和 61. 982, 出 现概率 均小 于极 显著 性水 平 0 05, 具有统计学意义, 说明 Cu2+ 离子浓度和培养 时间都对孢子萌发起到显著的影响作用。
采用 Duncan 的多重比较法分析 Cu2+ 浓度对孢 子萌发的影响, 结果见表 1, Subset 值越大, 表明孢 子萌发的效果越好。对照 Subset 值最大, 孢子的萌 发效果最好, 添加的 Cu2+ 浓度越大, Subset 值越小, 孢子萌发的效果越差。
第 32 卷 第 5 期 2010 年 9 月
海洋学报
ACT A OCEANOLOGICA SIN ICA
Vo l 32, N o 5 Spetember 2010
半知菌 JYX 201 菌株( Penicillium griseof ulvum) 对海洋污染重金属反应的研究
白树猛1, 2 , 田黎1, 2* , 史振平2 , 张久明2 , 姜会超2
关键词: 近海重金属污染; 指示半知菌; 生物学变化
中图分类百度文库: Q959
文献标志码: A
文章编号: 0253 4193( 2010) 05 0127 08
1 引言
保护近岸海洋环境与防治污染是国家 十一五 重大规划。海洋污染元素众多, 其中以重金属对生 物的影响较明显, 重金属元素通过破坏细胞膜或抑 制细胞分裂导致生物生长出现异常甚至死亡, 重金 属在海洋环境中沿生物链放大, 最终累积在人类食 品中, 对人类身体健康产生较大的潜在危害而倍受 关注。目前已建立理化监测方法, 它能够较精确地 反映重金属含量[ 1] , 但不能确切反映污染物对环境 尤其对生物的综合效应, 而生物监测则直接把污染 物与它们的毒性联系起来, 其中指示生物法是较成 熟、有效的生物监测方法。其原理是通过指示生物
的生物学特性和生理生化变化来反映海洋污染的程 度[ 2- 3] 。在已报道的指示生物中, 微生物以 取样方 便、反应灵敏、研究周期短、成本低等优势受到重视。 在近年来国内外开展的研究中, 以原核微生物发光 细菌和大肠杆菌作指示生物的研究较多见[ 4] , 而以 真核微生物真菌作指示生物的研究鲜见报道[ 5] 。真
对菌株 JY X 201 采用玻璃珠法[ 9] 提取基因组 DNA, 并采用真菌核糖体内转录间隔区 IT S 序列通
海洋学报 32 卷
用引物 IT S1/ IT S4 进行 P CR 扩增, 由上海博 尚生 物技术有限公司完成测序工作, 将该菌的 IT S 序列 在 N CBI 网站( ht t p: / / w w w . ncbi. nlm . nih. gov) 上 进行同源性比 较( BL A ST ) , 采用邻 接法[ 10] 构 建其 与相关菌株的 IT S 序列系统发育树。 2. 4 菌株孢子萌发测定
海水 P DA 培养基、改良的沙氏培养基[ 8] 用于半 知菌的培养与检测。 2. 3 菌株选择与鉴定
从上述 2 个河口及对照区海域 17 个采样点的 海洋沉积物样品中分离得到 120 余株半知菌菌株, 先选出分布率占 80% 以上的 8 株菌株作为优势种, 根据色素情况选出的 4 株分别为产黄色素的 JSX 101, 产黑色素的 JSX 301, 产青绿色素的 JSX 302, 产灰绿色素的 JYX 201。根据这 4 株菌株对重金属 元素( Cu, Zn, H g ) 的反应, 筛选获得 1 株对 Cu2+ , Zn2+ 反应较敏感的 JY X 201 菌株, 采用形态与分子 生物学方法鉴定其种类。 2. 3. 1 生物学特性
丝不能生长。Cu2+ 对菌体金属硫蛋白的影响不规则。在 Zn2+ 浓度为 100~ 400 mg/ dm3 的培养基
中, CA T , G OD 酶 和 金属 硫蛋 白的 活性 作用 随 着 Zn2+ 浓 度的 增 加逐 渐 增强, 在 Zn2+ 浓 度 为
400 m g/ dm3时酶和金属硫蛋白活性达到最强。Z n2+ 浓度增加至 600 mg/ dm3 时, 菌株不能生长。
收稿日期: 2009 12 25; 修订日期: 2010 03 12。 基金项 目: 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 40776098; 40976104 ) ; 国 家 高 技 术 研 究 发 展 计 划 ( 八 六 三 计 划 ) ( 2007AA09Z435; 2007AA091507; 2008A A 09Z407) 。 作者简介: 白树猛( 1983 ! ) , 男, 山东省泰安市人, 硕士研究生, 从事海洋微生物研究。E mail: * 通信作者: 田黎。E mail: w shw 8@ yah oo. com. cn
在含不同元素离子浓度的改良的沙氏固体培养 基的平板上分别接入 JYX 201 孢子液 30 L , 用玻 璃涂布器涂抹均匀, 在 25 ∀ 培养 4 d, 观察菌落生长 速度变化和菌落颜色变化。 2. 6 菌株防御酶活性测试
将菌株 JYX 201 斜面菌种接入海水 P DA 液体 培养基中, 在 25 ∀ 以 150 r/ m in 离心培养 24 h; 按 10% 接种量接入灭菌后含不同浓度的元素离子的海 水 PDA 液体培 养基中, 以未加 金属元素的同 种培 养基作为空白对照( CK) , 在同样条件下 培养 48 h 后过滤收集菌体, 将菌体研磨破壁, 以 4 000 r/ m in 离心 10 m in, 取上清液供酶活测试。对葡萄糖氧化 酶( G O D) 的活性采用 2, 4 二氯苯酚氧化法测定[ 12] , 对过氧化氢酶( CA T ) 采用紫外分光光度法测定[ 13] 。
2 材料与方法
2. 1 重金属元素离子浓度 根据青岛胶州湾污染较重的李村河入海口、海
泊河入海口沉积物金属元素( Cu, Z n, H g) 的平均 浓度, 设定金 属元素离 子的浓度。Cu2+ 浓度为 0, 25, 50, 75, 100, 125 mg / dm3 ; Z n2+ 的浓度为 0, 100, 200, 400, 600, 800 mg / dm 3 ; H g2+ 的浓度为 0, 0. 5, 1, 2, 3, 4 m g/ dm3。 2. 2 培养基